Introduction
Traumatisk hjärnskada (TBI) definieras som en förändring i hjärnans funktion, eller andra tecken på hjärnpatologi, som orsakas av en yttre kraft 1. Tbis förblir ett allvarligt hälsoproblem i hela världen, särskilt i USA. Enligt Centers for Disease Control and Prevention, minst 1,7 miljoner Tbis inträffar årligen i USA resulterade i 30,5% av alla skaderelaterade dödsfall. År 2000 de direkta sjukvårdskostnader och indirekta kostnader för Tbis uppgick uppskattningsvis $ 76500000000 i USA ensamt. Även om tekniska och terapeutiska framsteg i föregående decennierna har förbättrat kvaliteten och livslängden för dem som lider Tbis, finns för närvarande ingen effektiv läkemedels eller förebyggande behandlingar. På grund av komplexiteten och vittgående effekter Tbis, inklusive vävnadsskada, celldöd och axonet degeneration, inte två skador är identiska; alltså, ingen ström TBI modell för djur korrekt återgeralla aspekter av TBI som ses hos människa. Däremot har djurmodeller ger möjlighet att producera nästan identiska skador som är nödvändiga för att undersöka olika effekter av TBI med hopp om att ytterligare förstå de kliniska manifestationer av Tbis.
Den kontrollerade kortikal påverkan (CCI) modellen använder en effekt system för att leverera fysisk påverkan på den exponerade dura av ett djur. Det leder Tbis varierar från lätt till svår liknande dem som upplevs av människor. Denna skada var första kännetecknas av illern 2 och anpassades senare för att användas i råtta 3,4, mus 5-7, och får 8. Sedan den första karakteriseringen har platsen för skadan placerats både över mittlinjen 2,9 och den laterala cortex 10. CCI är ett enkelt och exakt sätt att undersöka effekterna och potentiella behandlingar för Tbis.
Förutom den CCI-modellen, den fluid slagverk och vikt droppe modeller är commonly används för att producera Tbis. Dessa modeller nuvarande begränsningar, bland annat mindre kontroll över skadeparametrar, som producerar histopathalogical förändringar som inte setts i human Tbis och ökad förekomst av oavsiktlig död i möss 3,5,10. Den tryckvåg Modellen används också för att producera Tbis. Även tryckvågen från explosionen modellen inte återge histopathalogical förändringar som ses efter en mekanisk påverkan, denna modell exakt producera Tbis upplevs särskilt av militär personal 11. Den kontrollerade kortikal påverkan modell är lätt att kontrollera på grund av exakt kontroll över deformations-parametrar såsom tid, hastighet och djup av inverkan 5. Sådan noggrannhet gör replikera nästan identiska skador i en hel grupp av djur mer genomförbart. Viktigast CCI återger Tbis med funktioner som ses i mänsklig Tbis 12. Det finns dock ingen enskild djurmodell som är helt lyckat att reproducera hela spektrat av patologisk chanGES observerats efter TBI. Ytterligare forskning behövs för att fullständigt avslöja de akuta och kroniska förändringar som sker efter TBI.
Två typer av skador uppstår efter en TBI: primära och sekundära skador. Den primära skadan inträffar vid nedslaget och är inte känslig för terapeutiska behandlingar; Men de sekundära skador som kvarstår efter den initiala skadan är föremål för behandling 13. Den kontrollerade kortikal påverkan modellen producerar den primära skadan, vilket gör det möjligt för forskare att undersöka effekterna av TBI och potentiella terapeutiska behandlingar för potentiellt långvariga effekter av sekundära skador. Områden med potentiellt forskning med CCI-modellen inkluderar neuronal död, hjärnödem, neurogenes, vaskulära effekter, histopathalogical förändringar, och minnesunderskott och mer 3,13-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurvård
Manliga C57 BL / 6 möss hålls i grupp och förvaras i en 12/12 tim ljus / mörker-cykel med fri tillgång till mat och vatten efter behag. De djur som används i detta protokoll var 10-12 veckor gamla. Alla procedurer utfördes under protokoll som godkänts av Indiana University Animal Care och användning kommittén.
1. Kirurgisk förberedelse
- Bedöva musen genom att använda en ketamin / xylazin-blandning (87,7 mg / ml ketamin och 12,3 mg / ml xylazin) och administrera (1 ml / kg) via IP-injektion.
- Raka huvudet av musen mellan öronen.
- Applicera en petroleumbaserad gelé för ögonen på musen för att förhindra uttorkning under operation.
- Rengör rakade området med 10% jod. Använd sedan 70% etanol för att rensa bort jod.
- Fäst musen huvudet i den stereotaktiska ramen med hjälp av örat barer och bita platta. Se till hjärnan är stabil.
2. Craniectomy
3. Impac
Systemet påverkan inkluderar en kontrollrutan för att ställa effektparametrarna, ett ställdon för att utföra impaktion, och en stereotaktisk ram för att säkra handlinguator och mus chef för påverkan.
- Förinställd hastigheten hos manövreringsorganet till 3 m / sek, för kirurgi.
- Förinställd olika deformation djup för att framkalla olika skadesvårighetsgrader. Deformation djup 0,0-0,2 mm, 0,5-1,0 mm och 1,2-2,0 mm skulle resultera i mild, måttlig och svår Tbis, respektive. Detta protokoll förklarade hur man ska uppnå en måttligt svår hjärnskada med en deformation djup av 1 mm med en hastighet av 3 m / sek.
- Fäst sprutan hållaren i den stereotaktiska ramen och använda micromanipulators flytta den för att säkra den runda, platta spets ställdonet (3 mm i diameter) i mitten av den öppna skallen området. Justera sedan spetsen i en vinkel parallell med ytan av slagstället.
- Upprätta nollpunkten genom att flytta ned ställdonet i förlängning modellen tills spetsen vidrör ytan på nedslagsplatsen. Ställ därefter in Z-kanal på stereotaktisk kontrollpanel till noll.
- Dra provkroppen spetsensamtidigt flyttar ställdonet ner 1 mm.
- Tryck på knappen effekten att slå skada plats och uppnå en deformation djup av 1 mm.
4. Skada Site Stängning
- Använd bomullspinne applikatorer för att ta bort eventuella blod efter effekt, men inte röra skadeområdet.
- Placera musen på en varm dyna för att bibehålla kroppstemperaturen.
- När blödningen har stoppats, sy såret stängd. Sätt djuret tillbaka in i ren bur och låta den återhämta sig från operationen över natten på den varma plattan.
- Administrera Buprenorfin 0,05-0,10 mg / kg SQ varje 8-12 h under två dagar efter kirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kontrollerade kortikal påverkan modellen producerar Tbis varierar i svårighetsgrad från mild till svår. Efter effekt mängden kranial svullnad, blödning, och kranial distorsion vid nedslagsplatsen kommer att avslöja skadan svårighetsgrad följer av hastighet och deformation djupparametrar. Milda Tbis resultera i kranial svullnad på platsen påverkan och lätt blödning på grund av den begränsade dura brott. En måttlig TBI uppvisar kranial svullnad och ökad blödning på grund av dura brott vid impaktion (Figur 1). Skillnaden mellan en måttlig och svår TBI kan vara svårt att skilja tills visualiseras på fasta vävnader med hjälp av ett mikroskop (Figur 2); kan dock en svår TBI ibland visa förstärkt distorsion och kranial svullnad efter påverkan. CCI-modellen kan användas för att bestämma effekterna av flera aspekter av Tbis, inklusive vävnad deformation (figur 2), neuronal död, och histopathalogical förändringar.
= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "alltid"> 
Figur 1. Kontrollerad bark-modell för måttlig traumatisk hjärnskada effekt. Förfarandet för kontrollerad kortikal påverkan illustreras i denna figur. A) Musen huvud var stabilt fixerad på den stereotaktiska ramen med örat bar och mun bitar. B) Den vänstra skallen var exponerad och 4 mm cirkel drogs i mitten av bregma och lambda. C) Benet avlägsnades genom borrningen för att generera ett fönster för påverkan. D) Manöverdonet fästes på den stereotaktiska ramen och nollpunkten på Z-axeln var inrättas. E) Hjärnvävnaden förvrängd och orsakade blödning med påverkan. F) Blödningen stoppas flera minuter efter islaget och blodet avlägsnades genom bomull applikator./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Histologi för måttlig traumatiska hjärnskador. A) en naiv 10 till 12 veckor gamla mushjärna medlet avlägsnades. B) En 10-12 veckor gamla mushjärna användes såsom en skenstyrning. C) I hjärnan hos en 10-12 veckor gammal mus avlägsnades 24 h efter en måttlig TBI använder CCI-modellen. D) Hjärnan av en 10-12 veckor gammal mus togs bort 6 veckor efter en måttlig TBI använder CCI-modellen. Ett indrag i hjärnvävnaden är uppenbar vid platsen för påverkan. E) Nissl färgning utfördes på en simulerad kontrollgrupp 10-12 veckor gamla mus hjärna för att visa den normala histologin. F) Nissl färgning utfördes på en 10-12 veckor gammal mushjärna som hadefick en måttlig TBI använder CCI-modellen. Ett hålrum syns sträcker sig djupt in i hjärnbarken. Klicka här för att visa en större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mest kritiska stegen för framgångsrikt generera konsekventa Tbis hjälp av ett elektroniskt system för magnetpåverkan för att orsaka en CCI är: 1) stabilt fastställande av musen huvudet i stereotaktisk ram; 2) att generera samma storlek på fönster ben mellan möss och ta bort benet utan att skada dura i den under craniectomy; 3) korrekt positionering av effekterna spetsen mitt i det öppna området och inrättande av nollpunkten innan den slår.
En mus huvud måste fastställas i den stereotaktiska ramen mycket tätt före nedslaget. Lös fixering kommer att generera stora variationer i skadenivå. För att säkerställa fixering är stabil, använder pincett för att utöva påtryckningar på skallen när musen huvudet är fast i den stereotaktiska ramen och kontrollera att skallen förblir orörlig. Vidta åtgärder för att undvika infektion av den exponerade skallen. Efter exponering av skallen, flytta till den svåraste delen av kontrollerade kortikal påverkan kirurgi: borra ett cirkulärskuren i skallen, utan att skada dura mäter under.
Den optimala storleken på borrspetsen är 0,5 mm. Den lämplig hastighet är 10,000-20,000 rpm; Men, kan med hjälp av en högre hastighet underlättar borra ett bättre fönster ben. Borrning kommer att generera värme som kan skada hjärnan, särskilt i unga möss vars ben och dura bifogas. För att förhindra skador på hjärnan, ansöka saltlösning till skallen ytan under borrningen. Tillämpa koksaltlösning kommer att göra det nödvändigt att använda en dissekera mikroskop för att se det borrade cirkeln. När möss mogna utvecklar ett utrymme mellan benet och duran, således effekten av värme som alstras vid borrning skulle producera en minimal inverkan.
Medan borrning, flytta borren långsamt och kontinuerligt längs en cirkulär bana. Annars kan den bit flytta utanför linjen eller gå direkt genom benet och skada hjärnvävnad. Rör försiktigt fönster ben med pincett för att inspektera borrningen. Om skallbenet easily rör sig upp och ner, rör sig den fina spetsen av tången i utrymmet mellan benet och duran. Lyft sedan upp för att ta bort hela benet, vilket skapar fönstret. Lyft inte ben från en sida till en annan, eftersom det kan skada hjärnvävnaden. Göra identiskt stora ben fönster är avgörande för att generera konsekvent hjärnskador. På grund av det intrakraniella trycket, kommer hjärnan att bukta ut i det öppna området en gång benet tas bort, vilket leder till mindre hjärna deformation. Om benet fönsterstorleken varierar, kommer nivån på hjärn deformation vara annorlunda, att vara liknar hjärnans yta kurvan i nedslagsplatsen. Benet var inte flyttas över anslagsstället efter kirurgi eftersom det var mindre än det fönster ben. Detta skulle orsaka benet att vidhäfta direkt till hjärnvävnad. Applicera lim för att täta fönster ben kan leda till ökat intrakraniellt tryck. Undersöka en inverkan plats 3 veckor efter en CCI kirurgi ett nytt membran hittades täcker hjärnvävnaden wed ingen hjärnvävnad tillväxt utanför nedslagsplatsen. Inga kända histologiska förändringar uppstå på grund av en brist på ben täcker.
Det elektroniska systemet magnet påverkan är ytterst stabil och kan exakt kontrollera hastigheten och deformation djup. Men på grund av konstruktionen, kan spolen kopplas till effekterna spetsen flyttas samtidigt slående och leda till en förskjutning av nedslagsplatsen. Detta är den största orsaken till inkonsekventa skador, barring inga andra komplikationer. Trots möjligheten att flytta nedslagsplatsen, den kontrollerade kortikal påverkan metod förblir mer exakt och lättare att kontrollera än vätske slagverk och vikt droppe metoder, vilket gör CCI en föredragen metod för att undersöka de kortsiktiga och långsiktiga effekter av Tbis , såväl som möjliga terapeutiska behandlingar. Även viktigt för TBI forskning, ta bort en del av skallen före påverkan begränsar den kliniska relevansen av CCI-modellen.
Protokollet över describes det förfarande för framställning av en måttlig TBI i en mus. Effekterna stället kan variera 1-6 mm i diameter beroende på djuret och svårighetsgraden av skadan önskas. Även om protokollet förklarade effekten spets var 3 mm i diameter, en 4 mm i diameter craniectomy utfördes för att förhindra oavsiktligt slående ben. Förutom att förändra storleken av nedslagsplatsen kan hastigheten av provkroppen och djup deformation justeras för att nå svårighetsgrad behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av medel från Indiana Spinal Cord & Hjärnskada bidrag (SCBI 200-12), Ralph W. och Grace M. Showalter Research Award, Indiana University Biological Research Grant, NIH bidrag RR025761 och 1R21NS072631-01A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Cotton tipped applicators | Henry Schein | 100-6015 | Remove blood and debris |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13021-12 | Surgery |
| Rechargeable Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| tert-Amyl alcohol | Sigma | 152463-250ML | Making 2.5% Avertin |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | Making 2.5% Avertin |
References
- Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
- Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
- Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
- Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
- Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
- Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
- Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
- Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
- Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
- Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
