Introduction
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) מוגדרת כשינוי בתפקוד המוח, או ראיות אחרות של פתולוגיה במוח, שנגרמו על ידי כוח חיצוני 1. TBIs להישאר בעיה בריאותית חמורה ברחבי העולם, במיוחד בארצות הברית. על פי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן, לפחות 1.7 מיליון TBIs מתרחש מדי שנה בארצות הברית וכתוצאה מכך 30.5% מכל מקרי המוות הקשורים לפציעה. ב2000, העלויות רפואיות הישירות ועלויות עקיפות של TBIs הסתכמו משוער 76500000000 $ בארצות הברית לבדה. למרות התקדמות טכנולוגית וטיפולית בעשרות שנים שקדמו שיפרה את האיכות ואורך חיים של אלה הסובלים מTBIs, אין תרופות יעילות או טיפולים מונעים קיימות כיום. בשל המורכבות וההשפעות רחבות היקף של TBIs, כולל נגעי רקמות, מוות של תאים, וניוון האקסון, אין שתי פציעות הן זהות; וכך, אין מודל TBI הנוכחי לבעלי חיים במדויק מתרבהכל ההיבטים של TBI ראו כמו אצל בני אדם. עם זאת, מודלים של בעלי החיים שמספקים את היכולת לייצר פציעות כמעט זהות דרושה כדי לחקור את ההשפעות שונות של TBI בתקווה להבין עוד יותר את הביטויים הקליניים של TBIs.
המודל המבוקר השפעת קליפת המוח (CCI) משתמש במערכת השפעה, כדי לספק השפעה פיזית לדורה חשופה של בעלי חיים. זה גורם TBIs החל מתון עד חמור דומה לאלה שחוו על ידי בני אדם. פגיעה זו התאפיינה ראשונה בחמוס 2 ומאוחר יותר הותאמה לשימוש בעכבר 3,4, העכבר 5-7, וכבשים 8. מאז האפיון הראשון, האתר של פציעה כבר הניח את שני מעל 2,9 קו האמצע ורוחב הקליפה 10. CCI מספק שיטה קלה ומדויקת של חקירת תופעות וטיפולים פוטנציאליים לTBIs.
בנוסף למודל CCI, כלי הקשה נוזלים וירידה במשקל דגמים הם שיתוףmmonly משמש לייצור TBIs. עם זאת, מודלים אלו מגבלות הווה, כוללים פחות שליטה על פרמטרים פציעה, הפקת שינויי histopathalogical לא ראו בTBIs האנושי, ושכיחות גבוהה יותר של מוות בתאונה בעכברים 3,5,10. מודל גל ההדף משמש גם כדי לייצר TBIs. למרות שמודל גל ההדף לא לשחזר את שינויי histopathalogical ראו בעקבות השפעה מכאנית, מודל זה אינו מדויק לייצר TBIs חווה במיוחד על ידי אנשי צבא 11. מודל השפעת קליפת המוח המבוקר הוא קל לשלוט בשל השליטה המדויקת על פרמטרים עיוות כגון זמן, מהירות, ואת עומק של השפעה 5. דיוק כזה עושה משכפלים את הפציעות כמעט זהות על פני קבוצה שלמה של בעלי חיים אפשריים יותר. והכי חשוב, CCI מתרבה TBIs עם תכונות ראו בTBIs אדם 12. עם זאת, אין מודל חיה יחיד שהוא לגמרי מוצלח בלשחזר את הספקטרום של צ'אן פתולוגי המלאGES נצפה לאחר TBI. מחקר נוסף הוא הכרחי כדי לחשוף באופן מלא את השינויים אקוטיים וכרוניים המתרחשים לאחר TBI.
שני סוגים של פציעות להתרחש בעקבות TBI: פציעות ראשוניות ומשנית. הפגיעה העיקרית מתרחשת ברגע של השפעה ואינה רגיש לטיפולים רפואיים; עם זאת, הפציעות משניות שנמשכות לאחר הפגיעה הראשונית כפופות לטיפולים 13. מודל השפעת קליפת המוח המבוקר מייצר את הפגיעה העיקרית, ובכך מאפשר לחוקרים כדי לחקור את ההשפעות של TBI וטיפולי פוטנציאל להשפעות פוטנציאליים ארוך טווח של פציעות משני. תחומי מחקר פוטנציאלי באמצעות מודל CCI כוללים מוות עצבי, בצקת מוחית, נוירוגנזה, אפקטים וכלי דם, שינויי histopathalogical, וגירעונות זיכרון ועוד 3,13-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפול בבעלי חיים
C57 BL / 6 עכברי זכרים היו שוכן קבוצה והמשיכו בשעתי אור 12/12 / מחזור כהה עם חופשי גישה למזון ומים כהרצון. בעלי החיים המשמשים בפרוטוקול זה היו 10-12 שבועות. כל הנהלים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אינדיאנה.
1. הכנת כירורגי
- להרדים את העכבר באמצעות תערובת קטמין / xylazine (87.7 מ"ג / מיליליטר קטמין ו12.3 מ"ג / מיליליטר Xylazine) ולנהל (1 מיליליטר / קילוגרם) באמצעות הזרקת ה-IP.
- לגלח את הראש של העכבר בין האוזניים.
- החל ג'לי מבוסס נפט לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך ניתוח.
- נקה את האזור המגולח עם יוד 10%. לאחר מכן להשתמש באתנול 70% לנקות את יוד.
- תקן ראש העכבר במסגרת stereotactic באמצעות סורגי האוזן וצלחת ביס. להבטיח את המוח הוא יציב.
2. Craniectomy
3. Impaction
מערכת ההשפעה כוללת תיבת בקרה כדי להגדיר פרמטרים השפעה, מפעיל לבצע הכליאה, ומסגרת stereotactic כדי לאבטח את המעשהuator וראש עכבר להשפעה.
- טרום להגדיר את המהירות של מפעיל עד 3 מ '/ שנייה לפני הניתוח.
- טרום להגדיר עומק עיוות שונה כדי לגרום לחומרות פגיעה שונות. מעמקי עיוות של 0.0-.2 מ"מ, 0.5-1.0 מ"מ, ו1.2-2.0 מ"מ יביאו TBIs קל, בינוני, וחמור, בהתאמה. פרוטוקול זה הסביר איך להגיע לפגיעה מוחית חמורה בינוני עם עומק עיוות של 1 מ"מ באמצעות מהירות של 3 מ '/ שנייה.
- צרף את מפעיל לבעל במסגרת stereotactic ולהשתמש micromanipulators שיזיז אותו כדי לאבטח את הקצה העגול, שטוח של מפעיל (3 מ"מ קוטר) במרכזו של אזור הגולגולת הפתוח. ואז להתאים את הקצה במקביל זווית אל פני השטח של אתר השפעה.
- להקים את נקודת האפס על ידי הזזת את מפעיל במודל המשתרע עד הקצה נוגע במשטח של אתר ההשפעה. ואז להגדיר את ערוץ Z בלוח בקרת stereotactic לאפס.
- לחזור בו קצה impactorתוך כדי התנועה בו זמנית מפעיל למטה 1 מ"מ.
- לחץ על כפתור ההשפעה להכות אתר פציעה ולהשיג עומק עיוות של 1 מ"מ.
4. הפגיעה סגירת אתר
- השתמש אפליקטורים כותנה שקצהו כדי להסיר כל השפעת דם הבא, אבל אל תיגעו באזור הפציעה.
- העבר את העכבר על משטח חם כדי לשמור על טמפרטורת גוף.
- ברגע שדימום הפסק, תפר את הפצע סגור. שים את בעלי החיים בחזרה לכלוב הנקי ולאפשר לו להתאושש מניתוח הלילה על הכרית החמה.
- לנהל עצירות 0.05-.10 מ"ג / קילוגרם SQ כל שעות 8-12 במשך 2 ימים לאחר ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מודל השפעת קליפת המוח המבוקר מייצר TBIs הנע בחומרה בין מתון עד חמור. לאחר השפעת כמות נפיחות גולגולת, דימום והעיוות גולגולתי באתר ההשפעה תגלה את חומרת פגיעה כתוצאה מפרמטרי המהירות ועומק עיוות. TBIs קל לגרום לנפיחות גולגולת באתר ההשפעה והדימום קל בשל הפרת הדורה המוגבלת. TBI מתון מפגין נפיחות גולגולת ודימום מוגבר עקב הפרת דורה על impaction (איור 1). ההבדל בין TBI בינוני וקשה עלול להיות קשה להבחין עד דמיינו על רקמות קבועות באמצעות מיקרוסקופ (איור 2); עם זאת, TBI חמור עלול מדי פעם להציג עיוות מוגברת והודעה על פגיעה, נפיחות בגולגולת. מודל CCI ניתן להשתמש כדי לקבוע את ההשפעות של היבטים רבים של TBIs, כוללים עיוות רקמה (איור 2), מוות עצבי ושינויי histopathalogical.
= "Jove_content" עבור: לשמור-together.within-page = "תמיד"> 
איור 1. מבוקר מודל השפעת קליפת המוח לפגיעה מוחית טראומטית מתונה. ההליך להשפעת קליפת המוח בשליטה בא לידי ביטוי בנתון זה.) ראש העכבר היה קבוע ביציבות במסגרת stereotactic עם חתיכות אוזן בר ופה. ב ') הגולגולת עזבה הייתה נחשף ו4 מעגל מ"מ נמשך במרכז גבחת ומבדה. C) העצם הוסר על ידי הקידוח כדי ליצור חלון להשפעה. ד) מפעיל צורף במסגרת stereotactic ונקודת האפס בציר ה-Z היה להגדיר. E) רקמת המוח הייתה מעוות וגרמה לדימום עם השפעה. F) הדימום הפסיק כמה דקות אחרי הפגיעה והדם הוסר על ידי המוליך כותנה./ "= היעד" _blank ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. היסטולוגיה לפגיעות מוח טראומטיות מתונות. א) במוח עכבר 10-12 שבוע ישן נאיבי הוסר. ב ') במוח עכבר 10-12 שבוע ישן שימש כביקורת דמה. C) המוח של עכבר 10-12 בן שבוע הוסר 24 שעות לאחר מתון TBI באמצעות מודל CCI. ד ') במוח של עכבר 10-12 בן שבוע הוסר 6 שבועות לאחר TBI מתון באמצעות מודל CCI. הזחה ברקמת המוח ניכרת באתר של השפעה. E) מכתים Nissl בוצע על שליטת דמה מוח עכבר 10-12 שבוע הישן כדי להראות היסטולוגיה הנורמלית. מכתים F) Nissl בוצע על 10-12 בן שבוע מוח העכבר שהיה ליקיבל TBI מתון באמצעות מודל CCI. חלל הוא גלוי הרחבת עמוקה לתוך קליפת המוח. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר ליצירת ההצלחה TBIs העקבי באמצעות מערכת השפעת המגנט אלקטרונית כדי לגרום CCI הם: 1) יציבות קיבוע ראש העכבר במסגרת stereotactic; 2) שהניבו באותו הגודל של חלון עצם בין עכברים והסרת העצם מבלי לפגוע הדורה מתחתיו במהלך craniectomy; 3) בצורה נכונה מיקום קצה ההשפעה במרכז השטח הפתוח והקמת נקודת האפס לפני להשפיע.
ראש עכבר חייב להיות קבוע במסגרת stereotactic חזקה מאוד לפני הפגיעה. Loose קיבעון יפיק וריאציות גדולות ברמת פגיעה. על מנת להבטיח קיבוע יציב, להשתמש במלקחיים כדי להפעיל לחץ על הגולגולת ברגע שראש העכבר קבוע במסגרת stereotactic ולוודא כי הגולגולת נשארת נייחת. לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע זיהום של הגולגולת חשופה. לאחר חשיפת הגולגולת, לעבור לחלק הקשה ביותר של ניתוח השפעת קליפת המוח המבוקר: קידוח חוזרלחתוך לתוך הגולגולת מבלי לפגוע מאטר הדורה מתחתיו.
הגודל האופטימלי של קצה המקדח הוא 0.5 מ"מ. המהירות המתאימה היא 10,000-20,000 סל"ד; עם זאת, שימוש במהירות גבוהה יותר יכול להקל על קידוח חלון עצם טוב יותר. קידוח יפיק חום שיכול לפגוע במוח, בעיקר בעכברים צעירים עצם ודורה שמצורפים. כדי למנוע נזק למוח, חלים מלוח על פני השטח הגולגולת בזמן קידוח. מריחת תמיסת מלח תעשה את זה הכרחי להשתמש במיקרוסקופ לנתח כדי לראות את המעגל שנקדח. כאשר עכברים בוגרים, מרחב מתפתח בין העצם והדורה, ובכך ההשפעה של חום שנוצר על ידי קידוח הייתה לייצר השפעה מינימאלית.
בעוד קידוח, הזז את המקדח לאט וכל הזמן לאורך מסלול מעגלי. אחרת, קצת עשוי לעבור את הקו או לעבור ישירות דרך העצם ולגרום נזק לרקמת המוח. לגעת בעדינות בחלון עצם שימוש במלקחיים כדי לבדוק את הקידוח. אם ea עצם הגולגולתsily נע מעלה ומטה, להזיז את קצה הקנס של המלקחיים לתוך החלל שבין העצם והדורה. ואז להרים את להסיר את כל העצם, ובכך ליצור את החלון. אל תרים עצם מצד אחד למשנו, משום שדבר עלול לפגוע ברקמת המוח. מה שהופך את חלונות עצם בגודל זהה הוא קריטי ליצירת פגיעות במוח עולה בקנה אחד. עקב לחץ תוך גולגולתי, המוח לבלוט החוצה של השטח הפתוח ברגע שהעצם מוסר, ובכך גורם לעיוות במוח קטנה. אם גודל חלון העצם משתנה, ברמה של עיוות המוח תהיה שונה, להיות דומה לעקומת משטח המוח באתר ההשפעה. העצם לא היה מיקומו על אתר ההשפעה לאחר ניתוח שכן הוא היה קטן יותר מחלון העצם. אם תעשה זאת, יגרום לעצם לדבוק ישירות לרקמת המוח. מריחת דבק כדי לאטום את חלון העצם עלולה לגרום ללחץ תוך גולגולתי מוגבר. בחינת השפעת אתר 3 שבועות לאחר ניתוח CCI קרום חדש נמצא מכסה את רקמת מוח wה-i אין צמיחת רקמת מוח מחוץ לאתר ההשפעה. לא חל שינויים היסטולוגית ידועים להתרחש עקב חוסר כיסוי עצם.
מערכת השפעת המגנט האלקטרונית היא יציבה מאוד ודווקא יכולה לשלוט על המהירות ועומק עיוות. עם זאת, בשל העיצוב, הסליל מחובר לקצה ההשפעה יכול לעבור תוך בולט ולגרום לשינוי של אתר של השפעה. זה הוא הגורם העיקרי לפציעות עולות בקנה אחד, האוסר על שום סיבוכים אחרים. למרות האפשרות להסטת אתר ההשפעה, שיטת ההשפעה של קליפת המוח בשליטה נשארת מדויקת יותר וקל יותר לשלוט בהשוואה לכלי קשה הנוזל ושיטות ירידה במשקל, ובכך CCI שיטה מועדפת לחוקרת את ההשפעות קצר הטווח וארוך טווח של TBIs , כמו גם טיפולים אפשריים. אמנם חשוב למחקר TBI, הסרת חלק מהגולגולת לפני ההשפעה מגבילה את הרלוונטיות הקלינית של מודל CCI.
הפרוטוקול לעיל describes ההליך לייצר TBI מתון בעכבר. אתר ההשפעה עשוי לנוע 1-6 מ"מ קוטר בהתאם לבעלי החיים וחומרת הפגיעה הרצויות. אף על פי הפרוטוקול האמור טיפ ההשפעה היה 3 מ"מ קוטר, מ"מ 4 בקוטר craniectomy בוצע על מנת למנוע עצם בולט בטעות. בנוסף לשינוי גודל אתר ההשפעה, את המהירות של impactor והעומק של עיוות יכולה להיות מותאמת כדי להגיע לחומרה הדרושה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מימון מכבל אינדיאנה השדרה ומענקי מחקר פגיעה מוחי (SCBI 200-12), ראלף וו וגרייס מ 'וולטר פרס מחקר, אוניברסיטת אינדיאנה גרנט המחקר הביולוגי, RR025761 מענקי NIH ו1R21NS072631-01A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Povidone-iodine 7.5% | Purdue product L.P. | Surgical scrub | |
| Cotton tipped applicators | Henry Schein | 100-6015 | Remove blood and debris |
| Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | Surgery |
| Forcept | Fine Science Tools | 11293-00 | Surgery |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13021-12 | Surgery |
| Rechargeable Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Combine with Burrs for generating the bone window |
| Burrs for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Suture monofilament | Ethicon | G697 | Suture |
| tert-Amyl alcohol | Sigma | 152463-250ML | Making 2.5% Avertin |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma | T48402-25G | Making 2.5% Avertin |
References
- Menon, D. K., Schwab, K., et al. Position statement: definition of traumatic brain injury. Arch Phys Med Rehabil. 91 (11), 1637-1640 (2010).
- Lighthall, J. W., Dixon, C. E., et al. Experimental models of brain injury. J Neurotrauma. 6 (2), 83-97 (1989).
- Dixon, C. E., Clfton, G. L., et al. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. J Neurosci Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Scheff, S. W., Baldwin, S. A., et al. Morris water maze deficits in rats following traumatic brain injury: lateral controlled cortical impact. J Neurotrauma. 14 (9), 615-627 (1997).
- Smith, D. H., Soares, H. D., et al. A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects. J Neurotrauma. 12 (2), 169-178 (1995).
- Hannay, H. J., Feldman, Z., et al. Validation of a controlled cortical impact model of head injury in mice. J Neurotrauma. 16 (11), 1103-1114 (1999).
- Natale, J. E., Ahmed, F., et al. Gene expression profile changes are commonly modulated across models and species after traumatic brain injury. J Neurotrauma. 20 (10), 907-927 (2003).
- Anderson, R. W., Brown, C. J., et al. Impact mechanics and axonal injury in a sheep model. J Neurotrauma. 20 (10), 961-974 (2003).
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Chen, S., Pickard, J. D., et al. Time course of cellular pathology after controlled cortical impact injury. Exp Neurol. 182 (1), 87-102 (2003).
- Long, J. B., Bentley, T. L., et al. Blast overpressure in rats: recreating a battlefield injury in the laboratory. J Neurotrauma. 26 (6), 827-840 (2009).
- Clark, R. S., Schiding, J. K., et al. Neutrophil accumulation after traumatic brain injury in rats: comparison of weight drop and controlled cortical impact models. J Neurotrauma. 11 (5), 499-506 (1994).
- Werner, C., Engelhard, K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).
- Colicos, M. A., Dixon, C. E., et al. Delayed, selective neuronal death following experimental cortical impact injury in rats: possible role in memory deficits. Brain Res. 739 (1-2), 111-119 (1996).
- Raghavendra Rao, V. L., Dogan, A., et al. Traumatic brain injury leads to increased expression of peripheral-type benzodiazepine receptors, neuronal death, and activation of astrocytes and microglia in rat thalamus. Exp Neurol. 161 (1), 102-114 (2000).
- Gao, X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury promotes neural precursor proliferation without increasing neurogenesis in the adult hippocampus. Exp Neurol. 239, 38-48 (2013).
