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Medicine

Controlado Modelo de Impacto cortical de la lesión cerebral traumática

doi: 10.3791/51781 Published: August 5, 2014

Introduction

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La lesión cerebral traumática (TBI) se define como una alteración de la función cerebral, u otra evidencia de patología cerebral, causada por una fuerza externa 1. LCT siguen siendo un grave problema de salud en todo el mundo, particularmente en los Estados Unidos. Según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, por lo menos 1.7 millones de lesiones cerebrales traumáticas se producen anualmente en los Estados Unidos lo que resulta en un 30,5% de todas las muertes relacionadas con lesiones. En 2000, los costos médicos directos y los costos indirectos de la LCT totalizaron un estimado de 76,5 mil millones dólares en los Estados Unidos solamente. Aunque los avances tecnológicos y terapéuticos en décadas anteriores se ha mejorado la calidad y la duración de vida de aquellos que sufren de lesiones cerebrales traumáticas, actualmente no existen farmacéutica eficaz o tratamientos preventivos. Debido a la complejidad y efectos de gran alcance de la LCT, incluyendo lesiones de los tejidos, la muerte celular y la degeneración axonal, no hay dos lesiones son idénticos; por lo tanto, no hay un modelo de TBI de corriente para animales reproduce con precisióntodos los aspectos de TBI como se ve en los seres humanos. Sin embargo, los modelos animales proporcionan la capacidad de producir lesiones casi idénticos necesarias para investigar diversos efectos de TBI con la esperanza de una mayor comprensión de las manifestaciones clínicas de la LCT.

El modelo controlado impacto cortical (CCI) utiliza un sistema de impacto para entregar impacto físico a la duramadre expuesta de un animal. Induce LCT que van de leves a graves similares a los experimentados por los seres humanos. Esta lesión se caracteriza por primera vez en el hurón 2 y fue adaptado más adelante para su uso en la rata 3,4, ratón 5-7, y ovejas 8. Desde la primera caracterización, el sitio de la lesión se ha colocado tanto sobre la línea media de 2,9 y la corteza lateral 10. CCI ofrece un método fácil y preciso de la investigación de los efectos y posibles tratamientos para lesiones cerebrales traumáticas.

Además del modelo de CCI, la percusión de fluido y caída de peso modelos son commonly utilizado para producir lesiones cerebrales traumáticas. Sin embargo, estos modelos ofrecen limitaciones, entre ellas un menor control sobre los parámetros de lesión, produciendo cambios histopathalogical no vistos en LCT humano y mayor incidencia de muerte accidental en ratones 3,5,10. El modelo de onda expansiva también se utiliza para producir lesiones cerebrales traumáticas. Aunque el modelo de onda expansiva no reproduce los cambios histopathalogical visto después de un impacto mecánico, este modelo no producir con precisión lesiones cerebrales traumáticas experimentadas en particular por el personal militar 11. El modelo de impacto cortical controlado es fácil de controlar debido al control preciso sobre los parámetros de deformación, tales como el tiempo, la velocidad y la profundidad de impacto 5. Tal precisión hace que la replicación de lesiones casi idénticos a través de todo un grupo de animales más factibles. Lo más importante, CCI reproduce LCT con características que se observan en la LCT humana 12. Sin embargo, no hay ningún modelo animal único que es del todo satisfactoria en la reproducción del espectro completo de patológica Chanbios observados después de TBI. Se necesita más investigación para revelar plenamente los cambios agudos y crónicos que se producen después de TBI.

Hay dos tipos de lesiones se producen después de una lesión cerebral traumática: lesiones primarias y secundarias. La lesión primaria se produce en el momento del impacto y no es sensible a tratamientos terapéuticos; Sin embargo, las lesiones secundarias que persisten después de la lesión inicial están sujetos a los tratamientos 13. El modelo de impacto cortical controlado produce la lesión primaria, lo que permite a los investigadores estudiar los efectos de la lesión cerebral traumática y tratamientos terapéuticos potenciales para los efectos potencialmente de larga duración de las lesiones secundarias. Áreas de potencial de investigación utilizando el modelo CCI incluyen la muerte neuronal, edema cerebral, la neurogénesis, efectos vasculares, cambios histopathalogical y déficits de memoria y más 3,13-16.

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Protocol

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Cuidado de los Animales
Masculino C57 BL / 6 ratones fueron alojados en grupos y se mantuvieron en un 12/12 horas de luz / oscuridad ciclo con el libre acceso al alimento y agua ad libitum. Los animales utilizados en este protocolo fueron 10-12 semanas de edad. Todos los procedimientos se realizaron bajo los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Indiana.

1. Preparación quirúrgica

  1. Se anestesia el ratón utilizando una mezcla de ketamina / xilazina (87,7 mg / ml de ketamina y 12,3 mg / ml de xilazina) y administrar (1 ml / kg) a través de inyección IP.
  2. Afeitarse la cabeza del ratón entre las orejas.
  3. Aplicar una gelatina a base de petróleo a los ojos del ratón para evitar que se sequen durante la cirugía.
  4. Limpie la zona afeitada con un 10% de yodo. A continuación, utilice etanol al 70% para limpiar el yodo.
  5. Fijar la cabeza del ratón en el marco estereotáctico utilizando las barras de oído y placa de mordida. Asegúrese de que el cerebro es estable.

2. Craniectomía

  • Hacer una incisión longitudinal en el centro de la cabeza con unas tijeras. Use una pinza hemostática para mantener la piel en el lateral izquierdo.
  • Utilice un aplicador con punta de algodón para quitar la sangre y el tejido del hueso para exponer el cráneo. Permitir cráneo expuesto se seque durante 1 min.
  • El uso de fórceps para ejercer presión y asegurarse de que el cráneo permanece inmóvil. Identificar puntos de referencia anatómicos Lambda (aspecto caudal) y Bregma (aspecto frontal). Dibuje un círculo en el centro de Lambda y Bregma con un diámetro de 4 mm y 0,5 mm de la línea media.
  • Use un taladro para cortar a lo largo del círculo marcado. Sople suavemente el polvo de huesos de distancia. No perfore completamente a través del hueso para evitar que se dañe la duramadre.
  • El uso de fórceps para quitar el hueso y exponer la duramadre.
  • 3. Impactación

    El sistema de impacto incluye una caja de control para establecer los parámetros de impacto, un dispositivo de accionamiento para realizar la impactación, y un marco estereotáctico para garantizar el actouator y la cabeza de ratón para el impacto.

    1. Pre-establecer la velocidad del actuador a 3 m / seg antes de la cirugía.
    2. Pre-set diferente profundidad de deformación para inducir diferentes niveles de gravedad de lesiones. Profundidades de deformación de 0,0 a 0,2 mm, 0,5 a 1,0 mm, y 1,2 a 2,0 mm resultaría en lesiones cerebrales traumáticas leves, moderados y graves, respectivamente. Este protocolo explica cómo lograr una lesión cerebral moderadamente grave con una profundidad de deformación de 1 mm mediante el uso de una velocidad de 3 m / seg.
    3. Fije el actuador a la titular en el marco estereotáctico y utilizar los micromanipuladores moviéndolo para asegurar la punta redonda y plana del actuador (3 mm de diámetro) en el centro de la zona cráneo abierto. A continuación, ajuste la punta en un ángulo paralelo a la superficie del lugar del impacto.
    4. Establecer el punto cero moviendo hacia abajo el actuador en el modelo que se extiende hasta la punta toque la superficie del lugar del impacto. A continuación, establezca el canal Z en el panel de control estereotáctica a cero.
    5. Retirar la punta impactadormientras se mueve simultáneamente el actuador hacia abajo 1 mm.
    6. Pulse el botón de impacto para golpear el sitio de la lesión y lograr una profundidad de deformación de 1 mm.

    4. Lesión del sitio de cierre

    1. Utilice bastoncillos de algodón para eliminar cualquier impacto sangre después, pero no toque la zona de la lesión.
    2. Coloque el ratón sobre una almohadilla caliente para mantener la temperatura corporal.
    3. Una vez que el sangrado se haya detenido, suturar la herida cerrada. Ponga el animal dentro de la jaula limpia y deje que se recupere de la cirugía durante la noche en la almohadilla caliente.
    4. Administrar Buprenorfina 0,05-0,10 mg / kg vía subcutánea cada 8 a 12 horas durante 2 días después de la cirugía.

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    Representative Results

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    El modelo de impacto cortical controlado produce lesiones cerebrales traumáticas que varían en gravedad de leve a grave. Post-impacto la cantidad de inflamación craneal, hemorragia, y la distorsión del cráneo en el sitio de impacto revelan la gravedad de las lesiones resultantes de los parámetros de velocidad y profundidad de la deformación. LCT leve como resultado hinchazón craneal en el lugar del impacto y sangrado leve como consecuencia del incumplimiento duración limitada. A TCE moderado presenta hinchazón craneal y el aumento de sangrado debido a incumplimiento dura sobre impactación (Figura 1). La diferencia entre un TCE moderado y grave puede ser difícil de distinguir hasta visualizado en tejidos fijados utilizando un microscopio (Figura 2); sin embargo, una grave lesión cerebral traumática puede ocasionalmente mostrar distorsión amplificada y craneal inflamación post-impacto. El modelo de CCI se puede utilizar para determinar los efectos de los múltiples aspectos de lesiones cerebrales traumáticas, incluyendo la deformación del tejido (Figura 2), la muerte neuronal, y cambios histopathalogical.

    = "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figura 1
    Figura 1. Controlado modelo de impacto cortical para la lesión cerebral traumática moderada. El procedimiento de impacto cortical controlado se ilustra en esta figura. A) La cabeza de ratón fue fijado de manera estable en el marco estereotáctico con barras oreja y boca bits. B) El cráneo quedó fue expuesto y 4 mm de círculo fue dibujado en el centro de bregma y lambda. C) El hueso se eliminó por la perforación para generar una ventana para el impacto. D) El actuador se adjunta en el marco estereotáctico y el punto cero en el eje Z se configurar. E) El tejido cerebral se distorsionó y causó sangrado con impacto. F) La hemorragia se detuvo varios minutos después del impacto y la sangre fue retirado por el aplicador de algodón./ Ftp_upload/51781/51781fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

    Figura 2
    Figura 2. Histología de moderadas lesiones cerebrales traumáticas. A) Se retiró una ingenuo cerebro 10-12 semanas de edad de ratón. B) Un 10-12 semanas de edad de cerebro de ratón se usó como un control simulado. C) El cerebro de un ratón 10-12 semanas de edad se eliminó 24 horas después de una moderada TBI utilizando el modelo de CCI. D) El cerebro de un ratón de 10-12 semanas de edad, fue eliminado 6 semanas después de un TCE moderado mediante el modelo de CCI. Una indentación en el tejido cerebral es evidente en el lugar de impacto. E) tinción de Nissl se realizó en un control simulado cerebro 10-12 semanas de edad de ratón para mostrar la histología normal. Tinción F) de Nissl se realizó en un 10-12 semanas de edad cerebro de ratón que teníarecibido un TCE moderado mediante el modelo de CCI. Una cavidad es visible que se extiende profundamente en la corteza. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

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    Discussion

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    Los pasos más importantes para la generación de éxito LCT consistentes utilizando un sistema de impacto imán electrónico para causar una CCI son: 1) la fijación estable de la cabeza del ratón en el marco estereotáctico; 2) generar el mismo tamaño de ventana de hueso entre los ratones y eliminar el hueso sin dañar la duramadre debajo de ella durante la craniectomía; 3) colocar correctamente la punta del impacto en el centro de la zona abierta y establecer el punto cero antes de impactar.

    A la cabeza del ratón debe fijarse en el marco estereotáctico muy bien antes del impacto. Fijación Loose generará grandes variaciones en el nivel de la lesión. Para asegurar la fijación es estable, utilice unas pinzas para aplicar presión en el cráneo una vez que la cabeza del ratón se fija en el marco estereotáctico y confirme que el cráneo permanece inmóvil. Tomar medidas de precaución para evitar la infección del cráneo expuesto. Después de exponer el cráneo, pasar a la parte más difícil de la cirugía de impacto cortical controlado: la perforación de un circularcortado en el cráneo sin dañar la duramadre debajo.

    El tamaño óptimo de la punta de la broca es de 0,5 mm. La velocidad adecuada es 10.000-20.000 rpm; Sin embargo, el uso de una velocidad más alta puede facilitar la perforación de un mejor ventana ósea. Perforación generará calor que puede dañar el cerebro, sobre todo en ratones jóvenes cuya ósea y duramadre se adjuntan. Para evitar daños en el cerebro, aplicar solución salina a la superficie del cráneo durante la perforación. La aplicación de solución salina hará que sea necesario el uso de un microscopio de disección con el fin de ver el círculo perforado. Cuando los ratones maduran, se desarrolla un espacio entre el hueso y duramadre, por lo tanto el efecto de calor generado por la perforación produciría un impacto mínimo.

    Mientras que la perforación, mueva la broca lentamente y constantemente a lo largo de una trayectoria circular. De lo contrario, el bit se puede mover fuera de la línea, o ir directamente a través del hueso y dañar el tejido cerebral. Toque suavemente la ventana ósea utilizando pinzas para inspeccionar la perforación. Si el hueso del cráneo easily se mueve hacia arriba y hacia abajo, mueva la punta fina de la pinza en el espacio entre el hueso y la duramadre. Luego levante para quitar todo el hueso, creando así la ventana. No levante el hueso de un lado a otro, ya que hacerlo puede dañar el tejido cerebral. Haciendo ventanas óseas de tamaño idéntico es fundamental para la generación de lesiones cerebrales consistentes. Debido a la presión intracraneal, el cerebro se hinchará fuera de la zona abierta una vez que se retira el hueso, causando por lo tanto la deformación cerebral menor. Si el tamaño de la ventana de hueso varía, el nivel de deformación cerebro será diferente, siendo similar a la curva de la superficie del cerebro en el lugar del impacto. El hueso no se vuelve a colocar sobre el lugar de impacto después de la cirugía, ya que era más pequeño que la ventana de hueso. Si lo hace, podría causar que el hueso se adhieren directamente al tejido cerebral. La aplicación de pegamento para sellar la ventana ósea podría resultar en un aumento de la presión intracraneal. El examen de un sitio de impacto 3 semanas después de una cirugía CCI una nueva membrana se encontró que cubre el tejido cerebral With hay crecimiento de tejido cerebral fuera del lugar del impacto. No hay cambios histológicos conocidos se producen debido a una falta de cobertura de hueso.

    El sistema de impacto imán electrónica es extremadamente estable y puede controlar con precisión la velocidad y la profundidad de la deformación. Sin embargo, debido al diseño, la bobina conectada a la punta de impacto puede cambiar mientras se golpea y resultar en un cambio de sitio de impacto. Esta es la principal causa de lesiones incompatibles, salvo otras complicaciones. A pesar de la posibilidad de cambiar el lugar del impacto, el método de impacto cortical controlado sigue siendo más precisos y más fáciles de controlar en comparación con la percusión de fluidos y métodos de caída de peso, con lo que CCI un método preferido para la investigación de los de corto plazo y largo plazo los efectos de lesiones cerebrales traumáticas , así como posibles tratamientos terapéuticos. Aunque importante para la investigación de TBI, la eliminación de una porción del cráneo antes del impacto limita la relevancia clínica del modelo de CCI.

    El protocolo anterior describes el procedimiento para producir un TCE moderado en un ratón. El sitio de impacto puede variar desde 1 hasta 6 mm de diámetro en función del animal y la gravedad de la lesión deseada. Aunque el protocolo declaró la punta de impacto fue de 3 mm de diámetro, un 4 mm de diámetro craniectomía se realizó con el fin de evitar golpear accidentalmente hueso. Además de alterar el tamaño del lugar del impacto, la velocidad del impactador y la profundidad de la deformación se puede ajustar para alcanzar la gravedad sea necesario.

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    Acknowledgments

    Este trabajo fue apoyado por fondos de la Cord Indiana espinal y lesiones cerebrales Ayudas a la Investigación (SCBI 200-12), el Ralph W. y Grace Premio de Investigación Showalter M., Universidad de Indiana Investigaciones Biológicas Grant, NIH subvenciones RR025761 y 1R21NS072631-01A.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Povidone-iodine 7.5% Purdue product L.P. Surgical scrub
    Cotton tipped applicators Henry Schein 100-6015 Remove blood and debris
    Scissor Fine Science Tools 14084-08 Surgery
    Forcept Fine Science Tools 11293-00 Surgery
    Hemostat Fine Science Tools 13021-12 Surgery
    Rechargeable Cordless Micro Drill Stoelting 58610 Combine with Burrs for generating the bone window
    Burrs for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
    Suture monofilament Ethicon G697 Suture
    tert-Amyl alcohol Sigma 152463-250ML Making 2.5% Avertin
    2,2,2-Tribromoethanol Sigma T48402-25G Making 2.5% Avertin

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    References

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    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).More

    Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (90), e51781, doi:10.3791/51781 (2014).

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