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Bioengineering

एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रिसेप्टर गतिशीलता के उच्च संकल्प Spatiotemporal विश्लेषण

Published: July 25, 2014 doi: 10.3791/51784
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Pharmacology and Toxicology and Bio-Imaging Center/Rudolf Virchow Center, DFG-Research Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg, Germany

Abstract

एकल अणु माइक्रोस्कोपी उन पहलू (जैसे., कैनेटीक्स, विभिन्न राज्यों और आबादी, क्षणिक बातचीत के सह - अस्तित्व) आम तौर पर कलाकारों की टुकड़ी माप में छिपे हुए हैं, जो इस तरह के रूप के विषय में विशेष रूप से, संकेतन अणुओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभर रहा है मानक जैव रासायनिक या माइक्रोस्कोपी तरीकों के साथ प्राप्त की. इस प्रकार, इस तरह रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत के रूप में गतिशील घटनाओं, उच्च spatiotemporal संकल्प के साथ एक जीवित कोशिका में वास्तविक समय में पीछा किया जा सकता. इस प्रोटोकॉल छोटे और चमकदार जैविक fluorophores और सीधे जीवित कोशिकाओं की सतह पर एक रिसेप्टर्स कल्पना करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के साथ लेबलिंग पर आधारित एक विधि का वर्णन करता है. यह दृष्टिकोण एक ठीक, रिसेप्टर्स के स्थानीयकरण रिसेप्टर परिसरों के आकार को मापने, और इस तरह क्षणिक रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत के रूप में गतिशील घटनाओं पर कब्जा करने की अनुमति देता है. प्रोटोकॉल पे करने के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करता हैनमूना तैयार करने, छवि अधिग्रहण और छवि विश्लेषण सहित एक एकल अणु प्रयोग, rform. एक उदाहरण के रूप में, इस विधि के आवेदन दो जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स का विश्लेषण करने के लिए, यानी., 2 एड्रीनर्जिक और γ-aminobutyric एसिड ग्रुप बी (GABA बी) रिसेप्टर β, बताया जाता है. प्रोटोकॉल अन्य झिल्ली प्रोटीन और अलग सेल मॉडल, अभिकर्मक तरीकों और रणनीतियों लेबलिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

कोशिका की सतह पर स्थित रिसेप्टर्स बाह्य वातावरण भावना और इस तरह odorants, आयनों, छोटे न्यूरोट्रांसमीटर और बड़े प्रोटीन हार्मोन के रूप में उत्तेजनाओं की एक किस्म का जवाब. सेलुलर झिल्ली के तरल पदार्थ प्रकृति रिसेप्टर्स और अन्य झिल्ली प्रोटीन के आंदोलनों की अनुमति देता है. यह प्रोटीन परिसरों और ऐसे कार्यात्मक इकाइयों को इकट्ठा करने में और सेल इंटीरियर में संकेत transduce को रिसेप्टर्स द्वारा इस्तेमाल उन लोगों के रूप में क्षणिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की घटना के गठन के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, सेल सतह रिसेप्टर्स 1 के सबसे बड़े परिवार का गठन जो जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs),, संकेत पारगमन के ठीक tuned विनियमन में शामिल होना प्रतीत होता है और जो di-/oligomers, फार्म करने के लिए सुझाव दिया गया है महत्वपूर्ण शारीरिक और औषधीय परिणाम 2-5 हो सकता है.

एकल अणु माइक्रोस्कोपी सीधे उच्च spatiotemp साथ दृश्यमान करने की काफी संभावना हैमौखिक संकल्प उनकी एसोसिएशन सहित जीवित कोशिकाओं की सतह पर स्थित व्यक्ति रिसेप्टर्स की गतिशील व्यवहार dimers और उच्च आदेश आणविक परिसरों 6-10 बनाने के लिए. यह आमतौर पर अणुओं के हजारों या लाखों लोगों की औसत व्यवहार की रिपोर्ट जो मानक जैव रासायनिक और माइक्रोस्कोपी तरीकों की तुलना में कई लाभ प्रदान करता है.

एक पर्याप्त उज्ज्वल और photostable फ्लोरोफोरे के साथ प्रोटीन लेबलिंग एकल अणु माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल covalently सेल सतह रिसेप्टर्स करने के लिए छोटे और चमकदार जैविक fluorophores संलग्न करने के लिए हाल ही में शुरू की तस्वीर टैग 11 का लाभ लेता है. तस्वीर अचल fluorophore संयुग्मित benzylguanine (फ्लोरोफोरे-बीजी) डेरिवेटिव के साथ लेबल किया जा सकता है जो मानव डीएनए की मरम्मत एंजाइम हे 6 alkylguanine डीएनए alkyltransferase से ली गई एक 20 केडी प्रोटीन टैग है. क्लिप, तस्वीर से ली गई एक और इंजीनियर टैग, बजाय फ्लोरोफोरे सी के साथ लेबल किया जा सकताonjugated benzylcytosine डेरिवेटिव 12.

इस पांडुलिपि में सूचना दी प्रोटोकॉल transfect और लेबल छोटे जैविक fluorophores के साथ 11 रिसेप्टर्स तस्वीर में चिह्नित और जीवित कोशिकाओं 10 की सतह पर एक रिसेप्टर्स या रिसेप्टर परिसरों कल्पना करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी का उपयोग कैसे करें. एक extracellularly तस्वीर में चिह्नित सेल सतह प्रोटीन 10 के> 90% लेबलिंग दक्षता में सूचना दी प्रोटोकॉल का परिणाम है. रिसेप्टर परिसरों का आकार और गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए, साथ ही क्षणिक रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत कब्जा करने के लिए एकल अणु डेटा का उपयोग करने के बारे में अधिक जानकारी प्रदान की जाती है. पूरे प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह चित्रा 1 में दी गई है. एक उदाहरण के रूप में, चीनी हैम्स्टर अंडाशय तस्वीर में चिह्नित जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के साथ (चो) कोशिकाओं के अभिकर्मक के रूप में एक fluorophore-बीजी व्युत्पन्न के साथ लेबलिंग द्वारा पीछा अच्छी तरह से अपने आवेदन quantif के रूप मेंY और मॉनिटर रिसेप्टर di-/oligomerization वर्णित हैं. इस प्रोटोकॉल अन्य सेल सतह प्रोटीन और फ्लोरोसेंट टैग (जैसे., क्लिप), और साथ ही अन्य अभिकर्मक और लेबलिंग तरीकों के लिए बढ़ाया जा सकता है.

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Protocol

1. नमूना तैयार

  1. Coverslip सफाई
    नोट: एक धूआं हुड के तहत काम.
    1. व्यक्तिगत coverslips कि अलग एक coverslip धारक में कांच coverslips (24 मिमी व्यास) के लिए जगह साफ चिमटी का प्रयोग करें.
    2. एक बीकर में coverslips के साथ धारक रखो, और coverslips कवर कर रहे हैं जब तक क्लोरोफॉर्म जोड़ें. आरटी पर 1 घंटे के लिए एक स्नान sonicator में वाष्पीकरण और sonicate को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बीकर कवर. बीकर के बाहर coverslip धारक लो और coverslips सूखी हैं.
    3. बजाय क्लोरोफॉर्म की 5M NaOH समाधान के साथ कदम 1.1.2 दोहराएँ.
    4. एक नया बीकर में coverslip धारक लो और आसुत जल के साथ तीन बार धोएं. 100% इथेनॉल के साथ भरा एक गिलास सेल संस्कृति की थाली में साफ coverslips रखो.
  2. अंशांकन नमूनों की तैयारी
    1. उपयुक्त विलायक में फ्लोरोसेंट डाई भंग.
    2. लेकर फ्लोरोसेंट रंग की एक 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने की तैयारी13:00 से 1 एनएम के लिए फिल्टर में (0.22 मीटर) पानी निष्फल.
    3. 100% इथेनॉल में संग्रहीत साफ coverslips लो और फिल्टर निष्फल पानी से धो लें. एक अलग साफ coverslip पर प्रत्येक फ्लोरोसेंट डाई कमजोर पड़ने की स्पॉट 20 μl. Coverslips एक बाँझ हुड के नीचे सूखी हैं. उपयोग करें जब तक प्रकाश और धूल से coverslips को सुरक्षित रखें. एक फ्लोरोसेंट अणु की तीव्रता (चरण 3 देखें) अनुमान लगाने के लिए इन नमूनों का प्रयोग करें.
  3. अभिकर्मक
    1. 01:01 Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण में संस्कृति चो कोशिकाओं एफ 12 से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, में साथ पूरक (DMEM/F12) . 5% सीओ 2 नोट: autofluorescence कम करने के लिए प्रयोग भर phenol के लाल स्वतंत्र मीडिया का प्रयोग करें.
    2. , 100% इथेनॉल समाधान से साफ coverslips लो बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ उन्हें धोने, और एक 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति पी एल में से प्रत्येक कुएं में एक coverslip जगहखा लिया.
    3. Trypsinize, गिनती और 3 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह coverslips युक्त 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में से एक घनत्व में बीज चो कोशिकाओं. कोशिकाओं लगभग हासिल करने के लिए 24 घंटे के लिए (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) एक मशीन में बढ़ता है. अभिकर्मक के लिए इष्टतम सेल घनत्व है जो 80% confluency,.
    4. प्रत्येक अच्छी तरह के लिए, (उदाहरण के लिए., 2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर β तस्वीर में चिह्नित) वांछित प्लास्मिड डीएनए के 2 ग्राम पतला और 500 μl OptiMem मध्यम युक्त दो अलग ट्यूबों में 6 μl 2000 Lipofectamine. 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
    5. एक ट्यूब में कदम 1.3.4 से समाधान गठबंधन और एक अभिकर्मक मिश्रण प्राप्त करने के लिए मिश्रण. 20 मिनट के लिए आरटी पर अभिकर्मक मिश्रण सेते हैं.
    6. ऊष्मायन (1.3.5) के दौरान, चो कोशिकाओं लेने और पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ दो बार धोने. 1 मिलीग्राम / 10% FBS के साथ पूरक फिनोल लाल मुक्त DMEM/F12 माध्यम की अच्छी तरह से है, लेकिन कोई एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पीबीएस बदलें.
    7. पूरे transfect जोड़ेंधीरे आयन मिश्रण अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए कदम 1.3.5 dropwise से (1 मिलीग्राम), और पूरा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए आगे और पीछे की थाली रॉक.
    8. 5% सीओ 2 में, 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 से 4 घंटे के लिए सेते हैं और अगले कदम के लिए बाद में तुरंत आगे बढ़ना. नोट: ये अभिकर्मक स्थितियों के लिए एकल उपयुक्त हैं जो रिसेप्टर घनत्व <0.45 कण / माइक्रोन 2, प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया है अणु इमेजिंग. विभिन्न कक्षों, निर्माणों या अभिकर्मकों का उपयोग करते समय समायोजन आवश्यक हो सकता है.
  4. प्रोटीन लेबलिंग
    1. 1 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 10% FBS के साथ पूरक 1 मिलीलीटर DMEM/F12 मध्यम में फ्लोरोफोरे-बीजी शेयर समाधान के 1 μl पतला. इनक्यूबेटर से ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ले और prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस के साथ दो बार धोने. 1 माइक्रोन फ्लोरोफोरे-बीजी समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ पीबीएस बदलें और एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
    2. ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं तीन धोने10% FBS के साथ पूरक DMEM/F12 मध्यम के साथ कई बार, हर बार 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा चिमटी के साथ (लेबल की कोशिकाओं के साथ) एक coverslip लो और एक इमेजिंग चैम्बर में जगह.
    3. 300 μl इमेजिंग बफर के साथ दो बार धोएं. ताजा इमेजिंग बफर के 300 μl जोड़ें और इमेजिंग (भाग 2) के लिए तुरंत आगे बढ़ें.

2. छवि अधिग्रहण

नोट: एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति एक तेल विसर्जन उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्य (. जैसे, 100X magnification/1.46 संख्यात्मक एपर्चर), उपयुक्त पराबैंगनीकिरण (जैसे, 405 एनएम, 488 एनएम, 561 एनएम और 645 से लैस (TIRF) माइक्रोस्कोप, का प्रयोग करें एनएम लेजर डायोड), एक इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज कपल्ड डिवाइस (EMCCD) कैमरा, एक मशीन और एक फ्लोरोसेंट अणु कल्पना करने के लिए एक तापमान नियंत्रण.

  1. वांछित माइक्रोस्कोप मापदंडों, यानी निर्धारित करें., लेजर लाइन, TIRF कोण (इस पैरामीटर penetra नियंत्रित करता हैक्षणभंगुर क्षेत्र की tion गहराई), जोखिम समय, फ्रेम दर और फिल्म 10 प्रति छवियों की संख्या. तापमान drifts और नमी संक्षेपण से बचने के लिए हमेशा पर हीटर / इनक्यूबेटर और तापमान नियंत्रण रखें.
  2. माइक्रोस्कोप के 100X उद्देश्य पर विसर्जन के तेल की एक बूंद रखो. माइक्रोस्कोप का नमूना धारक पर लेबल की कोशिकाओं के साथ इमेजिंग चैम्बर रखें, और brightfield रोशनी का उपयोग ध्यान में कोशिकाओं को ले आओ.
  3. TIRF रोशनी में बदलें. लेकिन एक ही समय में वांछित सेल के लिए खोज photobleaching को कम करने की अनुमति देने के लिए जितना संभव हो कम लेजर शक्ति रखें.
  4. वांछित कक्ष का चयन करें और ठीक ध्यान समायोजित करें. एकल fluorophores के दृश्य की अनुमति देता है के लिए लेजर सत्ता स्थापित. छवि अनुक्रम प्राप्त और. झगड़ा के रूप में कच्चे छवि अनुक्रम फ़ाइल सहेजें.

3. कैलिब्रेशन (ग्लास और Monomeric / dimeric रिसेप्टर नियंत्रण पर सिंगल fluorophores)

  1. प्रत्येक अंशांकन कॉम्पैक्ट इकट्ठाइमेजिंग कक्ष में 1.2 में वर्णित के रूप में ई तैयार. माइक्रोस्कोप पर प्रत्येक नमूना प्लेस और एक भी कदम नोट में ब्लीच कि अच्छी तरह से अलग विवर्तन सीमित धब्बे युक्त नमूना चुनें:. इन स्थानों फ्लोरोसेंट डाई के एकल अणुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं.
  2. चरण 2 में वर्णित के रूप में TIRF छवि दृश्यों मोल महत्वपूर्ण:. एक ही इमेजिंग मापदंडों जांच के लिए लोगों सहित सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  3. 4.2 - का पता लगाने और 4.1 में विस्तृत रूप में ट्रैकिंग विश्लेषण करते हैं. 4.2.6 में वर्णित के रूप में प्रत्येक कण की तीव्रता निकालें. इन आंकड़ों से, मतलब (μ) और एकल fluorophores की तीव्रता का मानक विचलन (σ) की गणना.
  4. वैकल्पिक: एक मोनोमेरिक सेल सतह रिसेप्टर (. जैसे, CD86) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पर ही विश्लेषण करते हैं, एन टर्मिनली तस्वीर 10 में से एक या दो या तो प्रतियां के साथ टैग और फ्लोरोफोरे-बीजी व्युत्पन्न के साथ लेबल. Folloकांच पर एक fluorophore के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया डब्ल्यू. Calebiro, डी. एट अल में वर्णित के रूप में लेबलिंग दक्षता का अनुमान है. 10

4. छवि विश्लेषण

  1. छवि अनुक्रम तैयारी
    1. छवियों फसल के लिए एक इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (जैसे., ImageJ) का प्रयोग करें.
    2. अलग रूप में व्यक्तिगत तख्ते सहेजें. झगड़ा छवियों को एक नए फ़ोल्डर में, प्रत्येक छवि फ्रेम नंबर पर संकेत है.
    3. एक सेल की समोच्च साथ ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र ड्राइंग और ImageJ में माप उपकरण या किसी अन्य सॉफ्टवेयर में एक इसी तरह के उपकरण का उपयोग करके कोशिका की सतह क्षेत्र को मापने. कोशिका की सतह क्षेत्र से फिल्म की शुरुआत में कणों की कुल संख्या से विभाजित करके कण घनत्व की गणना करने के लिए इस मान का उपयोग करें.
  2. कण का पता लगाने और ट्रैकिंग
    नोट: Matlab में काम कर रहा है, ऐसे U-13 ट्रैक के रूप में गैर वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का प्रयोग करेंस्वचालित रूप से पता लगाने और एक रिसेप्टर कणों को ट्रैक करने के लिए पर्यावरण,.
    नोट: U-ट्रैक एल्गोरिथ्म कई परिकल्पना ट्रैकिंग दृष्टिकोण पर आधारित है. यह दृष्टिकोण एक फ्रेम में एक भी कण, अगले फ्रेम में एक भी कण से मेल खाती है प्रकट होता है, गायब हो जाता है या / अन्य कणों से / के साथ विभाजन विलीन हो जाती है कि व्यक्ति संभावनाओं आवंटित कर रहे हैं जहां लागत matrices, निर्माण से फ्रेम के बीच कणों लिंक. विश्व स्तर पर लागत को कम करता है कि समाधान, अर्थात्., सबसे अधिक संभावना के साथ एक, अंत में चयन किया गया है. यह भी एक अस्थायी रूप से गायब कण, फ्लोरोफोरे निमिष की वजह से एक विशिष्ट घटना पर नज़र रखने की अनुमति देता है. U-ट्रैक (2.1.0) का नवीनतम संस्करण इन विश्लेषण के निष्पादन की सुविधा है कि ग्राफिक यूजर इंटरफेस है.
    1. फिल्म चयन इंटरफ़ेस खोलने के लिए matlab कमान शीघ्र से, प्रकार "movieSelectorGUI". एक बनाने के लिए निर्देशों का पालन करेंपहले से बचाया अलग छवियों से नये मूवी डेटाबेस (4.1.2 देखें).
    2. कण का पता लगाने और ट्रैकिंग के लिए आवश्यक पिक्सेल आकार एनएम में, सेकंड में समय अंतराल, संख्यात्मक एपर्चर, कैमरा थोड़ा गहराई और फ्लोरोफोरे के उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य प्रदान करते हैं. मूवी डेटाबेस बचाओ.
    3. फिल्म चयन इंटरफ़ेस से, वस्तुओं के प्रकार के रूप में "एक कण" का चयन, विश्लेषण चला. कण का पता लगाने और ट्रैकिंग के लिए इस्तेमाल किया मानकों में परिभाषित किया जा सकता है, जहां एक नई विंडो दिखाई देगा. डिफ़ॉल्ट मापदंडों के साथ शुरू करो. . का पता लगाने और / या ट्रैकिंग की गुणवत्ता वैकल्पिक (जैसे, कुछ कणों का पता लगाया या पटरियों खंडित कर रहे हैं नहीं कर रहे हैं) संतोषजनक नहीं है तो बाद में, इन मापदंडों को समायोजित: ट्रैकिंग सेटिंग के तहत, स्टोर करने के लिए "मैट्रिक्स प्रारूप करने के लिए निर्यात ट्रैकिंग के परिणाम" जाँच "trackedFeaturedInfo नामक एक मैट्रिक्स (क्षेत्र में निर्देशांक और सभी कणों के आयाम"). इन मानकों में से एक विस्तृत वर्णन के लिए, U-ट्रैक दस्तावेज को देखें.
    4. पता लगाने एल्गोरिथ्म चलाएँ. इस एल्गोरिथ्म स्वचालित रूप से प्रत्येक विवर्तन सीमित जगह स्थानीय तीव्रता Maxima चारों ओर माइक्रोस्कोप की बात फैल समारोह के बराबर मानक विचलन के साथ एक दो आयामी गाऊसी समारोह फिटिंग द्वारा (यानी., एकल रिसेप्टर्स / रिसेप्टर परिसरों) की पृष्ठभूमि से ऊपर स्थान और तीव्रता का निर्धारण . फिर, ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म चलाते हैं. एक. चटाई फ़ाइल में विश्लेषण के परिणाम की दुकान.
    5. पटरियों कल्पना और पता लगाने और ट्रैकिंग की गुणवत्ता की जांच करने के लिए U-ट्रैक पैकेज में निहित "movieViewer" दिनचर्या, या इसी तरह कस्टम वालों का प्रयोग करें.
    6. प्रत्येक फ्रेम में पता लगाया कणों की स्थिति और आयाम (यानी., तीव्रता) को देखने के लिए. चटाई फ़ाइल खोलें. कदम 4.2.4 में उत्पन्न डेटा tracksFinal की गिरफ्तारी के tracksCoordAmpCG क्षेत्र में समाहित कर रहे हैंरे और / या trackedFeaturedInfo में. कणों की कुल संख्या से 4.1.3 में मापा कोशिका की सतह क्षेत्र से इस मूल्य विभाजित कण घनत्व की गणना का पता चला.
    7. वैकल्पिक: कण रिसेप्टर कणों की गति का विश्लेषण करने के लिए (4.2.6 देखें) समय के साथ निर्देशांक का उपयोग. Matlab या इसी तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग मतलब वर्ग विस्थापन (एमएसडी) और प्रसार गुणांक (डी) की गणना. प्रत्येक कण और हर समय अंतराल (Δ टी) के लिए विचार, निम्न सूत्र का उपयोग मतलब वर्ग विस्थापन (एमएसडी) गणना:
      1 समीकरण
      Δ टी फ्रेम में समय अंतराल है जहां, एन विश्लेषण किया कदम की संख्या है, एक्स और वाई कण के एक्स और वाई सूचकांक ने संकेत दिया फ्रेम में समन्वय कर रहे हैं. रैखिक रिश्ते: एक दिया कण की गति के प्रकार का मूल्यांकन करने के लिए समय भूखंडों अधिक एमएसडी का प्रयोग करेंमुक्त प्रसार (यानी., ब्राउनियन गति), एक सकारात्मक वक्रता से संकेत मिलता है (यानी., वक्र एक परवलय की तरह दिखता है) निर्देशित गति से पता चलता है, एक नकारात्मक वक्रता सीमित प्रस्ताव 14 का सूचक है. आज़ादी diffusing कणों के मामले में, निम्न समीकरण के साथ प्राप्त एमएसडी डेटा फिटिंग द्वारा प्रत्येक कण के प्रसार गुणांक (डी) गणना:
      2 समीकरण
  3. गाऊसी फिटिंग विधि के साथ कण आकार की गणना
    नोट: अंशांकन नमूने (कांच और / या fluorescently लेबल मोनोमेरिक रिसेप्टर्स पर एक fluorophores) की तीव्रता वितरण में जाना जाता है, एक बार रिसेप्टर परिसरों का आकार निर्धारित करने के लिए एक छवि अनुक्रम की शुरुआत में कण तीव्रता के वितरण पर एक मिश्रित गाऊसी फिट प्रदर्शन (यानी., कण प्रति रिसेप्टर्स की संख्या) 10. Matlab या एस का उपयोग कर इन विश्लेषण प्रदर्शनimilar सॉफ्टवेयर.
    1. तीव्रता में पहला परिवर्तन (कारण photobleaching के लिए ज्यादातर मामलों में कमी) होने से पहले फ्रेम करने के लिए पहली फ्रेम से कण की तीव्रता औसत से प्रत्येक कण की तीव्रता की गणना.
    2. निम्नलिखित समीकरण अनुसार एक मिश्रित गाऊसी फिटिंग कार्य करें:
      3 समीकरण
      φ (मैं) कणों मैं तीव्रता होने की आवृत्ति है, एन घटक संख्या है, α n घटक n की ऊंचाई के लिए योगदान देता है कि एक पैरामीटर है जहां, μ और σ मतलब और संदर्भ एकल fluorophores की तीव्रता का मानक विचलन कर रहे हैं . (चरण 3 में वर्णित के रूप में गणना) नोट: टी का निर्धारण करेंएक एफ परीक्षण द्वारा न्याय के रूप में वह उत्तरोत्तर एक घटक के अलावा जब तक एन मैक्स में वृद्धि से प्रत्येक छवि अनुक्रम के लिए घटकों (एन मैक्स) के लिए अधिक से अधिक संख्या में नहीं रह गया है, एक सांख्यिकीय बेहतर फिटिंग का उत्पादन करता है.
    3. वैकल्पिक: (. जैसे, एक 400 फ्रेम अनुक्रम के पिछले 60 फ्रेम) फिल्म के अंतिम फ्रेम पर प्राप्त तीव्रता वितरण पर एक मिश्रित गाऊसी फिट प्रदर्शन करना. उन मानकों के लिए परिष्कृत अनुमान प्रदान जो इस फिटिंग के बाद प्राप्त मूल्यों, और दोहराने कदम 4.3.2 के साथ μ और σ बदलें.
    4. मिश्रित गाऊसी फिट के प्रत्येक घटक की वक्र (नीलामी) के तहत क्षेत्र की गणना. विभिन्न आकार पूरे वितरण की नीलामी से प्रत्येक घटक की नीलामी मूल्य विभाजित करके (यानी, monomer, डिमर, trimer, आदि) के रिसेप्टर कणों के रिश्तेदार बहुतायत की गणना.
    5. वैकल्पिक: विभिन्न कोशिकाओं और विभिन्न आकार के कणों के साथ वितरण कण घनत्व 10 के साथ जोड़ा जाता है जहां भूखंडों उत्पन्न करने के लिए (4.2.6 में वर्णित के रूप में गणना) इसी कण घनत्व से डेटा का उपयोग करें.
  4. कदम फिटिंग विधि के साथ कण आकार की गणना
    नोट: रिसेप्टर परिसरों 10 के आकार का निर्धारण करने के लिए एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में एक कदम ढाले विश्लेषण का प्रयोग करें. n fluorophores युक्त इस प्रकार के कणों उत्तरोत्तर ब्लीच n कदम के साथ एक तीव्रता प्रोफाइल उत्पादन की उम्मीद कर रहे हैं - इस विश्लेषण के आधार के अपने तात्कालिक लापता होने में एक भी फ्लोरोफोरे परिणामों के प्रकाश प्रेरित विनाश (photobleaching) है.
    1. U-ट्रैक या इसी तरह का पता लगाने / ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर (4.2.6 देखें) द्वारा उत्पन्न की. चटाई फ़ाइल से प्रत्येक कण की तीव्रता प्रोफाइल को निकालें.
    2. इस तरह प्रस्तुत एक के रूप में, एक कदम ढाले कलन विधि का प्रयोग करेंरेफरी में. 10, प्रत्येक कण के लिए विरंजन कदम की संख्या गिनने के लिए.
    3. वैकल्पिक: (4.3 देखें) विभिन्न आकार के रिसेप्टर कणों के रिश्तेदार बहुतायत दिखा वितरण पैदा करते हैं और पहले से मिश्रित गाऊसी फिटिंग के परिणामों के लिए वर्णित के रूप में कण घनत्व के साथ उन्हें सहसंबंधी परिणामों का उपयोग करें.

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल अलग झिल्ली प्रोटीन की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है. एक उदाहरण के रूप में, β 2 एड्रीनर्जिक और GABA बी रिसेप्टर्स के साथ प्राप्त की प्रतिनिधि परिणाम 10 रिपोर्ट कर रहे हैं. एकल अणुओं से फ्लोरोसेंट संकेत कमजोर कर रहे हैं, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के न्यूनतम सफल परिणाम के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम है. इस प्रकार, यह बड़े पैमाने पर साफ coverslips (2A चित्रा) का उपयोग करने के साथ ही नमूना autofluorescence (जैसे., फिनोल लाल स्वतंत्र मीडिया का उपयोग करके) को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. अगले कदम के लिए एक fluorophore अणुओं के प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण करने के लिए है. यह एक साफ coverslip (चित्रा 2 बी) पर देखा एकल fluorophores इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है. आमतौर पर, की fluorophore एक धारावाहिक कमजोर पड़ने, विश्लेषण के लिए सबसे अच्छी स्थिति का चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है यानी., अच्छी तरह से अलग और समान रूप से वितरित एकल fluorophores पैदा करता है कि एकाग्रता. अपर आगेROLS मोनोमेरिक नियंत्रण प्रोटीन इमेजिंग द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है, जैसे., एक fluorophore-बीजी व्युत्पन्न के साथ लेबल झपकी में चिह्नित CD86 रिसेप्टर्स. इन प्रारंभिक नियंत्रण और अंशांकन प्रदर्शन किया गया है एक बार, असली प्रयोगों शुरू कर सकते हैं. चित्रा 3 ए 2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स β तस्वीर में चिह्नित और एक fluorophore-बीजी व्युत्पन्न के साथ लेबल के साथ ट्रांसफ़ेक्ट सेल के एक ठेठ TIRF छवि अनुक्रम का पहला फ्रेम से पता चलता है. स्पॉट एकल रिसेप्टर्स या रिसेप्टर परिसरों का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस छवि को भी स्वचालित पहचान और ट्रैकिंग के लिए एक उपयुक्त कण घनत्व को दर्शाता है -. हमारे अनुभव के अनुसार, / माइक्रोन गरीब ट्रैकिंग गुणवत्ता और 10 से बचा जाना चाहिए में 2 परिणाम 0.45 कणों ऊपर घनत्व चित्रा 3B उसी के लिए लागू पता लगाने एल्गोरिथ्म के परिणामों से पता चलता है छवि अनुक्रम. प्रत्येक ब्लू सर्किल एक का पता चला कण इंगित करता है. ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म के परिणाम, चित्रा -3 सी में रिपोर्ट कर रहे हैंनीले splines व्यक्तिगत कणों के trajectories का प्रतिनिधित्व है. प्रत्येक कण के trajectories तो उनके प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह विधि भी दो कणों जाहिरा तौर पर एक क्षणिक बातचीत से गुजरना जहां चित्रा 3 डी में दिखाया गया है गतिशील घटनाओं पर कब्जा करने की अनुमति देता है. 4 चित्रा दो अलग GPCRs, IE के लिए मापा प्रसार गुणांक के वितरण से पता चलता है., 2 एड्रीनर्जिक और GABA बी रिसेप्टर्स β. विश्लेषण के इस प्रकार हमें GABA बी रिसेप्टर्स के एक बड़े अंश स्थिर है या बहुत कम गतिशीलता 10 है कि दिखाने के लिए अनुमति दी. मिश्रित गाऊसी फिटिंग और कदम ढाले विश्लेषण जीवित कोशिकाओं की सतह (चित्रा 5) पर रिसेप्टर परिसरों के आकार का एक सटीक मात्रा का ठहराव प्रदान करते हैं. यह विश्लेषण भी जैसे, जटिल वितरण प्रकट कर सकते हैं., Monomers और dimers की सह - अस्तित्व चित्रा 5A के उदाहरण के रूप में दिखाया.आंकड़े 5 ब और 5C एक या दो कदम और सही ढंग से क्रमश: मोनोमेरिक और dimeric रिसेप्टर्स के रूप में उन्हें सौंपा कि इसी कदम ढाले विश्लेषण में विरंजन कणों के दो उदाहरण देते हैं.

चित्रा 1
इस प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में एक ठेठ एकल अणु प्रयोग के चित्रा 1. कार्यप्रवाह. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. Coverslip सफाई और अंशांकन नमूने की तैयारी. (ए)व्यापक coverslip सफाई से पहले और बाद की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की तुलना. Coverslips TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे. (बी) साफ coverslips पर देखा एक fluorophore-बीजी व्युत्पन्न की बढ़ती सांद्रता के TIRF चित्र. स्केल बार:. 10 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. ठेठ एकल अणु छवियों और पहचान / ट्रैकिंग एल्गोरिदम का परिणाम है. (ए) 2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स β तस्वीर में चिह्नित और एक fluorophore-बीजी व्युत्पन्न के साथ लेबल के साथ ट्रांसफ़ेक्ट चो कोशिकाओं TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना कर रहे थे. अधिग्रहीत छवि अनुक्रम का पहला फ्रेम दिखाया गया है. स्केल बार:. 5 माइक्रोन (बी)0; पता लगाया कणों मूल छवि के शीर्ष पर नीले हलकों से संकेत कर रहे हैं (सी) एक ही छवि अनुक्रम में ट्रैकिंग एल्गोरिथ्म के आवेदन से उत्पन्न trajectories एक सफेद पृष्ठभूमि पर दिखाए जाते हैं.. स्नैपशॉट फ्रेम नहीं पर स्थिति से मेल खाती है. 35. ग्रीन क्षेत्रों, घटनाओं विलय. लाल क्षेत्रों, बंटवारे घटनाओं. (डी) दो रिसेप्टर कणों से प्राप्त प्रतिनिधि trajectories (नीले और हरे रंग, क्रमशः), एक स्पष्ट क्षणिक बातचीत (लाल) के दौर से गुजर. दो कणों कई फ्रेम के लिए कदम एक साथ, विलय, और फिर अलग हो गए. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
रिसेप्टर MOBILI की चित्रा 4. विश्लेषणTy. व्यक्तिगत कणों के trajectories उनके प्रसार गुणांक की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. इस उदाहरण में, दो अलग GPCRs के लिए गणना प्रसार गुणांक के वितरण की सूचना दी. GABA बी रिसेप्टर्स गतिशीलता सीमित है जबकि β 2 एड्रीनर्जिक रिसेप्टर्स कोशिका की सतह पर तेजी से पार्श्व प्रसार की विशेषता है. Calebiro, डी. एट अल. 10 से संशोधित

चित्रा 5
रिसेप्टर परिसरों के आकार का आंकड़ा 5. विश्लेषण. (ए) रिसेप्टर परिसरों का आकार ठीक एक मिश्रित गाऊसी मॉडल के साथ कण तीव्रता का वितरण ढाले से अनुमान लगाया जा सकता है. सूचना दी उदाहरण 2 drenergic रिसेप्टर्स β तस्वीर में चिह्नित व्यक्त एक सेल करने के लिए इस विश्लेषण के आवेदन से पता चलता है. फिटिंग दो सी से पता चलता हैomponents: एकल fluorophores की तीव्रता को इसी एक (अंशांकन नमूने की है कि करने के साथ ही नमूने की आंशिक विरंजन के बाद प्राप्त वितरण के लिए काफी हद तक superimposable, यहाँ दिखाया गया है) और लगभग दोगुना तीव्रता के साथ एक. दो घटकों क्रमशः monomers और dimers, के रूप में सौंपा जा सकता है, और दो ​​घटकों के अधीन क्षेत्रों मोनोमेरिक और dimeric रिसेप्टर्स के रिश्तेदार बहुतायत का अनुमान किया जा सकता है. एक कदम में एक मोनोमेरिक रिसेप्टर कण विरंजन (बी) उदाहरण. (सी विशेषता दो कदम विरंजन के साथ एक Dimeric रिसेप्टर कण) उदाहरण. (बी) और (सी) में लाल लाइनों कदम ढाले एल्गोरिथ्म के परिणाम हैं. चित्रा Calebiro, डी. एट अल से संशोधित किया गया था. 10 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल एकल अणु के स्तर पर स्थानिक व्यवस्था, गतिशीलता और सेल सतह रिसेप्टर परिसरों के आकार का विश्लेषण की अनुमति देता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपयोग की तुलना में, उज्जवल और अधिक photostable हैं जो छोटे कार्बनिक fluorophores, साथ लेबलिंग, एक रिसेप्टर कणों की विस्तारित दृश्य की अनुमति का लाभ दिया है. बेहद कम अभिव्यक्ति के स्तर हासिल कर रहे हैं (<0.45 रिसेप्टर कणों / माइक्रोन 2), रिसेप्टर्स और अन्य झिल्ली प्रोटीन के गुणों को शारीरिक लोगों से अधिक नहीं है कि घनत्व का विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, एगोनिस्ट 10 या अन्य जोड़तोड़ के साथ रिसेप्टर उत्तेजना का प्रभाव, उदाहरण के लिए एक रोग स्थिति reproducing के उद्देश्य से, विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, के कारण तस्वीर / क्लिप टैग 11,12 साथ लेबलिंग रणनीति के लचीलेपन के लिए, विभिन्न fluorophores एक की विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार किया जा सकता है - ज़ाहिर, तस्वीर का संयोजनऔर क्लिप टैग दो रंग प्रयोगों, जैसे प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है., दो बातचीत प्रोटीन के बीच colocalization निरीक्षण करने के लिए. अंत में, इस प्रोटोकॉल अलग सेल, अभिकर्मक तरीकों और रणनीतियों लेबलिंग का उपयोग करके उदाहरण के लिए, कई जगहों पर संशोधित किया जा सकता है.

महत्वपूर्ण कदम बेहद कम अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए (बड़े पैमाने पर साफ coverslips, फिनोल लाल मुक्त मीडिया और फ़िल्टर समाधान का उपयोग करके) पृष्ठभूमि और autofluorescence के न्यूनतम, (अभिकर्मक के बाद जैसे., प्लाज्मिड डीएनए की मात्रा और समय) अभिकर्मक शर्तों का अनुकूलन शामिल , कुशल लेबलिंग और एक उज्ज्वल और पर्याप्त photostable फ्लोरोफोरे की पसंद है. सेल autofluorescence दृश्य स्पेक्ट्रम और 550 एनएम ऊपर आमतौर पर लगभग नगण्य के नीले / हरी भाग में अधिक है क्योंकि fluorophore के चुनाव के संबंध में, दूर की लाल / लाल वालों आमतौर पर बेहतर परिणाम दे. विशेष रूप से ध्यान photobleaching के बचने के लिए भुगतान किया जाना चाहिएएक उपयुक्त सेल और ध्यान समायोजन के लिए खोज के दौरान fluorophores. कांच coverslips पर देखा fluorophores के साथ ही मोनोमेरिक और dimeric रिसेप्टर नियंत्रण के साथ नमूने (जैसे., CD86 एक या दो या तो तस्वीर के साथ टैग) 10 विश्लेषण जांचना और लेबलिंग दक्षता की जांच करने के लिए विचार किया जाना चाहिए.

इस दृष्टिकोण की सीमा वर्तमान में प्राप्त किया जा सकता है कि spatiotemporal संकल्प पर काफी हद तक निर्भर हैं. यह ज्यादातर एक फ्लोरोफोरे से और साथ ही इस्तेमाल किया कैमरा की संवेदनशीलता और अधिग्रहण की गति से एकत्र फोटॉनों की संख्या तय करती है. (- 300 एनएम तुलना के लिए पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प के बारे में 200 है) 30 एनएम - एक एकल, पता लगाया कण का स्थानीयकरण परिशुद्धता के लिए विशिष्ट मूल्यों में 20 हैं. (- 8 एनएम के बारे में 2) इन मूल्यों को अभी भी एक ठेठ झिल्ली प्रोटीन की वास्तविक आकार से बड़े होते हैं. रिसेप्टर्स माइक्रो के विवर्तन सीमा से नीचे दूरी पर गिरने के बादगुंजाइश (लगभग 200-300 एनएम) एक कण के रूप में पहचान कर रहे हैं, उचित नियंत्रण और सांख्यिकीय विश्लेषण सच रिसेप्टर रिसेप्टर बातचीत 8-10 की संख्या से यादृच्छिक colocalizations (झूठी सकारात्मक) घटाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए के साथ अधिक से अधिक अधिग्रहण दर प्राप्त. वर्तमान EMCCD कैमरों 1 कम से कम फसल मोड में KHz, (यानी., सेंसर का केवल एक हिस्सा इस्तेमाल किया जाता है) को पार कर सकते हैं. हालांकि, अधिग्रहण की गति भी कैमरा तक पहुँचने कि एक एकल फ्लोरोफोरे द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या सीमित है. अभ्यास में, कम से कम 10 की जोखिम बार - 20 मिसे आम तौर पर आवश्यक हैं. इस कारण से, ठेठ अधिग्रहण की गति 10 और 50 हर्ट्ज, अर्थात् के बीच बदलती हैं., एक फ्रेम हर 20-100 मिसे. फ्लोरोफोरे डिजाइन, ऑप्टिकल घटकों और पहचान प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में भविष्य के घटनाक्रम आगे अणु तरीकों के spatiotemporal संकल्प को बढ़ाने के लिए अनुमति हो सकती है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform AppliChem GmbH A1585 CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen
NaOH Sigma-Aldrich S8045 CAUTION: strong base and highly corrosive reagent
Absolute ethanol Sigma-Aldrich 32205
Glass coverslip  Marienfeld-Superior 111640 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness
0.2 mm sterile filter Sarstedt 83.1826.001
CHO cells ATCC, USA ATCC CCL-61 Chinese hamster ovary cell line
6-well cell culture plate Nunc 140675
DMEM/F-12 medium GIBCO, Life Technologies 11039-021 Phenol-red free medium
Fetal bovine serum  Biochrom S 0115
Penicillin - streptomycin  Pan Biotech GmbH P06-07 100
Trypsin-EDTA Pan Biotech GmbH P10-23100
Lipofectamine 2000 Invitrogen, Life Technologies 11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Invitrogen, Life Technologies 31985-047
Fluorophore-conjugated benzylguanine  New England BioLabs S9136S SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C.
DMSO AppliChem GmbH A1584
Imaging buffer: 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered
    NaCl AppliChem GmbH A1371
    KCl AppliChem GmbH A3582
    CaCl2 AppliChem GmbH A2303
    MgCl2 AppliChem GmbH A3618
    HEPES AppliChem GmbH A3724
Imaging chamber Molecular Probes, Life Technologies A-7816 Attofluor Cell Chamber, for microscopy
TIRF-M Leica Model: DMI6000B
TIRF objective Leica 11 506 249  HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR 
EM-CCD camera  Roper Scientific Photometrics Cascade 512B
Temperature controller Pecon Tempcontrol 37-2 digital
ImageJ software NIH, USA http://rsbweb.nih.gov/ij
u-track software Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA http://lccb.hms.harvard.edu/software.html
Matlab software The MathWorks, USA

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 89 औषध विज्ञान माइक्रोस्कोपी रिसेप्टर जीना सेल इमेजिंग अणु कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति ट्रैकिंग dimerization प्रोटीन प्रोटीन बातचीत
एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रिसेप्टर गतिशीलता के उच्च संकल्प Spatiotemporal विश्लेषण
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Sungkaworn, T., Rieken, F., Lohse, M. J., Calebiro, D. High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (89), e51784, doi:10.3791/51784 (2014).

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