Abstract
Enda molekyl mikroskopi framstår som en kraftfull metod för att analysera beteendet hos signalmolekyler, särskilt när det gäller sådana aspekter (t ex., Kinetik, samexistens mellan olika stater och befolkningar, transienta interaktioner), som normalt är dolda i ensemblemätningar, till exempel de som erhålls med standard biokemiska eller mikroskopiska metoder. Således, dynamiska händelser, såsom receptor-receptorinteraktioner, kan följas i realtid på en levande cell med hög Spatiotemporal upplösning. Detta protokoll beskriver en metod som bygger på märkning med små och ljusa organiska fluoroforer och total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi för att direkt visualisera enstaka receptorer på ytan av levande celler. Detta tillvägagångssätt gör att man kan exakt lokalisera receptorer, mäta storleken på receptorkomplex, och fånga dynamiska händelser såsom övergående receptor-receptorinteraktioner. Protokollet ger en detaljerad beskrivning av hur man perform en enda molekyl experiment, inklusive provberedning, bildtagning och bildanalys. Som ett exempel på tillämpningen av denna metod analysera två G-proteinkopplade receptorer, dvs., Β 2-adrenerga och γ-aminosmörsyra typ B (GABA B)-receptorn, har rapporterats. Protokollet kan anpassas till andra membranproteiner och olika cellmodeller, transfektionsmetoder och märkningsstrategier.
Introduction
Receptorer belägna på cellytan avkänna den extracellulära miljön och svara på en mängd olika stimuli, såsom doftämnen, joner, små signalsubstanser och stora proteinhormoner. Den flytande karaktär av cellmembran tillåter rörelser receptorer och andra membranproteiner. Detta är viktigt för bildningen av proteinkomplex och förekomsten av transienta protein-proteininteraktioner, såsom de som används av receptorer för att montera in i funktionella enheter och omvandla signaler till cellens inre. Till exempel, G-proteinkopplade receptorer (GPCRs), som utgör den största familjen av receptorer på cellytan 1, har föreslagit att bilda di-/oligomers, som verkar vara inblandade i finjusteras regleringen av signalöverföring och kan ha viktiga fysiologiska och farmakologiska konsekvenser 2-5.
Enda molekyl mikroskopi har stor potential för direkt visualisering med hög spatiotemporal upplösning det dynamiska beteendet hos enskilda receptorer på ytan av levande celler, inklusive deras förening för att bilda dimerer och högre ordningens molekylkomplex 6-10. Detta har flera fördelar jämfört med vanliga biokemiska och mikroskopimetoder, som vanligtvis rapporterar den genomsnittliga beteendet hos tusentals eller miljontals molekyler.
Protein märkning med tillräckligt ljus och fotostabil fluorofor är viktigt för enda molekyl mikroskopi. Detta protokoll tar fördel av det nyligen introducerade SNAP-tagg 11 för att kovalent fästa små och ljusa organiska fluoroforer till cellytereceptorer. SNAP är ett 20 kD-protein tag härledd från det humana DNA-reparationsenzym O 6-alkylguanin-DNA-alkyltransferas, som kan irreversibelt märkt med fluorofor-konjugerad bensylguanin (fluorofor-BG)-derivat. CLIP, en ytterligare engineered taggen härledd från SNAP, kan i stället märkt med fluorofor-conjugated benzylcytosine derivat 12.
Det protokoll som rapporteras i detta manuskript förklarar hur att transfektera och etikett SNAP-tagged 11 receptorer med små organiska fluoroforer och använder total intern reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi för att visualisera enstaka receptorer eller receptorkomplex på ytan av levande celler 10. De rapporterade protokoll resultat i> 90% märkningseffektivitet av ett extracellulärt SNAP-tagged cellytprotein 10. Ytterligare information om hur du använder enda molekyl data för att analysera storleken och rörlighet för receptorkomplex, samt att fånga upp övergående receptor-receptorinteraktioner, lämnas. Ett schematiskt arbetsflödet för hela protokollet ges i figur 1. Som ett exempel transfektion av ovarialceller från kinesisk hamster (CHO)-celler med SNAP-etikette G-proteinkopplade receptorer (GPCR), följt av märkning med en fluorofor-BG-derivat som samt dess tillämpning på quantify och monitor receptor di-/oligomerization beskrivs. Detta protokoll kan utvidgas till andra cellytan proteiner och fluorescerande taggar (t.ex.., CLIP), liksom till andra transfektion och märkningsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provberedning
- Cover rengöring
OBS: Arbete under en huv.- Använd rena pincett för att placera täckglas (24 mm diameter) i en täckhållare som skiljer enskilda täckglas.
- Placera hållaren med täckglas i en bägare, och lägga kloroform tills täckglas är täckta. Täck bägaren med aluminiumfolie för att minska avdunstning och sonikera i en badsonikator under 1 h vid RT. Ta täckhållaren ur bägaren och låt täckglasen torka.
- Upprepa steg 1.1.2 med 5 M NaOH-lösning i stället för kloroform.
- Ta täckhållaren i en ny bägare och tvätta tre gånger med destillerat vatten. Sätt rengjorda täckglas i en glascellodlingsplatta fylldes med 100% etanol.
- Framställning av kalibreringsprov
- Lös fluorescerande färg i lämpligt lösningsmedel.
- Bered en 1:10 serieutspädning av det fluorescerande färgämnet i intervalletfrån 13:00 till 1 nM i filtersteriliserad (0,22 um) vatten.
- Ta rengjorda täckglas som är lagrade i 100% etanol och tvätta med filtersteriliserad vatten. Spot 20 l av varje fluorescerande färg utspädning på en separat rengjorda täckglas. Låt täckglasen torka under en steril huva. Skydda täckglasen från ljus och damm fram till användning. Använd dessa prover för att uppskatta intensiteten av enstaka fluorescerande molekyler (se steg 3).
- Transfektion
- Kultur CHO-celler i 01:01 Dulbeccos modifierade Eagles medium / näringsblandning F-12 (DMEM/F12) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin vid 37 ° C, i . 5% CO 2 Anmärkning Använd fenol-röd fria medier under hela experimentet för att minimera autofluorescens.
- Ta rengjorda täckglas från 100% etanol-lösning, tvätta dem med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och placera ett täckglas i varje brunn i en 6-brunnars cellodlings plåt.
- Trypsinize, räkna och utsäde CHO-celler vid en densitet av 3 x 10 5 celler / brunn i 6-brunnars cellodlingsplatta innehållande täckglas. Låt cellerna växer i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) under 24 timmar för att uppnå ca. 80% sammanflytning, vilket är den optimala celldensiteten för transfektion.
- Till varje brunn, utspädd 2 pg av det önskade plasmid-DNA (t. ex., SNAP-tagged β 2-adrenerga receptorn) och 6 | il Lipofectamine 2000 i två separata rör innehållande 500 ^ il OptiMEM medium. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Kombinera lösningarna från steg 1.3.4 till ett rör och blanda för att få en transfektion blandning. Inkubera transfektion blandningen vid RT under 20 min.
- Under inkubationen (1.3.5), ta CHO-cellerna och tvätta två gånger med förvärmd (37 ° C) PBS. Ersätt PBS med 1 ml / brunn i fenolrött-fritt DMEM/F12 medium kompletterat med 10% FBS, men ingen antibiotika.
- Lägg hela transfekteraion blandning (1 ml) från steg 1.3.5 droppvis till varje brunn, och försiktigt vicka plåten fram och tillbaka en fullständig blandning.
- Inkubera i 2 till 4 timmar vid 37 ° C i 5% CO2 och fortsätt omedelbart efteråt till nästa steg. OBS: Dessa transfektion villkor har optimerats för att uppnå receptortäthet <0,45 partikel / ìm 2, som är lämpliga för en- molekyl avbildning. Justeringar kan krävas vid användning av olika celler, konstruktioner eller reagens.
- Protein märkning
- Späd 1 pl av fluorofor-BG stamlösning i 1 ml DMEM/F12 medium kompletterat med 10% FBS för att erhålla en slutlig koncentration av 1 pM. Ta de transfekterade cellerna från inkubatorn och tvätta två gånger med förvärmd (37 ° C) PBS. Ersätt PBS med 1 ml av 1 pM fluorofor-BG-lösning och inkubera under 20 min vid 37 ° C 5% CO2 i en inkubator.
- Efter inkuberingen tvättas cellerna tregånger med DMEM/F12 medium kompletterat med 10% FBS, varje gång följt av 5 minuters inkubation vid 37 ° C. Ta ett täckglas (med märkta celler) med pincett och placera det i en avbildning kammare.
- Tvätta två gånger med 300 | il bildåtergivningsbuffert. Lägg till 300 l av färsk imaging buffert och omedelbart gå till bildbehandling (del 2).
2. Image Acquisition
OBS: Använd en total inre reflektion fluorescens (TIRF) mikroskop, utrustad med en oljeimmersions hög numerisk apertur mål (t.ex. 100X magnification/1.46 numerisk bländare.), Lämpliga lasrar (t.ex. 405 nm, 488 nm, 561 nm och 645 nm diodlasrar), en elektron multiplicera laddningskopplad enhet (EMCCD) kamera, en inkubator och en temperaturkontroll för att visualisera enstaka fluorescerande molekyler.
- Ställ in önskade mikroskop parametrar, dvs., Laserlinje, TIRF vinkel (denna parameter styr penetrationsning djup försvinnande fält), exponeringstid, bildhastighet och antal bilder per film 10. Förvara värmaren / inkubator-och temperaturkontroll alltid på för att undvika temperatur drivor och kondens.
- Sätt en droppe immersionsolja på 100X målet med mikroskop. Placera avbildning kammare med de märkta cellerna på preparathållaren i mikroskop, och få cellerna i fokus med bright belysning.
- Växla till TIRF belysning. Håll lasereffekt så lite som möjligt för att möjliggöra att söka efter den önskade cellen men samtidigt minimera fotoblekning.
- Välj önskad cell och fin justera fokus. Ställ in lasereffekten till en nivå som tillåter visualisering av enstaka fluoroforer. Förvärva bildsekvens och spara rå bildsekvensfilen som. Tiff.
3. Kalibrering (Single Fluoroforer på Glas och Monomera / dimera receptor Controls)
- Montera varje kalibrerings sample framställd som beskrivits i 1.2 i avbildning kammaren. Placera varje prov på mikroskopet och välja det prov som innehåller väl separerade diffraktionsbegränsad fläckar som blekmedel i ett enda steg. OBS: Dessa fläckar representerar enstaka molekyler av det fluorescerande färgämnet.
- Förvärva TIRF bildsekvenser som beskrivs i steg 2. Viktigt: samma avbildningsparametrarna måste användas för alla experiment, även de för kalibrering.
- Utför upptäckt och spårning analys som beskrivs i 4,1-4,2. Extrahera intensiteten av varje partikel såsom beskrivits i 4.2.6. Från dessa data beräkna medelvärdet (μ) och standardavvikelse (σ) av intensiteten av enkel fluoroforer.
- Tillval: utföra samma analys på celler transfekterade med en monomer cellytereceptor (. T.ex., CD86), N-terminalt märkta med antingen en eller två kopior av SNAP 10 och märkta med fluoroforen-BG-derivat. Follow det förfarande som beskrivs ovan för den enda fluoroforen på glas. Uppskatta märkningseffektiviteten såsom beskrivits i Calebiro, D. et al. 10
4. Bildanalys
- Image sekvens beredning
- Använd ett bildbehandlingsprogram (t.ex.., ImageJ) att beskära bilderna.
- Spara enskilda bildrutor som separat. TIFF-bilder i en ny mapp, vilket tyder på varje bild ramnumret.
- Mät cellytan genom att ett område av intresse (ROI) längs konturen av en cell och använda mått verktyg i ImageJ eller liknande verktyg i en annan programvara. Använd detta värde för att beräkna partikeldensitet genom att dividera det totala antalet partiklar i början av filmen av cellens ytarea.
- Partikel upptäckt och spårning
OBS: Använd icke-kommersiella program som u-spår 13, som arbetar i Matlabmiljö, för att automatiskt upptäcka och spåra enskilda receptorpartiklar.
ANMÄRKNING: u-track algoritm är baserad på fler hypotes spårning tillvägagångssätt. Detta tillvägagångssätt länkar partiklar mellan ramar genom att bygga kostnads matriser, där de enskilda sannolikheter att en viss partikel i en ram motsvarar en viss partikel i nästa bildruta, visas, försvinner eller går samman / delar med / från andra partiklar har tilldelats. Den lösning som globalt minimerar kostnaderna, dvs., Den med högsta sannolikhet, slutligen väljs. Detta gör också att spåra ett tillfälligt försvinna partikel, ett typiskt fenomen som orsakas av fluorofor blinkar. Den senaste versionen av u-spår (2.1.0) har grafiska användargränssnitt som underlättar genomförandet av dessa analyser.- Från Matlab kommandotolken skriver "movieSelectorGUI" för att öppna filmen val gränssnittet. Följ instruktionerna för att skapa ennya filmdatabas från tidigare sparade separata bilder (se 4.1.2).
- Tillhandahålla pixelstorleken i nm, tidsintervallet i sekunder, numerisk öppning, kamera bitars djup och emissionsvåglängd av fluoroforen som krävs för partikeldetektering och spårning. Spara filmdatabas.
- Från film val gränssnittet, kör analysen, välja "single-partiklar" som typ av objekt. Ett nytt fönster visas där kan definieras de parametrar som används för partikel upptäckt och spårning. Börja med de ursprungliga inställningarna. Senare justera dessa parametrar om kvaliteten på upptäckt och / eller spårning är inte tillfredsställande (till exempel, är några partiklar som inte upptäcks eller spår är fragmenterad) Tillval:. Under spårningsinställningar, kolla "Exportera spårningsresultat till matrisformat" för att lagra koordinaterna och amplituderna hos alla partiklar i en matris (fält som kallas "trackedFeaturedInfo"). För en detaljerad beskrivning av dessa parametrar, se u-spåret dokumentation.
- Kör detekteringsalgoritmen. Denna algoritm automatiskt bestämma placeringen och intensitet över bakgrunden av varje diffraktion-begränsad plats (dvs., Enstaka receptorer / receptorkomplex) genom att montera en tvådimensionell Gaussfunktion med standardavvikelse lika med punktspridningsfunktionen av mikroskopet kring lokala intensitetsmaxima . Kör sedan spårningsalgoritmen. Lagra analysresultaten i ett. Matta fil.
- Använd "movieViewer" rutin, som finns i u-track-paketet, eller liknande anpassade dem att visualisera spår och kontrollera kvaliteten på upptäckt och spårning.
- Öppna. Mattan-filen för att se positionen och amplitud (dvs.., Intensitet) av de spårade partiklarna vid varje bildruta. Data som genereras i steg 4.2.4 finns i tracksCoordAmpCG fält tracksFinal arstråle och / eller i trackedFeaturedInfo. Från det totala antalet partiklar detekterades beräkna partikeldensiteten dividera detta värde med den cell ytarea mätt vid 4.1.3.
- Tillval: Använd partikeln samordnar över tiden (se 4.2.6) för att analysera rörelsen av receptorpartiklarna. Beräkna de genomsnittliga kvadratiska förskjutningar (MSD) och diffusionskoefficienter (D) med hjälp av Matlab eller liknande programvara. För varje partikel och varje tidsintervall (Δ t) betraktas, beräkna medelkvadrat förskjutning (MSD) med användning av följande formel:
där Δ t är tidsintervallet i ramar, N är antalet steg som analyseras, x och y är partikelns x-och y-koordinater i ram som anges av index. Använd MSD över olika tids tomter för att utvärdera den typ av rörelse hos en given partikel: Linjära relationerindikera fri diffusion (dvs., Brownsk rörelse), en positiv krökning (dvs.., ser kurvan ut som en parabel) föreslår riktad rörelse, är en negativ krökning tyder på begränsad rörelse 14. Vid fritt diffunderande partiklar, beräkna diffusionskoefficienten (D) hos varje partikel genom att montera de erhållna MSD-datan med hjälp av följande ekvation:
- Beräkning av partikelstorlek med Gauss passande metod
OBS: När intensitetsfördelningen av kalibreringsprover (enstaka fluoroforer på glas och / eller fluorescerande monomera receptorer) är känd, utföra en blandad Gaussisk passform på fördelningen av partikelnivåer i början av en bildsekvens för att bestämma storleken på receptorkomplex (dvs.. antalet receptorer per partikel) 10. Utför dessa analyser med hjälp av Matlab eller similar programvara.- Beräkna intensiteten hos varje partikel genom medelvärdesbildning av intensiteten av den partikel från den första ramen med ramen innan den första ändringen i intensitet inträffade (i de flesta fall en minskning på grund av fotoblekning).
- Utför en blandad Gaussisk montering enligt följande ekvation:
där φ (i) är frekvensen hos partiklar med intensitet i, n är den komponent nummer, α n är en parameter, som bidrar till höjden av komponent n, μ och σ är medelvärdet och standardavvikelsen för intensiteten av referensenkel fluoroforer . (beräknat som beskrivs i steg 3) OBS: Bestäm than maximalt antal komponenter (N Max) för varje bildsekvensen genom att progressivt öka nmax tills tillsatsen av en komponent ger inte längre producerar en statistiskt bättre montering, såsom bedömdes genom en F-test. - Tillval: (. T.ex. de senaste 60 bildrutor i en 400 ram sekvens) Utför en blandad Gaussisk passform på intensitetsfördelning som erhålls på de sista bildrutorna i filmen. Byt μ och σ med de värden som erhölls efter denna koppling, som ger förfinade uppskattningar för dessa parametrar, och upprepa steg 4.3.2.
- Beräkna arean under kurvan (AUC) för varje komponent i den blandade Gaussisk passform. Beräkna den relativa förekomsten av receptor partiklar av olika storlek (dvs monomer, dimer, trimer, etc.) genom att dividera den av AUC-värdet för varje komponent av AUC för hela fördelningen.
- Tillval: Använd data från olika celler och motsvarande partikeltäthet (beräknat enligt beskrivningen i 4.2.6) för att generera tomter där fördelningen av partiklar med olika storlek är korrelerade med partikeldensitet 10.
- Beräkning av partikelstorlek med steg passande metod
OBS: Använd en steg-montering analys som en alternativ metod för att bestämma storleken på receptorkomplex 10. Grunden för denna analys är att den ljusinducerad förstörelse (fotoblekning) i en enda fluorofor resultat i dess momentana försvinnande - alltså partiklar som innehåller n fluoroforer förväntas successivt bleka fram en intensitetsprofil med n steg.- Utdrag intensitetsprofiler för varje partikel från. Mattan fil som genereras av u-spår eller liknande upptäckt / mjukvara (se 4.2.6).
- Använd ett steg passande algoritm, såsom den som presenterasi ref. 10, för att räkna antalet av blekningssteg för varje partikel.
- Tillval: använda resultaten för att skapa distributioner som visar den relativa förekomsten av receptor partiklar av olika storlek och korrelera dem med partikeldensitet som tidigare beskrivits för resultaten av den blandade Gauss montering (se 4.3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrivna protokollet kan tillämpas på ett flertal olika membranproteiner. Som ett exempel är representativa resultat erhållna med β 2-adrenerga och GABA-B-receptorer rapporterats 10. Eftersom fluorescerande signaler från enskilda molekyler är svaga, är minimering av bakgrundsfluorescens det första viktigt steg för framgångsrika resultat. Således är det viktigt att använda utför rengjorda täckglas (figur 2A) och för att minimera prov autofluorescens (t. ex. Genom användning av fenolröttfritt media). Nästa steg är att bestämma fluorescensintensiteten av enstaka fluoroforenheter molekyler. Detta kan göras genom att avbilda enkel fluoroforer fläckvis på ett rent täckglas (figur 2B). Normalt är en seriespädning av fluoroforen används för att välja de bästa förutsättningarna för analysen, dvs., Den koncentration som ger väl separerade och jämnt fördelade enskilda fluoroforer. Ytterligare fortsrols kan utföras genom avbildning monomera kontrollproteiner, t ex., NAP-märkt CD86-receptorer märkta med en fluorofor-BG-derivat. När dessa preliminära kontroller och kalibrering har utförts, kan de verkliga experimenten börja. Figur 3A visar den första bilden av en typisk TIRF bildsekvens av en cell transfekterad med SNAP-märkt β 2-adrenerga receptorer och märkt med en fluorofor-BG-derivat. Fläckarna representerar enstaka receptorer eller receptorkomplex. Bilden visar också en lämplig partikeldensitet för automatiserad upptäckt och spårning -. Enligt vår erfarenhet, densiteter över 0,45 partiklar / um 2 resultat i dålig spårning kvalitet och bör undvikas 10 Figur 3B visar resultaten av detekteringsalgoritmen appliceras på samma bildsekvens. Varje blå cirkel indikerar en upptäckt partikel. Resultaten av spårningsalgoritmen redovisas i fig. 3C,där de blå räfflorna representerar banorna för de individuella partiklarna. De banor varje partikel kan sedan användas för att beräkna sina diffusionskoefficienter. Denna metod gör det också möjligt att fånga dynamiska händelser såsom visas i fig. 3D, där två partiklar undergår uppenbarligen en transient växelverkan. Figur 4 visar fördelningen av diffusionskoefficienter mättes för två olika GPCR: er, dvs., Β 2-adrenerga-och GABA-B-receptorer. Denna typ av analys tillät oss att visa att en stor del av GABA-B receptorer är orörliga eller har en mycket låg mobilitet 10. Den blandade Gaussisk montering och steg sittande Analyserna ger en exakt kvantifiering av storleken på receptorkomplex på ytan av levande celler (Figur 5). Denna analys kan också avslöja komplexa distributioner, till exempel., Samexistensen mellan monomerer och dimerer som visas i exemplet i figur 5A.Figurerna 5B och 5C ge två exempel på partiklar blekning i ett eller två steg och motsvarande steg lutande analys som korrekt tilldelat dem som monomera och dimeriska receptorer, respektive.
Figur 1. Workflow av en typisk enda molekyl experiment som beskrivs i detta protokoll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cover rengöring och beredning av kalibreringsprov. (A)Jämförelse av bakgrunden fluorescens före och efter omfattande täck rengöring. Täckglasen avbildas av TIRF mikroskopi. (B) TIRF bilder av ökande koncentrationer av en fluorofor-BG-derivat fläckvis på rengjorda täckglas. Skala bar:. 10 mikrometer Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Typiska enda molekyl bilder och resultat för upptäckt / spårningsalgoritmer. (A) CHO-celler transfekterade med SNAP-märkt β 2-adrenerga receptorer och märkt med en fluorofor-BG-derivat visualiserades med TIRF mikroskopi. Visas är den första bilden i det förvärvade bildsekvensen. Skala bar:. 5 m (B)0; Upptäckta partiklar anges med blå cirklar ovanpå den ursprungliga bilden (C) De banor som följer av tillämpningen av spårningsalgoritmen till samma bildsekvens visas på en vit bakgrund.. Ögonblicksbilden motsvarar situationen vid ram nr. 35. Gröna segment, fusionerande händelser. Röda segment, delning händelser. (D) Representativa banor från två receptorpartiklar (blått och grönt, respektive), genomgår en uppenbar övergående interaktion (röd). De båda partiklarna samman, flytta ihop i flera ramar, och dela igen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Analys av receptor mobiliTy. banorna för enskilda partiklar används för att beräkna sina diffusionskoefficienter. I detta exempel är de fördelningar av diffusionskoefficienter beräknas för två olika GPCR rapporterats. β 2-adrenerga receptorer kännetecknas av snabb lateral diffusion på cellytan, under det att GABA-B-receptorer har begränsad rörlighet. Modifierad från Calebiro, D. et al. 10
Figur 5. Analys av storleken av receptorkomplex. (A) Storleken på receptorkomplex kan exakt beräknas genom att montera de fördelningar av partikelnivåer med en blandad Gaussisk modell. Det rapporterade exempel visar tillämpningen av denna analys till en cell som uttrycker SNAP-tagged β 2-drenergic receptorer. Beslaget avslöjar två components: en som motsvarar intensiteten av enstaka fluoroforer (i stort sett överlagrings den i kalibreringsprover samt fördelningen erhålls efter partiell blekning av provet, som visas här) och en med ungefär dubbel intensitet. De två komponenterna kan tilldelas som monomerer och dimerer, respektive, och de områden under de två komponenterna kan användas för att uppskatta den relativa förekomsten av monomera och dimeriska receptorer. (B) Exempel på en monomer receptor partikel blekning i ett steg. (C ) Exempel på en dimer receptor partikel med den karakteristiska två-stegsblekning. De röda linjerna i (B) och (C) är en följd av det steg-passande algoritm. Figuren modifierades från Calebiro, D. et al. 10 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet kan analys av det rumsliga arrangemanget, rörlighet och storleken av cellytreceptor komplexen vid enda molekyl nivå. Jämfört med användning av fluorescerande proteiner, märkning med små organiska fluoroforer, som är ljusare och mer fotostabila, har fördelen att tillåta utvidgad visualisering av enstaka receptorpartiklar. Eftersom extremt låga nivåer uppnås (<0.45 receptor partiklar / ìm 2), egenskaper receptorer och andra membranproteiner kan analyseras vid densiteter som inte överstiger fysiologiska sådana. Dessutom är effekterna av receptorstimulering med agonister 10 eller andra manipulationer, exempelvis i syfte att reproducera en patologisk situation kan analyseras. Dessutom, på grund av flexibiliteten i strategin märkning med SNAP / CLIP taggar 11,12, olika fluoroforer kan användas i enlighet med sina specifika behov - Märkbart, kombinationen av SNAPoch CLIP-taggar kan användas för att utföra två-färgexperiment, t ex., att observera colocalization mellan två interagerande proteiner. Slutligen kan detta protokoll modifieras på flera ställen, till exempel genom användning av olika celler, transfektion metoder och märkningsstrategier.
Kritiska steg inkluderar minimering av bakgrunden och autofluorescens (med hjälp av omfattande rengjorda täckglas, fenol-röd fria medier och filtrerade lösningar), optimering av transfektion förhållanden (t.ex.., Mängden plasmid-DNA och tid efter transfektion) till mycket låga nivåer , effektiv märkning och valet av en ljus och tillräckligt fotostabila fluorofor. När det gäller valet av fluoroforen, röd / långt röda sådana brukar ge bättre resultat eftersom cell autofluorescens är högre i den blå / gröna delen av det synliga spektrumet och oftast nästan försumbar över 550 nm. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt att undvika fotoblekning avfluoroforema under sökandet efter en lämplig cell och fokusjustering. Prover med fluoroforer spotted på täckglas samt monomera och dimera receptor kontroller (t ex., CD86 med antingen en eller två SNAP-taggar) 10 bör övervägas för att kalibrera analysen och kontrollera effektiviteten märkning.
Gränserna för denna metod är till stor del beroende av den spatiotemporal upplösning som kan för närvarande uppnås. Detta är främst dikteras av antalet fotoner som samlats in från en fluorofor samt av känsligheten och upptagningshastighet av den kamera som används. Typiska värden för lokalisering precision av ett enda, upptäckt partikel är 20-30 nm (som jämförelse den rumsliga upplösningen i konventionell fluorescensmikroskopi är omkring 200 till 300 nm). Dessa värden är ännu större än den verkliga storleken av ett typiskt membranprotein (ca 2-8 nm). Eftersom receptorer som faller på ett avstånd under diffraktionsgränsen av mikroräckvidd (ca 200-300 nm) detekteras som en enda partikel, bör lämpliga kontroller och statistiska analyser användas för att dra ifrån slump colocalizations (falska positiva) från antalet sanna receptor-receptorinteraktioner 8-10 Maximal förvärvsfrekvens uppnås med. nuvarande EMCCD kameror kan överstiga 1 KHz, åtminstone i beskärningsläge (dvs., är bara en del av sensorn som används). Emellertid är förvärvet hastighet begränsas också av antalet fotoner som sänds ut av en enstaka fluorofor som når kameran. I praktiken exponeringstider av åtminstone 10 - som behövs generellt 20 msek. Därför typiska förvärvsHastigheten varierar mellan 10 och 50 Hz, dvs., En ram var 20 till 100 ms. Framtida utveckling inom fluoroforen konstruktion, optiska komponenter och detektionsteknik kan tillåta att ytterligare öka spatiotemporal upplösning enda molekyl metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
