Abstract
Single-molekyle mikroskopi fremstår som en stærk metode til at analysere adfærden for signalmolekyler, navnlig vedrørende de aspekter (f.eks., Kinetik, sameksistens mellem forskellige stater og befolkninger, forbigående interaktioner), som typisk skjult i ensemble målinger, såsom dem, der opnås med standard biokemiske eller mikroskopi metoder. Således dynamiske begivenheder, såsom receptor-receptor-vekselvirkninger, kan følges i realtid i en levende celle med høj Spatiotemporal opløsning. Denne protokol beskriver en metode baseret på mærkning med små og lyse organiske fluoroforer og total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi til direkte at visualisere enkelte receptorer på overfladen af levende celler. Denne tilgang gør det muligt at præcist at lokalisere receptorer, måle størrelsen af receptor komplekser, og fange dynamiske begivenheder såsom forbigående receptor-receptor interaktioner. Protokollen giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan perform et enkelt molekyle eksperiment, herunder prøveforberedelse, billede erhvervelse og billedanalyse. Som et eksempel på anvendelsen af denne metode analysere to G-protein-koblede receptorer, dvs., Β 2-adrenerge og γ-aminosmørsyre type B (GABA B)-receptoren, er rapporteret. Protokollen kan tilpasses til andre membranproteiner og forskellige cellemodeller, transfektionsmetoder og mærkning strategier.
Introduction
Receptorer på celleoverfladen fornemmer det ekstracellulære miljø og svare til en række stimuli, såsom duftstoffer, ioner, små neurotransmittere og store protein hormoner. Den flygtige natur cellemembraner tillader bevægelser af receptorer og andre membranproteiner. Dette er afgørende for dannelsen af protein-komplekser og forekomsten af transiente protein-protein interaktioner, såsom dem der anvendes af receptorerne til at samle i funktionelle enheder og transducere signaler ind i cellens indre. For eksempel, G-protein-koblede receptorer (GPCR), som udgør den største familie af celleoverfladereceptorer 1, er blevet foreslået at danne di-/oligomers, hvilket synes at være involveret i finjusteret regulering af signaltransduktion og måske har vigtige fysiologiske og farmakologiske konsekvenser 2-5.
Single-molekyle mikroskopi har det store potentiale i direkte visualisere med høj spatiotemporal opløsning dynamiske opførsel af individuelle receptorer på overfladen af levende celler, herunder deres tilknytning til at danne dimerer og højere orden molekylære komplekser 6-10. Dette giver flere fordele i forhold til standard biokemiske og mikroskopi-metoder, som normalt indberette de gennemsnitlige opførsel af tusinder eller millioner af molekyler.
Protein mærkning med et tilstrækkeligt lyse og fotostabilt fluorofor er afgørende for enkelt molekyle mikroskopi. Denne protokol drager fordel af nyligt indførte SNAP tag 11 til kovalent vedhæfte små og lyse organiske fluorforer til celleoverfladereceptorer. SNAP er en 20 kD-protein tag afledt fra det humane DNA-reparation enzym O 6-alkylguanin-DNA alkyltransferase, som kan irreversibelt mærket med fluorophor-konjugeret benzylguanin (fluorofor-BG) derivater. CLIP, et yderligere manipuleret tag afledt fra SNAP kan i stedet forsynes med fluorofor-conjugated benzylcytosine derivater 12.
Protokollen rapporteret i dette manuskript forklarer, hvordan at transficere og mærke SNAP-mærket 11 receptorer med små organiske fluoroforer og bruge total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi for at visualisere enkelte receptorer eller receptor-komplekser på overfladen af levende celler 10. De rapporterede protokol resulterer i> 90% mærkning effektiviteten af et ekstracellulært SNAP-mærket celleoverfladeprotein 10. Yderligere oplysninger om, hvordan du bruger enkelt-molekyle data til at analysere størrelse og mobilitet receptor komplekser, samt at fange forbigående receptor-receptor interaktioner, er forudsat. En skematisk workflow hele protokollen er givet i fig. 1. Som et eksempel transfektion af kinesisk hamsterovarie (CHO) celler med SNAP-mærket G-protein-koblede receptorer (GPCR'er), efterfulgt af mærkning med en fluorophor-BG derivat som samt dens anvendelse i quantify og monitor receptor di-/oligomerization beskrives. Denne protokol kan udvides til andre celleoverfladeproteiner og fluorescerende mærker (f.eks., CLIP), såvel som til andre transfektions og mærkningsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Prøveforberedelse
- Coverslip rengøring
BEMÆRK: Arbejdet under en emhætte.- Brug rene pincet til at placere dækglas (24 mm diameter) i et dækglas holder, der adskiller de enkelte dækglas.
- Sæt holderen med dækglas i et bæger, og tilføje chloroform indtil dækglas dækket. Bægerglasset dækkes med aluminiumfolie for at reducere fordampning og sonikeres i et bad-sonikator i 1 time ved stuetemperatur. Tag dækglasset indehaveren ud af bægeret, og lad dækglas tørre.
- Gentag trin 1.1.2 med 5M NaOH-opløsning i stedet for chloroform.
- Tag dækglasset holderen i en ny bægerglas og vaskes tre gange med destilleret vand. Put rengjorte dækglas i et glas celledyrkningsplade fyldt med 100% ethanol.
- Fremstilling af standardopløsninger prøver
- Fluorescerende farvestof opløses i passende opløsningsmiddel.
- Forbered en 1:10 seriel fortynding af det fluorescerende farvestof spænderfra 1:00 til 1 nM i filtersteriliseret (0,22 um) vand.
- Tag rengjorte dækglas gemt i 100% ethanol og vask med filter-steriliseret vand. Spot 20 pi af hver fluorescerende farvestof fortynding på en separat renset dækglas. Lad dækglassene tørre under en steril hætte. Beskyt dækglassene fra lys og støv indtil anvendelse. Brug disse prøver til at vurdere intensiteten af enkelte fluorescerende molekyler (se trin 3).
- Transfektion
- Kultur CHO-celler i 01:01 Dulbeccos modificerede Eagle-medium / næringsblanding F-12 (DMEM/F12) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin ved 37 ° C i . 5% CO 2 BEMÆRK: Brug phenol-rød frie medier i hele eksperimentet for at minimere autofluorescens.
- Tag rengjorte dækglas fra 100% ethanol opløsning, vaske dem med steril phosphatpufret saltopløsning (PBS), og placer en dækglas i hver brønd af en 6 godt cellekultur plspiste.
- Trypsinisér, tælle og frø CHO-celler med en tæthed på 3 x 10 5 celler / brønd i 6-brønds cellekultur plade indeholdende dækglassene. Lad cellerne vokser i en inkubator (37 ° C, 5% CO2) i 24 timer for at opnå ca. 80% sammenflydning, hvilket er den optimale celledensitet for transfektion.
- For hver brønd, fortyndes 2 ug af det ønskede plasmid-DNA (f.eks., SNAP-mærket β 2-adrenerg receptor) og 6 pi Lipofectamine 2000 to separate rør indeholdende 500 pi OptiMem medium. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
- Kombiner løsningerne fra trin 1.3.4 i et rør og bland for at opnå en transfektion blanding. Inkubér transfektion blandingen ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Under inkubationen (1.3.5), at CHO-cellerne og vaskes to gange med forvarmet (37 ° C) PBS. Udskift PBS med 1 ml / brønd af phenolrødfri DMEM/F12 medium suppleret med 10% FBS, men ingen antibiotika.
- Føj hele transficereion-blanding (1 ml) fra trin 1.3.5 dråbevis til hver brønd, og vip den forsigtigt pladen frem og tilbage for at sikre fuldstændig blanding.
- Der inkuberes i 2 til 4 timer ved 37 ° C i 5% CO2 og fortsætte umiddelbart derefter til næste trin BEMÆRK:. Disse transfektion betingelser er blevet optimeret for at opnå receptor densiteter <0,45 partikel / um 2, som er egnet til enkelt- molekyle billeddannelse. Justeringer kan være påkrævet, når der anvendes forskellige celler, konstruktioner eller reagenser.
- Protein mærkning
- Fortyndes 1 ml af fluorofor-BG stamopløsning i 1 ml DMEM/F12 medium suppleret med 10% FBS for at opnå en slutkoncentration på 1 uM. Tag de transficerede celler fra inkubatoren og vaskes to gange med forvarmet (37 ° C) PBS. Udskift PBS med 1 ml af 1 uM fluorofor-BG-opløsning og inkuberes i 20 minutter ved 37 ° C 5% CO2 i en inkubator.
- Efter inkubation vaskes cellerne tregange med DMEM/F12 medium suppleret med 10% FBS, hver gang efterfulgt af 5 minutters inkubation ved 37 ° C. Tag et dækglas (med mærkede celler) med pincet og læg det i en imaging kammer.
- Vaskes to gange med 300 pi billeddannelse buffer. Tilføj 300 pi frisk imaging buffer og fortsæt straks imaging (del 2).
2.. Image Acquisition
BEMÆRK: Brug et total indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskop, er udstyret med en olieimmersionsobjektiv høj numerisk blænde (f.eks 100X magnification/1.46 numeriske blænde.), Egnede lasere (f.eks 405 nm, 488 nm, 561 nm og 645 nm diodelasere), en elektron multiplicere afgift koblet enhed (EMCCD) kamera, en inkubator og en temperatur kontrol for at visualisere enkelte fluorescerende molekyler.
- Indstil de ønskede mikroskop parametre, dvs., Laser linje, TIRF vinkel (dette parameter styrer penetreringtion dybde flygtige felt), eksponeringstid, frame rate og antallet af billeder pr film 10. Hold varmelegeme / inkubatoren og temperaturkontrol altid på at undgå temperatur driver og kondens.
- Put en dråbe fordybelse olie på 100X mål for mikroskopet. Placer imaging kammer med de mærkede celler på modellen indehaveren af mikroskop, og bringe cellerne i fokus ved hjælp lysfelt belysning.
- Skift til TIRF belysning. Hold laserenergi så lavt som muligt, således at søge efter den ønskede celle, men samtidig minimere fotoblegning.
- Vælg den ønskede celle og fine justere fokus. Indstil laser magt til et niveau, der giver mulighed for visualisering af enkelte fluorophores. Anskaf billede sekvens og gemme RAW-billede sekvens fil som. Tiff.
3.. Kalibrering (Single Fluoroforer på glas og Monomere / dimeriske Receptor Controls)
- Saml hver kalibrering sample fremstillet som beskrevet i 1.2 i imaging kammer. Placer hver prøve på mikroskopet og vælge den prøve, der indeholder godt adskilte diffraktionsbegrænset pletter, blege i et enkelt trin BEMÆRK:. Disse pletter repræsenterer enkelte molekyler af det fluorescerende farvestof.
- Anskaf TIRF billedsekvenser som beskrevet i trin 2 Vigtigt:. De samme imaging parametre skal anvendes til alle eksperimenter, herunder dem til kalibrering.
- Udfør detektering og sporing analyse som beskrevet i 4,1-4,2. Uddrag intensiteten af hver partikel som beskrevet i 4.2.6. Ud fra disse data beregne middelværdien (μ) og standardafvigelse (σ) af intensiteten af enkelte fluoroforer.
- Valgfrit: udfører den samme analyse på celler transficeret med en monomer celleoverfladereceptor (. F.eks CD86), N-terminalt mærket med enten et eller to eksemplarer af SNAP 10 og mærket med fluoroforen-BG-derivat. Follow den ovenfor beskrevne procedure for det indre fluoroforen på glas. Vurdere mærkningen effektivitetsfordele som beskrevet i Calebiro, D. et al. 10.
4.. Image Analysis
- Billede sekvens forberedelse
- Brug et billedbehandlingsprogram software (f.eks., ImageJ) at beskære billederne.
- Gem enkelte billeder som adskilte. TIFF-billeder i en ny mappe, med angivelse på hvert billede stelnummeret.
- Måle cellens overfladeareal ved at trække et område af interesse (ROI) langs konturen af en celle og anvendelse af foranstaltningen værktøj ImageJ eller et lignende værktøj i en anden software. Brug denne værdi til at beregne partikeldensitet ved at dividere det samlede antal partikler i starten af filmen af cellen overfladeareal.
- Følsom sporing og sporing
BEMÆRK: Brug ikke-kommerciel software såsom u-spor 13, der arbejder i Matlabmiljø, til automatisk at detektere og spore enkelt receptor partikler.
BEMÆRK: u-track algoritme er baseret på multiple-hypotesen sporing tilgang. Denne tilgang forbinder partikler mellem rammer ved at bygge billige matricer, hvor de enkelte sandsynligheder, at en given partikel i en ramme svarer til en given partikel i den næste frame, fremkommer, forsvinder eller fusionerer / deler med / fra andre partikler er tildelt. Den løsning, der globalt minimerer omkostningerne, dvs., Den ene med den højeste sandsynlighed, er endeligt valgt. Dette giver også spore en midlertidigt forsvinde partikel, et typisk fænomen forårsaget af fluorophor blinke. Den seneste version af u-spor (2.1.0) har grafiske brugergrænseflader, som letter udførelsen af disse analyser.- Fra Matlab kommandoprompten skal du skrive "movieSelectorGUI" for at åbne film markering interface. Følg vejledningen for at oprette ennye film database ud fra de tidligere gemte separate billeder (se 4.1.2).
- Give pixelstørrelse i nm, tidsinterval i sekunder, numerisk blænde, kamera bit dybde og emission bølgelængde fluoroforen, der kræves til påvisning og sporing partikel. Gemme filmen databasen.
- Fra filmen valg af interface, køre analysen, vælge "single-partikler" som type af objekter. Et nyt vindue vises, hvor kan defineres de parametre, der anvendes til detektering og sporing partikel. Begynd med standardparametre. Senere justere disse parametre, hvis kvaliteten af påvisning og / eller sporing ikke er tilfredsstillende (fx er nogle partikler ikke fundet eller spor er fragmenteret) Valgfrit:. Under tracking-indstillingerne, tjek "Export trackingresultater til matrix-format" for at gemme koordinater og amplituder af alle partikler i en enkelt matrix (felt, der kaldes "trackedFeaturedInfo"). For en detaljeret beskrivelse af disse parametre, se dokumentationen til u-track.
- Kør afsløring algoritme. Denne algoritme bestemme automatisk placering og intensitet over baggrund af hver diffraktionsbegrænset plet (dvs.. Enlige receptorer / receptor komplekser) efter montering af en todimensional Gaussisk funktion med standardafvigelse lig med punktspredningsfunktion mikroskopet omkring lokale intensitet maksima . Kør derefter tracking algoritme. Gemme resultaterne af analyserne i en. Mat-fil.
- Brug "movieViewer" rutine, der er indeholdt i u-track-pakke eller lignende tilpassede dem til at visualisere sporene og kontrollere kvaliteten af detektion og sporing.
- Åbn. Måtten filen for at se position og amplitude (dvs.., Intensitet) af de sporede partikler ved hver ramme. Data genereret i trin 4.2.4 er indeholdt i tracksCoordAmpCG inden for tracksFinal array og / eller i trackedFeaturedInfo. Af det samlede antal partikler detekteret beregner partikeltætheden dividere denne værdi med cellens overfladeareal målt ved 4.1.3.
- Valgfrit: Brug partiklen koordinater over tid (se 4.2.6) for at analysere bevægelse af receptoren partikler. Beregne middelværdien firkantede forskydninger (MSD) og diffusionskoefficienter (d) brug af Matlab eller lignende software. For hver partikel, og hvert tidsinterval (Δ t) i betragtning, beregne middelværdien på forskydningen (MSD) ved hjælp af følgende formel:
hvor Δ t er tidsintervallet i rammer, N er antallet af trin analyseres, x og y er partiklens x-og y-koordinaterne på rammen angivet ved indekset. Brug MSD med tiden plots at vurdere typen af bevægelse af en given partikel: Lineære relationerangive fri diffusion (dvs.., Brownsk bevægelse), en positiv krumning (dvs.., kurven ligner en parabel) antyder rettet bevægelse, en negativ krumning er tegn på begrænset bevægelse 14. I tilfælde af frit spredende partikler, beregner diffusionskoefficienten (D) af hver partikel ved at montere de opnåede MSD data med følgende ligning:
- Beregning af partikelstørrelse med Gaussisk montagemetode
BEMÆRK: Når intensiteten fordeling af kalibreringsprøver (enkelt fluoroforer på glas og / eller fluorescens-mærkede monomere receptorer) er kendt, udføre en blandet gaussisk pasform om fordelingen af partikel intensiteter ved begyndelsen af en billedsekvens til at bestemme størrelsen af receptor komplekser (dvs.. antallet af receptorer pr partikel) 10. Udfør disse analyser ved brug af Matlab eller similar software.- Beregn intensiteten af hver partikel ved at tage gennemsnittet af intensiteten af partiklen fra den første ramme til rammen, før den første ændring i intensitet indtraf (i de fleste tilfælde et fald på grund af fotoblegning).
- Udfør en blandet gaussisk Beslag ifølge følgende ligning:
hvor φ (i) er frekvensen af partikler med intensiteten I, n er den komponent nummer, α n er et parameter, der bidrager til højden af komponenten n, μ og σ er middelværdien og standardafvigelsen af intensiteten af reference enkelte fluoroforer . (beregnet som beskrevet i trin 3) BEMÆRK: Bestem than maksimale antal komponenter (n max) for hvert billede sekvens af gradvis stigende n max, indtil tilsætningen af en komponent ikke længere frembringe en statistisk bedre montering, som bedømt ved en F-test. - Valgfrit: (. Fx de sidste 60 billeder af en 400 frame sekvens) Udfør en blandet gaussisk pasform på intensiteten fordeling opnås på de sidste billeder fra filmen. Udskift μ og σ med de værdier, der er opnået efter denne montering, som giver raffinerede estimater for disse parametre, og gentag trin 4.3.2.
- Beregne arealet under kurven (AUC) for hver komponent i det blandede gaussisk pasform. Beregne den relative overflod af receptor partikler af forskellig størrelse (dvs. monomer, dimer, trimer, etc.) ved at dividere AUC for hver komponent af AUC for hele fordelingen.
- Valgfrit: Brug data fra forskellige celler og de tilsvarende partikeldensiteter (beregnet som beskrevet i 4.2.6) til at generere plots, hvor fordelingen af partikler med forskellig størrelse er korreleret med partikel tæthed 10.
- Beregning af partikelstørrelse med trin montering metode
BEMÆRK: Brug et trin-montering analyse som en alternativ metode til at bestemme størrelsen af receptor komplekser 10. Grundlaget for denne analyse er, at lyset-induceret destruktion (fotoblegning) af en enkelt fluoroforen resultater i sit øjeblikkelige forsvinden - dermed partikler indeholdende n fluorophores forventes gradvist blege producerer en intensitet profil med n trin.- Uddrag intensitet profiler af hver partikel fra. Måtten fil genereret af u-spor eller lignende afsløring / tracking software (se 4.2.6).
- Brug en trin-fitting algoritmen, som den præsenteresi ref. 10, for at tælle antallet af blegning trin for hver partikel.
- Valgfrit: bruge resultaterne til at generere distributioner, der viser den relative overflod af receptor partikler af forskellig størrelse og korrelere dem med partikel tæthed som tidligere beskrevet på resultaterne af den blandede Gaussisk montering (se 4.3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne protokol kan anvendes til en række forskellige membranproteiner. Som et eksempel er repræsentative resultater opnået med β-2-adrenerge og GABAB-receptorer rapporteret 10. Da fluorescerende signaler fra enkelte molekyler er svage, minimering af baggrundsfluorescens er det første afgørende skridt til vellykkede resultater. Derfor er det vigtigt at bruge ekstensivt renset dækglas (Figur 2A), samt for at minimere prøve autofluorescens (f.eks. Ved hjælp af phenol-rødt frie medier). Det næste skridt er at bestemme fluorescensintensitet enkelt fluoroforen molekyler. Dette kan gøres ved at afbilde enkelte fluoroforer spottet på en ren dækglas (figur 2B). Typisk er en seriel fortynding af fluoroforen bruges til at vælge de bedste betingelser for analysen, dvs. Den koncentration, der producerer godt adskilt og jævnt fordelt enkelt fluorophores. Ekstra controls kan udføres ved at afbilde monomere kontrol proteiner, f.eks., NAP-mærket CD86-receptorer mærket med en fluorofor-BG-derivat. Når disse indledende kontroller og kalibrering er blevet udført, kan de reelle eksperimenter begynde. 3A viser det første billede af en typisk TIRF billedsekvens af en celle transficeret med SNAP-mærket β 2-adrenerge receptorer og mærket med en fluorofor-BG-derivat. Pletterne udgør enkeltstående receptorer eller receptor-komplekser. Dette billede viser også en egnet partikel tæthed til automatiseret detektering og sporing -. Efter vores erfaring, densiteter over 0,45 partikler / um 2 resulterer i dårlig kvalitet tracking og bør undgås 10 Figur 3B viser resultaterne af detektionsalgoritmen for den samme billedsekvens. Hver blå cirkel indikerer en detekteret partikel. Resultaterne af sporingsalgoritmen er rapporteret i figur 3C,hvor de blå splines repræsenterer baner af de enkelte partikler. Banerne af hver partikel kan derefter anvendes til at beregne deres diffusionskoefficienter. Denne metode gør det muligt også at indfange dynamiske begivenheder, som vist i figur 3D, hvor to partikler tilsyneladende underkastes en forbigående interaktion. Figur 4 viser fordelingen af diffusionskoefficienter målt for to forskellige GPCR'er, dvs., Β-2-adrenerge og GABAB-receptorer. Denne type analyse tilladt os at vise, at en stor del af GABA B-receptorer er immobile eller har en meget lav mobilitet 10. Den blandede Gaussisk montering og trin-montering analyser give en præcis kvantificering af størrelsen af receptor-komplekser på overfladen af levende celler (figur 5). Denne analyse kan også afsløre komplekse fordelinger f.eks. Sameksistensen af monomerer og dimerer, som vist i eksemplet i figur 5A.Tal 5B og 5C give to eksempler på partikler blegning i ét eller to trin og den tilsvarende trin-montering analyse, korrekt tildelt dem som monomere og dimeriske receptorer, hhv.
Figur 1.. Workflow for en typisk single-molekyle eksperiment som beskrevet i denne protokol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Dækglas rengøring og forberedelse af kalibreringsprøver. (A)Sammenligning af baggrundsfluorescens før og efter omfattende dækglas rengøring. Dækglas blev afbildet ved TIRF mikroskopi. (B) TIRF billeder af stigende koncentrationer af en fluorofor-BG derivat spottet på rengjorte dækglas. Skala bar:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Typiske enkelt-molekyle billeder og resultater af detektion / sporingsalgoritmerne. (A) CHO-celler transficeret med SNAP-mærket β-2-adrenerge receptorer og mærket med en fluorofor-BG-derivat blev visualiseret ved TIRF mikroskopi. Vist er det første billede af den erhvervede billedsekvens. Skala bar:. 5 m (B)0; Fundne partikler er angivet med blå cirkler oven på det originale billede (C) De baner, der følger af anvendelsen af sporingsalgoritmen til det samme billede sekvens er vist på en hvid baggrund.. Snapshottet svarer til situationen ved rammen nej. 35. Grønne segmenter fusionerende begivenheder. Røde segmenter, opdele begivenheder. (D) Repræsentative baner opnået fra to receptor partikler (blå og grøn, henholdsvis), der gennemgår en tilsyneladende forbigående interaktion (rød). De to partikler fusionere, flytte sammen i flere rammer, og delt igen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Fig. 4. Analyse af receptor mobiliseringty. bliver baner enkelte partikler anvendes til at beregne deres diffusionskoefficienter. I dette eksempel er fordelingen af diffusionskoefficienter beregnet for to forskellige GPCR'er rapporteret. β-2-adrenerge receptorer er kendetegnet ved hurtig lateral diffusion på celleoverfladen, mens GABAB receptorer har begrænset mobilitet. Modificeret fra Calebiro, D. et al. 10.
Fig. 5. Analyse af størrelsen af receptor komplekser. (A) Størrelsen af receptor komplekser kan præcist anslås ved tilpasning af fordelinger af partikel intensiteter med en blandet gaussisk model. Den rapporterede eksempel viser anvendelsen af denne analyse til en celle, der udtrykker SNAP-mærket β 2-drenergic receptorer. Beslaget afslører to components: én, der svarer til intensiteten af enkelte fluoroforer (hovedsagelig superimposable som i kalibreringsprøver samt fordelingen opnået efter delvis blegning af prøven, der er vist her) og en med cirka det dobbelte intensitet. De to komponenter kan tildeles som monomerer og dimerer, henholdsvis og arealet af de to komponenter kan bruges til at estimere den relative forekomst af monomere og dimeriske receptorer. (B) Eksempel på en monomer receptor partikel blegning i én arbejdsgang. (C ) Eksempel på en dimer receptor partikel med den karakteristiske to-trins blegning. De røde linier i (B) og (C) er resultatet af trin-fitting algoritmen. Figuren er modificeret fra Calebiro, D. et al. 10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne protokol tillader analyse af den rumlige arrangement, mobilitet og størrelsen af celleoverflade-receptor komplekser med enkelt molekyle niveau. Sammenlignet med brugen af fluorescerende proteiner, mærkning med små organiske fluoroforer, som er lysere og mere fotostabile, har den fordel at tillade udvidet visualisering af enkelt receptor partikler. Da opnås ekstremt lave ekspressionsniveauer (<0,45 receptor partikler / um 2), egenskaber af receptorer og andre membranproteiner kan analyseres ved tætheder, der ikke overstiger fysiologiske. Desuden er virkningerne af receptor stimulation med agonister 10 eller andre manipulationer, for eksempel til formål at gengive en patologisk situation kan analyseres. Hertil kommer, på grund af fleksibiliteten af mærkningen strategi med SNAP / klip tags 11,12, forskellige fluoroforer kan anvendes i henhold til ens specifikke behov - Mærkbart, kombinationen af SNAPog CLIP tags kan anvendes til at udføre to-farvet forsøg, f.eks. til at overholde colokalisering mellem to interagerende proteiner. Endelig kan denne protokol ændres på flere punkter, for eksempel ved hjælp af forskellige celler, transfektionsmetoder og mærkning strategier.
Kritiske skridt omfatter minimering af baggrund og autofluorescens (ved hjælp af udstrakt rengjorte dækglas, phenol-rød frie medier og filtrerede opløsninger), optimering af transfektionsreagenser (f.eks., Mængden af plasmid-DNA og tid efter transfektion) for at opnå et ekstremt lavt ekspressionsniveau , effektiv mærkning og valg af en lys og tilstrækkeligt fotostabilt fluorophor. Med hensyn til valg af fluoroforen, rød / langt-røde giver normalt bedre resultater, fordi celle autofluorescens er højere i det blå / grønne del af det synlige spektrum og normalt næsten ubetydelig over 550 nm. Særlig opmærksomhed skal rettes mod at undgå fotoblegning affluoroforerne under søgning efter en egnet celle og fokusjustering. Prøver med fluorophores spottet på dækglas samt monomere og dimeriske receptor kontroller (f.eks., CD86 med enten en eller to SNAP tags) 10 bør overvejes at kalibrere analyse og kontrollere mærkning effektivitet.
Grænserne for denne tilgang er i høj grad afhængig af den Spatiotemporal opløsning, der kan i øjeblikket opnået. Dette er for det meste dikteret af antallet af fotoner, der er indsamlet fra en fluorofor samt af følsomheden og erhvervelse hastighed kamera. Typiske værdier for lokalisering præcision af et enkelt, opdages partikel er 20 - 30 nm (til sammenligning den rumlige opløsning af konventionel fluorescens mikroskopi er omkring 200 til 300 nm). Disse værdier er stadig større end den reelle størrelse af et typisk membranprotein (ca. 2-8 nm). Da receptorer falder på en afstand under diffraktion grænsen af mikrorækkevidde (ca. 200-300 nm) registreres som en enkelt partikel, bør passende kontroller og statistiske analyser anvendes til at trække tilfældige colocalizations (falsk positive) fra antallet af sande receptor-receptor interaktioner 8-10 Den maksimale erhvervelse rate opnås med. nuværende EMCCD kameraer kan overstige 1 kHz, i det mindste i afgrøde-tilstand (dvs.. er kun en del af sensoren anvendes). Imidlertid er erhvervelse hastighed også begrænset af antallet af fotoner, der udsendes af en enkelt fluorophor at nå kameraet. I praksis eksponeringstider på mindst 10 - generelt behov 20 msek. Af denne grund variere typiske erhvervelse hastigheder mellem 10 og 50 Hz, dvs. Én ramme hver 20 til 100 msek. Fremtidig udvikling i fluorophor design, optiske komponenter og påvisning teknologi kunne åbne mulighed for yderligere at øge Spatiotemporal løsning af enkelt-molekyle metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | AppliChem GmbH | A1585 | CAUTION: toxic and irritating substance as well as a possible carcinogen |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | CAUTION: strong base and highly corrosive reagent |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich | 32205 | |
| Glass coverslip | Marienfeld-Superior | 111640 | 24 mm diameter, 0.13-0.16 mm thickness |
| 0.2 mm sterile filter | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| CHO cells | ATCC, USA | ATCC CCL-61 | Chinese hamster ovary cell line |
| 6-well cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| DMEM/F-12 medium | GIBCO, Life Technologies | 11039-021 | Phenol-red free medium |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | |
| Penicillin - streptomycin | Pan Biotech GmbH | P06-07 100 | |
| Trypsin-EDTA | Pan Biotech GmbH | P10-23100 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies | 11668-019 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen, Life Technologies | 31985-047 | |
| Fluorophore-conjugated benzylguanine | New England BioLabs | S9136S | SNAP-Surface Alexa Fluor 647. Make a 1 mM stock solution in DMSO. Store at -20°C. |
| DMSO | AppliChem GmbH | A1584 | |
| Imaging buffer: | 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7.3, sterile-filtered | ||
| NaCl | AppliChem GmbH | A1371 | |
| KCl | AppliChem GmbH | A3582 | |
| CaCl2 | AppliChem GmbH | A2303 | |
| MgCl2 | AppliChem GmbH | A3618 | |
| HEPES | AppliChem GmbH | A3724 | |
| Imaging chamber | Molecular Probes, Life Technologies | A-7816 | Attofluor Cell Chamber, for microscopy |
| TIRF-M | Leica | Model: DMI6000B | |
| TIRF objective | Leica | 11 506 249 | HCX PL Apo 100x/1.46 Oil CORR |
| EM-CCD camera | Roper Scientific | Photometrics Cascade 512B | |
| Temperature controller | Pecon | Tempcontrol 37-2 digital | |
| ImageJ software | NIH, USA | http://rsbweb.nih.gov/ij | |
| u-track software | Laboratory for computational cell biology, Dept. of Cell Biology, Harvard Medical School, USA | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | |
| Matlab software | The MathWorks, USA |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Angers, S., Salahpour, A., Bouvier, M. Dimerization: an emerging concept for G protein-coupled receptor ontogeny and function. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 42, 409-435 (2002).
- Ferré, S., et al. Building a new conceptual framework for receptor heteromers. Nat Chem Biol. 5, 131-134 (2009).
- Milligan, G. G. protein-coupled receptor hetero-dimerization: contribution to pharmacology and function. Br J Pharmacol. 158, 5-14 (2009).
- Lohse, M. J. Dimerization in GPCR mobility and signaling. Curr Opin Pharmacol. 10, 53-58 (2010).
- Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y.
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59, 359-374 (2008).
- Hern, J. A., et al. Formation and dissociation of M1 muscarinic receptor dimers seen by total internal reflection fluorescence imaging of single molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 2693-2698 (2010).
- Kasai, R. S., et al. Full characterization of GPCR monomer-dimer dynamic equilibrium by single molecule imaging. J Cell Biol. 192, 463-480 (2011).
- Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 743-748 (2013).
- Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).
- Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol. 15, 128-136 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 26, 373-399 (1997).
