Abstract
후 배아 초파리에서 개발, 초파리의 중요한 부분은 가상적인 디스크라고 불리는 주머니 같은 구조의 집합 내에서 일어난다. 이러한 디스크는 성인 플라이 내에 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기. 여기에서 우리는이 디스크를 복구하고 항체, 전사 기자 단백질 트랩과 분석을 준비하기 위해 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 절차는 가장 가상적인 디스크 등 얇은 조직에 적합하지만, 용이하게 애벌레 및 성인 뇌 난소 조직과 같이 두꺼운 용도 변경 될 수있다. 서면 프로토콜과 함께 제공되는 동영상은 세번째 령 유충, 조직의 고정 및 항체, 상상 디스크 치료의 절개를 통해 독자 / 시청자를 안내합니다. 프로토콜은 또한 이하의 제 1 및 제 2 령 유충으로부터 가상적인 디스크를 해부하는데 사용될 수있다. 이 프로토콜의 장점은 상대적으로 짧은 것을이며 수있다해부 조직의 높은 품질의 보존을 위해 최적화 도중에. 또 다른 장점은 사용되는 고정 절차가 초파리 단백질을 인식하는 항체의 압도적 인 숫자로 잘 작동한다는 것입니다. 우리의 경험에 의하면,이 절차를 잘 작동하지 않는 민감한 항체의 매우 작은 수는있다. 이러한 상황에서, 치료는 우리가 해부 단계와 항체 배양을 위해 규정 한 가이드 라인을 따라 계속하는 동안 다른 고정 칵테일을 사용하는 것으로 나타납니다.
Introduction
한 세기 이상 초파리, 초파리의 경우, 개발, 행동과 생리학을 연구하는 최고의 시스템이다. 후자의 촬영 장소의 대부분과 배아 및 사후 배아 단층 상피 내에서 가상적인 디스크 1-3 전화 : 파리의 개발은 크게 두 단계로 나눌 수 있습니다. 가상적인 디스크의 그림은 첫번째 곤충 개발 한 그의 광범위한 논문의 일부가 오는 8 월 Weismann에 의해 1864 년에 출판되었다. 이러한 디스크는 1-14 플라이 성인에서 발견되는 성인 구조물의 높은 비율을 야기 궁극적으로 조기 번데기 단계 대규모 histolysis 생존하고, 유생 단계 동안 패턴 화되고, 배아 발생 동안 그들의 발전을 시작한다. 애벌레 개발 과정에서 각 디스크의 운명, 모양과 크기에 관한 몇 가지 중요한 결정을합니다. 제 1 및 제 2 령 유충 내 디스크는 일차 운명을 취 establis을 주어 아르정확한 형상을 채용하고 15-16 세포의 필요한 수를 생성 구획 경계 힝. 셋째 애벌레 령 초 전 번데기의 단계에서, 상상 디스크는 계속 분열 및 세포가 자신의 단말기 운명 16을 채택으로 패턴 화되어있다.
초파리 발달 생물학의 초기 역사 동안, 가상적인 디스크는 정상적인 발달의 컨텍스트에서 그리고 손실이나 기능 획득 돌연변이가 생존시킨 제한된 경우에 거의 독점적으로 연구되었다. X 선의 사용은 치명적인 돌연변이 허용 유사 분열 재조합이 유충 및 성인의 조직 내의 세포 클론에서 분석 될 유도. 이 방법은 유충 및 성인 조직 모두에서 돌연변이 손실을 분석하여 기능 획득하는 형질 전환 방법의 도입에 의해 개선되었다. 야생형 및 돌연변이 분자의 조직을 설명하기위한 프리 항체, 전사 리포터 단백질 트랩 번호도이다 CONSTantly 성장. 돌연변이 세포 클론을 손실을 분석하여 기능 획득하기 위해 이들 분자 표지 사용은 점점 실현 돌연변이 세포를 개발하는 동안 그들의 야생형 사촌 이탈 방법의 실시간 이해하도록했다. 적절 이러한 도구 및 시약을 이용하려면 그것은, 볼 촬영하고 분석 할 수 디스크의 가상적인 고품질 제제를하는 것이 중요하다. 이 원고의 목적은 눈 더듬이 디스크 착체 (도 1a)의 분리 및 제조를위한 최적의 프로토콜을 제공하는 것이다. 또한 성공적 날개 halteres, T1-T3의 다리와 성기 (도 1b-E)을 야기 된 것을 포함하여 부가적인 디스크의 다양한 분리하는데 사용될 수있다. 약간의 수정이 절차는 거의 팔십년에 초파리에서, 상상 디스크를 분리하기 위해 사용되어왔다.
대부분의 유전자 뮤 중에 발현되므로 같이, 상술개발 및 조직의 다양한 단계에서 ltiple, 그것은 동물 셋째 령 유충 단계 전에 잘 죽으면 널 돌연변이가 전체 눈에 미치는 영향을 연구하는 것이 불가능하다. 네 방법은 훨씬 더 다루기 쉬운 망막으로 더 많은 개발 조직의 연구를 만들었습니다. 첫째는 달리 야생형 조직 내에 17-19 돌연변이 세포 클론을 생성 Flippase (FLP) / Flippase 재조합 타겟 (FRT) 방법이다. 이때 돌연변이 조직은 녹색 형광 단백질 (GFP)로 시각적 마커의 부재에 의해 식별되며, GFP가 존재하는 야생형 주변 조직 (도 2D)에 비교 될 수있다. 두번째 유전자는 셀 (20)의 집단에서 발현되는 "FLP 아웃"방법이다. 이 경우 세포 클론은 GFP 기자 부족 주변 야생 형 조직 (그림에 GFP의 존재에 의해 확인 및 비교2E). 세 번째는 FLP / FRT 돌연변이 복제 및 FLP 아웃 발현 시스템 (21)의 요소를 결합 Repressible 세포 마커 (MARCM) 기법과 모자이크 분석이다. 이 방법은 유전자를 동시에 개별적 유전자 유전자좌위한 돌연변이이다 세포 집단 내에서 표현 될 수있다. FLP 아웃 클론 마찬가지로 MARCM 클론 GFP의 존재에 의해 식별되고 GFP 마커 (도 2F)를 결여 주변 야생형 조직과 비교된다. 그리고 마지막으로, 유전자의 RNAi 구성체는 특정 프로모터 GAL4 구조의 제어에 가상적인 조직 내에서 발현 될 수있다. 돌연변이 또는 과발현 클론 또는 패턴이 직접 인접 야생형 조직과 비교 될 수 있기 때문에 이러한 네 가지 방법은 가상적인 디스크를 연구에 관심이 증가하고있다. 이 절차에 설명 된 방법이 개발되어 있기 때문에 초파리에서 성인 조직 후 배아 발달을 연구 연구자특히 눈 더듬이 디스크에서 유래 된이 분석을 위해 고품질의 조직을 얻을 수있을 것입니다. 개별 연구자가 약간의 수정을 만들었습니다 있지만,이 절차 (우리는 여기에 설명되는)의 핵심은 크게 변경되지 않은 채 남아있다. 높은 품질의 조직을 얻는 것은 우리가이 기록 된 프로토콜과 첨부 된 동영상이 귀중한 교육 자원이 될 것입니다 희망, 상상 디스크의 연구에 매우 중요하기 때문에.
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Protocol
애벌레의 1 준비
- 해부 버퍼 35mm 페트리 접시를 채 웁니다.
- 페트리 접시에 유충을 배치하고 몇 분 (자동 세척 단계) 주위에 수영을 할 수 있습니다.
- 실리콘 기반의 해부 접시에 해부 버퍼 풀에 유충을 전송합니다. 이 풀은 판의 한 가장자리에 있어야합니다. 해부 판 유리 페트리 접시 내에 부어 경화 된 실리콘 용액 이루어져있다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여-, 박리 판의 중간에 박리 완충액 큰 풀을 배치.
- # 5 집게를 사용하여 절개 버퍼의 큰 풀에 작은 수영장에서 단일 청소 유충을 전송합니다.
유충의 2 거친 해부
- 유충은 해부 버퍼의 대형 수영장 내에있는 동안 집게로 유충을 걸쇠. 포셉의 다른 쌍 ANIM을 보유하는 데 사용되는 동안 집게 한 쌍의 입 후크를 잡기 위해 사용되어야한다알은 여전히 (3 분의 몸 길이의 부드럽게 유충을 잡아).
- 신속 포셉 번째 쌍 얻어 신체의 나머지 부분을 당기는 동안 입 후크 근처 표피를 함유하는 핀셋의 쌍을 고정하거나.
- 유충이 뿔뿔이하기 시작하면 당신은 긴장에 약간의 방출을 느낄 것이다. 포셉에서 유충을 해제하고 밖으로 유출하는 유충의 "용기"를 할 수 있습니다. 이것은 정상적인 형태를 유지하기 위해 가상적인 디스크의 수 및 변형되는 것을 방지 할 수 있습니다.
- 겸자 일쌍 제자리에 유충의 전방 단부를 유지하도록 다시 입 후크 파악. 사용 포셉의 다른 쌍은 내부 용기를 포함하여 유충의 2/3 하부를 제거합니다. 참고 : 입 후크, 눈 더듬이 디스크, 뇌 반구, 복부 신경절, 침샘, 일부 다리 디스크를 포함하는 복잡하고, 위에있는 표피가 유지됩니다.
- 집게의 쌍으로 부드럽게 상부 표피, 침샘, 다리 디스크 및 제거다른 조직. 참고 : 입 후크, 눈 더듬이 디스크, 뇌 반구입니다 남아 있어야 조직 및 복부 신경절 (그림 3).
- 반복은 15 ~ 20 분 동안 추가 애벌레 2.1-2.5 단계를 반복합니다. 주 : 오랜 기간 동안 해부 버퍼 내에 남아있는 가상적인 디스크 성능이 저하하는 경향이 궁극적으로 촬영되는 이상적인 표본 이하로 나타납니다. 따라서, 모든 해부 조직을 고정액 PLP로 전송해야 20 분 후 최대 (아래 참조).
항체와 3 고정 및 조직의 염색
- P-200 pipetman을 사용하여, 냉간 파라 포름 알데히드-리신-요오 (PLP)를 포함하는 정착액 시계 접시로 해부 조직을 전송. 50 μL로 전송 해부 버퍼의 제한 볼륨은 PLP의 희석을 최소화합니다. 팁 개방 해부 조직을 수용 할 수있을만큼 큰 수 있도록 면도날과 팁을 끊어야합니다. 집게의 쌍을 사용하거나텅스텐 바늘 해부 조직이 완전히 적절한 고정이 발생하기 위해서는 침수되어 있는지 확인합니다. 45 분 동안 차가운 PLP의 정착액의 해부 조직을 품어. 이 배양 교반하지 않고 실온에서 일어날 수있다.
- P-200의 pipetman를 사용하여 45 분 동안 다른 잘라 노란색 팁을 사용하여 버퍼를 씻어 (RT)를 해부하는 조직을 전송합니다. 50 μL로 전송 PLP의 제한 볼륨은 세척 버퍼의 희석을 최소화합니다. 참고 : 모든 해부 조직이 완전히 침수되어야한다.
- 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 해부 조직의 20 ~ 30 세트를 전송합니다. 주 : 눈 더듬이 디스크 착체의 번호가 큰 튜브 내에 결합하는 경우, 상기 튜브의 하단에 조직이 항체에 노출 적절하지 않을 가능성이있다. 최적의 결과를 위해 더 이상 20 ~ 30 눈 더듬이 디스크 단지 하나의 튜브 내에서 본 제품을 장착 할 수 없습니다. 해부 조직은 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착됩니다. 따라서, 후속 단계 U를제거하고 세척 버퍼 차단 솔루션 및 항체를 대체 할 pipetman를 SE는.
- 세척 버퍼를 제거하고 차단 솔루션을 100 ㎕로 교체 : 세척 버퍼 10 % 정상 염소 혈청. 10 분 동안 테이블 위에 회전에 부드러운 회전을 RT에서 품어.
- 차단 솔루션을 제거하고 적절하게 10 % 정상 염소 혈청 희석 된 일차 항체를 100 ㎕로 교체합니다. 16 시간 동안 부드러운 회전을 RT에서 품어.
- 일차 항체를 제거하고 세척 버퍼 750 μL로 교체합니다. nutator에 튜브를 넣고 실온에서 10 분 동안 nutate 할 수 있습니다. 참고 : 차 항체 (4 ° C에 저장)를 저장하고 나중에 재사용 할 수 있습니다. 항체를 여러 번 재사용하면 비 특정 바인딩을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 헤드 후, 튜브의 바닥에 침전 세척 완충액을 제거하고 적절 10 % 정상 혈청으로 희석 된 이차 항체 100 ㎕를 추가 할 수있다. 부드러운 회전과 RT에서 품어 2̵일 4 시간.
- 조직에서 차 항체 솔루션을 제거하고 세척 버퍼 500 μL로 교체합니다. 조직 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다.
- P-200과 절단 황색 팁을 사용하여, 해부 접시에 배치 된 세척 버퍼의 풀에있는 모든 해부 조직을 옮긴다. 미세 절개의 다음 단계를 진행하는 동안, 조직을 세척 완충액에 배양한다. 이 과잉 차 항체를 제거하는 데 도움이됩니다.
4 아이 - 더듬이 디스크 단지의 미세 해부 및 슬라이드에 장착
- 아래로 향 복합체의 복부 측면과 입 후크에 의해 표피를 걸쇠 집게 한 쌍을 사용합니다. 집게의 두 번째 쌍의 뇌와 눈 디스크 사이의 공간에 (그림 3, 빨간색 화살표)를 두 번째 집게를 폐쇄하고 신속하게 입 고리에서 떨어져 머리를 잡아 당겨 두 뇌 엽 (叶)을 제거합니다.
- 입 후크 지키고 계속하는 동안, 핀치 오프눈 더듬이 디스크 더듬이 부와 입 후크 (도 3, 청색 화살표) 사이의 연결에 최대한 가깝게 조직. 주 : 눈 더듬이 디스크 단지 모든 조직 (그림 1A)이 없어야합니다. 슬라이드에 배치 할 수 있습니다 원하는 원하는 모든 조직을 해부 할 때까지 계속합니다. 이 프로토콜은 날개 haltere, 다리 및 생식기 가상적인 디스크 (도 1b-E)를 격리하도록 구성 될 수있다.
- 티슈 페이퍼의이 작은 조각 (커버 슬립의 사이즈) 약 3를 추가합니다. 떨어져 해부 접시에. 접시 위에 슬라이드 유리를 배치 - 휴지 두 조각의 슬라이드 단부하에 있어야한다. 이 해부 접시의 실리콘베이스에 달라 붙는 슬라이드를 방지 할 수 있습니다.
- 도련 끝 P-20을 이용하여, 유리 현미경 슬라이드의 중간 항 표백제 9 μL를 추가한다. 형광으로 볼 때 조직의 탈색을 방지빛.
- 같은 포경 팁을 사용하여, 모든 눈 더듬이 디스크를 수집 및 안티 표백 시약의 드롭에 추가합니다. 위에 수행되는 세척 버퍼의 양을 최소화한다. 10 μL 이하로 세척 버퍼의 양을 제한하려고합니다.
- 분리 및 안티 표백 시약의 드롭 내 눈 더듬이 디스크를 확산 집게 한 쌍을 사용합니다. 디스크가 몇 분 동안 반 표백 시약에 부화 할 수 있습니다. 참고 : 조직 반 표백 시약을 흡수으로 디스크가 분명집니다.
- 좋은 붓을 사용하여 부드럽게 시편 상에 커버 슬립을 낮 춥니 다. 이 기포의 형성을 방지한다.
- 스토어 빛 또는 형광 현미경을 사용하여 눈 더듬이 또는 다른, 상상 디스크를 볼 준비가 될 때까지 -20 ° C에서 슬라이드.
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Representative Results
확실히 상술 된 방법은 인 시츄 프로브, 전사 리포터 단백질 트랩과 함께 항체의 분석을위한 높은 품질의 재료를 생성한다. 그림 1에서 우리는 정기적으로이 방법으로 회수 눈 안테나, 생식기, 날개, haltere과 다리 디스크를 표시합니다. 이러한 디스크는 F-액틴에 결합하기 때문에 각각의 셀을 설명 phalloidin - 복합 형광 물질로 처리되어있다. 조직은 다음 제대로 눈 디스크의 형태 형성 고랑 고정 된 경우, 동심 조직의 가장자리는 생식기, 더듬이와 다리 디스크에 주름 및 날개와 haltere 디스크의 지느러미 - 복부 축이 모두 같은 날카로운 모서리를 나타납니다 . 조직이 제대로하고 고정되어있는 경우 항체, 형광 단백질과 현장 프로브에 또한 날카로운 패턴을 발표 할 예정이다. 몇 가지 예는 그림 2에 나타내었다. 동안 다른 항체로 염색 한 상위 3 패널 디스플레이 디스크를아래 세 개의 패널은 GFP는 세포의 인구를 표시하는 데 사용되는 디스크를 보여줍니다.
눈 더듬이 디스크의 가장 눈에 띄는 특징 중 하나는 지느러미 - 복부 축 1, 22을 따라 실행하는 조직 내에서 들여 쓰기로 볼 수있는 형태 발생 밭고랑 (그림 1A)입니다. 모든 셀 셋째 애벌레 령 이전에 내 현상 눈은, 패턴 화되지 않은 미분화, 및 형태 학적으로 서로 구별. 셋째 령 유충의 시작 밭고랑 형태 형성은 안과 분야의 후연에서 시작하고 눈 / 더듬이 전방 테두리 (22)를 향해 진행한다. 밭고랑이 눈의 들판을 가로 질러 진행 무질서 세포의 바다는 정기적으로 간격 단위 눈이나 ommatidia, 개안 (그림 1A) 22 ~ 23의 순서 배열로 변환됩니다. 앞서 PAX6 상동 눈이 (어이)를 포함하는 유전자 규제 네트워크 밭고랑의 채널 세포눈 운명 (그림 2A) 15을 향해. 고랑 자체의 시작과 진행은 경로 24-29 신호 고슴도치 (Hh를) 및 Decapentaplegic (DPP)의 활동에 따라 달라집니다. 실제로 DPP-lacZ의 기자 충실하게 고랑 (그림 2B) 30 ~ 31 내에서 DPP 궤적의 표현을 반영한다. 세포가 밭고랑을 종료하고 자신의 단말기 운명을 채택하기 시작, 그들은 같은 범 신경 세포의 RNA 결합 단백질 (그림 2C) 32 ~ 34 인코딩 배아 치명적인 이상 비전 (elav) 등 셀 특정 마커를 표현한다.
그림 1 초파리의 가상적인 디스크에 기록 할 수 있습니다. (
눈, 상상 디스크의 그림 2 클론과 표현 분석 (A - F). 눈, 상상 디스크의 공 초점 이미지. (A) PAX6 단백질 눈이 (어이)을 크게 앞서 형태 발생 밭고랑의 배포됩니다. (B) DPP-lacZ의 전사 reporteR은 Hh를 신호에 응답하고 형태 형성 밭고랑 내에서 표현된다. (C) Elav는 형태 발생 밭고랑 뒤에 모든 개발 광 수용체에 분포 팬 신경 세포의 RNA 결합 단백질. (D) FLP / FRT 시스템에 의해 생성 기능 상실 클론을 포함하는 눈 디스크. 클론은 GFP (E)의 부족에 의해 식별됩니다. FLP 아웃 시스템을 생성 과발현 클론을 포함하는 눈 디스크. 클론은 긍정적 인 GFP로 표시되어 있습니다. (F) MARCM 클론을 포함하는 눈 디스크. FLP 아웃 시스템과 마찬가지로 MARCM 클론 GFP의 존재에 의해 식별 될 수있다. 발견 된 모든 단백질과 유전자형이 그림에서 나열되어 있습니다. 전방는 오른쪽에 있으며 지느러미는 최대이다.
그림 3 아이 안테나 뇌 복잡한. 모델명 : SCH첫날 거친 해부 제품의 ematic 도면. 수정되어야하는 유일한 조직은 눈에 안테나 디스크와 뇌 (- 표시되지 복부 신경절뿐만 아니라 부착 된 상태로 유지됩니다 종종) 입 후크입니다. 퍼플 = 뇌, 녹색 = 눈 안테나 디스크, 갈색 = 입 후크. 전방는 오른쪽에 있습니다. 다리, 날개, haltere 생식기 디스크를 해부하면 유충의 외부 표피는 여전히이 조직에 연결해야합니다. 다양한 항체, 블록 및 세척 솔루션을 통해 후속 전송 중에 가상적인 디스크가 손실 될 수 있습니다로 위에있는 표피를 제거하지 마십시오. 여분의 조직을 미세 절개 단계 (4.1-4.2) 동안 제거 할 수 있습니다.
그림 4 초파리 유충 내에서 가상적인 디스크의 위치. 스키마세 번째 령 유충 내 눈 안테나, 다리, 날개, haltere 생식기 디스크의 상대적 위치의 틱 도면. 눈 더듬이 디스크가 녹색으로 착색, 다리 디스크는 파란색으로, 고삐 디스크가 자주색에있는 날개 디스크는 / 갈색에 주황색과 생식기 디스크는 밝은 갈색입니다. 전방는 오른쪽에 있습니다.
| 솔루션의 이름 |
| 8 % 파라 포름 알데히드 |
| 0.2 M 인산 나트륨 인산이 수소 |
| 0.2 M 인산 나트륨 Disbasic |
| 1 N 수산화 나트륨 |
| 10 % 트리톤 |
| 0.1 M 인산 나트륨 버퍼 (해부 버퍼) |
| 0.1 M 인산 나트륨 버퍼 + 0.1 % 트리톤 (워시 버퍼) |
| 리신 버퍼 |
| 2 % 파라 포름 알데히드-라이신 - 요오드 정착액 (PLP) |
| 10 % 정상 염소 혈청 |
표 1 : 필수 솔루션 목록.
| 8 % 파라 포름 알데히드 원액 |
| 50 ㎖의 삼각 플라스크에 다음을 추가 : |
| 2.0 g의 파라 포름 알데히드 |
| 증류수 23.0 ㎖의 |
| 1 N 수산화 나트륨 4.0 방울 (유리 파스퇴르 피펫으로부터) |
| 솔루션은 부드러운 종기에 도달 할 때까지 저어 접시에 혼합하고 열 |
| 파라 포름 알데히드가 완전히 녹을 때까지 살짝 끓여 허용 |
| (이전에 각 해부 신선한 확인) 차가운 때까지 얼음에 배치 |
| 0.1 M 인산 완충액 (해부 (P) 버퍼) |
| 50 ML 원뿔 튜브에 다음을 추가 : |
| 18.0 ml의 0.2 M 인산 나트륨 이염 |
| 7.0 ml의 0.2 M 나트륨 인산 |
| 25.0 ㎖의 증류수 |
| 저장 4 ° C (일주의 수명)에서 |
| 0.1 M 인산 + 세제 버퍼 (워시 (W) 버퍼) |
| 50ML 원뿔 관은 다음을 추가 : |
| 18.0 ml의 0.2 M 인산 나트륨 이염 |
| 7.0 ml의 0.2 M 나트륨 인산 |
| 25.0 ㎖의 증류수 |
| 0.5 ml의 10 % 트리톤 |
| RT에서 보관 (일주 수명) |
| 라이신 (L) 버퍼 |
| 50 ML 원뿔 튜브에 다음을 추가 : |
| 0.4 g의 리신 |
| 1.2 ml의 0.2 M 인산 나트륨 이염 |
| 8.0 ml의 해부 (P) 버퍼 |
| 10.0 ㎖의 증류수 |
| 리신이 완전히 용해 될 때까지 용액을 흔들어 |
| (이전에 각 해부 신선한 확인) 차가운 때까지 얼음에 배치 |
| 2 % 파라 포름 알데히드 - 리신 - 요오드 (PLP) 정착 |
| 0.1 g 나트륨 요오드 |
| 라이신 (L) 버퍼의 15.0 ML |
| 8 % 파라 포름 알데히드 5.0 ㎖의 |
| 요오드 산 나트륨이 완전히 용해 될 때까지 잘 솔루션을 흔들어 |
| (이전에 각 해부 신선한 확인) 차가운 때까지 얼음에 배치 |
표 2 : 필수 솔루션에 대한 조리법.
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Discussion
이 절차는 크게 분리 눈길 더듬이 디스크의 후속 처리에 초점을 맞추고 있지만, 그것을 분리하고 날개 haltere, 다리 및 생식기 디스크 (도 4)을 분석하는데 사용되는 의무가있다. (눈 더듬이 디스크와는 대조적으로) 이러한 디스크를 분리하는 프로토콜의 유일한 필수 변형 조대 해부 (프로토콜의 섹션 2)의 방법이다. 제 흉추 레그 (T1) 쌍 유충의 앞쪽에서 발견되어 눈길 더듬이 디스크 절연을위한 프로토콜에 따라 회수 할 수있다. 그러나 두번째 가슴 다리 (T2) 디스크는 표피에 부착된다. 집게의 또 다른 한 쌍의 동물의 복부 표피를 걸쇠에 사용하는 동안 위에서 설명한대로 집게 한 쌍의 입 후크를 보유하는 데 사용되어야한다 이러한 디스크를 분리하기 위해 (에서 유충에 대한 3 분의 걸쇠해야합니다 입 후크. 유충은 단순히 LAR의 나머지 부분에서 떨어져 복부 표피를 찢어 필렛 할 수 있습니다버지니아. T2 다리는 표피에 부착 된 상태로 유지됩니다. 셋째 흉추 (T3)는 다리에 부착 된 표피 자체 복합체의 일부로서 날개 haltere 디스크에 부착된다. 당신은 절차의 미세 절개 부분을 진행하는 동안 디스크를이 단계에서 표피에서 디스크의 복잡하고 T2 다리를 분리 또는 후속 고정 / 항체 배양 단계에서 함께 표피 디스크의 복잡한을 유지하고 분리하도록 선택할 수 있습니다 (4 절) . 성기 디스크를 복구의 경우, 집게 일쌍와 중앙부에 유충을 파악하고 멀리 중앙부에서 시작하여 유충의 후방 끝에서 끝나는 포셉의 다른 쌍의 복부 표피를 벗겨하는 것이 가장 좋습니다. 그것은 집게 멀리 필요없는 조직을 취소 한 후 P-200 pipetman 누구의 말 면도날로 절단 된 노란색 팁을 사용하여 정착 용액에 그냥 성기 디스크를 전송하는 데 사용하는 것이 좋습니다.
이 절차는 담배 마는에 가장 적합합니다이러한 가상적인 디스크와 같은 제한된 두께의 단말 및 최적으로 작동 사용되는 항체는 높은 역가와 특이도의 경우. 그러나, 이러한 성인 난소, 고환, 뇌뿐만 아니라 낮은 항체 역가 또는 원하는 "배경"염색보다 수득 것과 함께 두꺼운 조직에서 잘 작동하도록 구성 될 수있다. 두꺼운 티슈로 작업 할 때, 최적의 결과는 단순히 파라 포름 알데히드의 농도를 증가 및 / 또는 더 오랜 기간 동안 PLP 정착액에서 배양함으로써 수득 될 수 있음을 제안한다. 해부 조직의 적절한 정착이 프로토콜의 성공에 필수적이기 때문에 또한 파라 포름 알데히드의 농도를 증가 및 / 또는 고정 길이를 증가시키는 효율 phalloidin (도 1)으로 평가 될 것을 제안한다. 특히 세심한주의가 조직 내에서 세포의 개요와 다른 물리적 랜드 마크의 "선명도"에 지불해야한다 (즉, morphogenetic 고랑). 또 다른 방법은 제대로 고정되어 당신의 조직 (특히 두꺼운 샘플) 8 % 파라 포름 알데히드 전에 각 해부 신선한 PLP 솔루션을 준비하는 것을 확인합니다. 조직은 짧은 시간에 대한 해부 조직이 빨리 고정액으로 전송되는 경우 최종적 해부의 전반적인 품질이 증가 될 수있다. 그것은 15 ~ 20 분 이상 더 이상에 대한 해부하는 것이 좋습니다. 짧은 기간에 해부하는 조직 보존의 품질을 향상시킵니다.
이 프로토콜은 항체의 넓은 범위에서 잘 작동하지만, 일부 항체 PLP 정착액이 잘 동작하지 않는다는 사실이다. 한 악명 높은 예는 거친 (로) 전사 인자를 인식하는 항체이다. 거침 내에서 표현되고, 광 수용체 (35) 개발의 부분 집합의 사양이 필요합니다. 반 롬 항체하지 PLP와 가장 잘 작동하지만, 오히려 파이프 - EGTA - 황산 사 (PEM) Buffer 36. 마찬가지로, 다른 항체는 또 다른 고정 제에서 배양 된 조직에 최선을 작동 할 수 있습니다. 그것은 특별히 명시되지 않는 한, PLP의 정착이 먼저 시도해야하는 것이 좋습니다. 시작해야한다 대체 정착을 찾는 과정 후 실패하는 경우.
직면하는 하나의 일반적인 문제는 해당 항체의 작용 농도이다. 종종는 관심있는 조직에서 단백질을 검출하기 위해 특정 항체를 사용하는 최초의 연구가 될 수있다. 작업 농도는 다른 조직에 대해보고 무엇과 다를 수 있습니다. 그것은 권장 농도가 먼저 시도하는 것이 좋습니다. 신호가 볼 수없는 경우에 항체의 농도를 증가시킨다. 권장 농도 준다면 한편, 다음 항체 희석 높은 백그라운드 염색이 시도되어야한다. 항체 간의 작업 농도는 다를 수 있습니다. 안티 동안 5 : 예를 들어, 안티 눈 결석 (Eya) 항체를 희석 한500 희석 : Elav에도 항체는 1에서 잘 작동합니다. 3000 : 일부 항체도까지 내려 1로 희석 될 수있다. 또한이 절차는 서면으로, 높은 특이성 항체와 가장 잘 작동합니다. 대부분이 경험하지만, 어떤 항체는 조직에 비 특이 적으로 결합 할 수 있으며이 하위 최적의 이미지를 만들 수 있습니다. 이러한 상황은 종종 고정 된 가상적인 디스크에 추가되기 전에 고정 된 배아 또는 유충 사체로 희석 된 항체를 배양함으로써 보정 될 수있다. 비특이적 백그라운드 염색의 레벨에 따라, "미리 흡수"의 필요한 길이는 달라질 수 있으며, 시험 적 밖으로 일되어야 할 것이다. 그것은 여러 번 재 항체를 사용하거나 미리 몇 차례 흡수를 행함으로써, 신호 / 잡음비를 증가하는 것도 가능하다.
디스크는 출판물 및 / 또는 프리젠 테이션에 사용되어야하는 결정할 때까지 중심의 꼭대기면이 지향 한 디스크를 선택하는 것이 가장 좋습니다 구. 또한 접힌되지 않은 디스크를 사용하는 것이 최선의 방법입니다. 이 눈 더듬이 디스크 특히 그러하다. 디스크의 복부 측면은 배 경향이 있고 불행하게도, 작은 일이 발생하지 않도록하기 위해 할 수있다. 하나의 솔루션이 훨씬 덜 배 경향이 젊은 디스크를 해부하는 것입니다. 또 다른 옵션은 완전히 평평 하나를 얻을 때까지 그냥 디스크의 많은 수를 해부하는 것입니다. 눈 더듬이 디스크의 전체적인 형상은 유충이 분열하는 속도에 의해 영향을받을 수있다. 하나는 너무 빨리 떨어져 뇌 디스크 착체가 통과하는 구멍을 유충 당긴 경우 작고 눈 더듬이 디스크 밖으로 절첩 및 / 또는 연신 온다. 이 유충은 구멍이 더 커집니다 때문에 눈물을 시작할 때까지 천천히 당겨하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음 천천히 뇌 눈 더듬이 디스크 복잡한 당겨을 계속할 수 있습니다. 당신이 너무 천천히 당겨 수 없다 명심하십시오. 또한 당신이 조직을 찢어되는 속도가 다른 조직의 분리에 영향을 미치는 요인이 아니라고주의.
ve_content는 "> 초파리의 라이프 사이클은 세 유충의 단계로 구성된다. 중요한 발달 이벤트는 따라서이 (이 절차의 주요 초점이다)뿐만 아니라 제 령 유충으로부터 조직을 분리하는 것이 중요 할 수 있으며, 각각의 단계 일 때 열린다 또한 양쪽 제 1 및 제 2 유충으로부터는 하나의 부수를 제외한,이 절차는 제 령기 디스크를 분리하기 위해, 기록 된 바와 같이, 사용될 수있다.뿐만 령충. 절차의 미세 절개 부 (섹션 4) 동안에 날카로운 텅스텐 것을 권장 와이어 입 후크, 뇌 및 침샘 같은 외부 조직으로부터 눈 더듬이 디스크를 분리하는 데 사용되어야한다. 텅스텐 와이어는 서로 상부 표피로부터 T2 / T3 다리, 날개 haltere 디스크를 분리하기 위해 사용될 수있다 . 이는 텅스텐 와이어 (조직을 분리하기 위해 사용되는 단부)의 한쪽 끝이 끓는 질산 나트륨 수욕상에서 가온하여 선명 화하는 것이 권장이다 타단 핀 바이스에 삽입 될 수있다. 번째보다 쉽게 텅스텐 와이어를 개최 할 수있다. 불행하게도, 당신이 슬라이드에 전체 눈 더듬이 디스크 / 두뇌 / 입 후크 단지를 배치하고 coverslip을 커버한다는, 따라서 권장 그대로 첫번째 령 디스크를 분리하는 것이 상당히 어렵다. 해부 조직의 양은 종래의 슬라이드에 디스크 / 뇌 / 입 후크 착체를 장착하여 표피를 침샘을 제거하기 위해 날카로운 텅스텐 와이어를 사용하여 오버레이함으로써 최소화 될 수있다. 그것은 여전히 뇌와 입 고리에 부착되는 경우 (37) (도 6A, 쿠마 모세 2001의 D 참조) 제 령 눈 더듬이 디스크를 식별하기 위해 상대적으로 쉽다. 다른, 상상 디스크는 표피에서 분리 볼 수있는 슬라이드에 배치해야합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
우리는 JPK에게 원래의 가상적인 디스크 해부 절차를 가르치는 도널드 준비와 케빈 모세에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 그림 1B의 성기 디스크와 그림 3 그림 2A, 브랜든 Weasner의 눈 디스크의 보니 Weasner 감사 플라이 얼룩에 대한 블루밍턴 초파리 주식 센터 및 항체 발달 연구 하이 브리 도마 은행. CMS는 건강 (NIH) GCMS 교육 그랜트의 국립 연구소 (T32-GM007757), 프랭크 W. 퍼트 냄 연구 활동, 그리고 로버트 브릭스 연구 활동에서 장학금으로 지원하고있다. JPK는 국립 안과 연구소의 연구비 지원 (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
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