Abstract
के बाद भ्रूण फल मक्खी में विकास, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर का एक महत्वपूर्ण भाग, imaginal डिस्क कहा जाता थैली संरचनाओं की तरह का एक सेट के भीतर जगह लेता है. इन डिस्क्स वयस्क मक्खी के भीतर पाए जाते हैं कि वयस्क संरचनाओं के एक उच्च प्रतिशत को जन्म दे. यहाँ हम इन डिस्क की वसूली और एंटीबॉडी, ट्रांसक्रिप्शनल पत्रकारों और प्रोटीन जाल के साथ विश्लेषण के लिए उन्हें तैयार करने के लिए अनुकूलित किया गया है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन. यह प्रक्रिया सबसे अच्छा imaginal डिस्क की तरह पतली ऊतकों के लिए अनुकूल है, लेकिन आसानी से ऐसे लार्वा मस्तिष्क और वयस्क अंडाशय के रूप में मोटा ऊतकों के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है. लिखित प्रोटोकॉल और साथ वीडियो तीसरे instar लार्वा, ऊतक का निर्धारण, और एंटीबॉडी के साथ imaginal डिस्क के उपचार के विच्छेदन के माध्यम से पाठक / दर्शक मार्गदर्शन करेंगे. प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से युवा पहली और दूसरी instar लार्वा से imaginal डिस्क टुकड़े करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल का लाभ यह अपेक्षाकृत कम है और यह हो गया हैविच्छेदित ऊतक की उच्च गुणवत्ता के संरक्षण के लिए अनुकूलित एन. एक और लाभ कार्यरत है कि निर्धारण प्रक्रिया ड्रोसोफिला प्रोटीन समझते हैं कि एंटीबॉडी की भारी संख्या के साथ अच्छी तरह से काम करता है. हमारे अनुभव में, इस प्रक्रिया के साथ अच्छी तरह से काम नहीं करते कि संवेदनशील एंटीबॉडी की एक बहुत छोटी संख्या है. इन स्थितियों में, उपाय हम विच्छेदन कदम और एंटीबॉडी incubations के लिए उल्लिखित है कि दिशा निर्देशों का पालन करने के लिए जारी करते हुए एक वैकल्पिक निर्धारण कॉकटेल उपयोग करने के लिए प्रतीत होता है.
Introduction
अधिक से अधिक एक सदी फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए, विकास, व्यवहार और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक प्रमुख प्रणाली रही है. उत्तरार्द्ध जगह लेने के ज्यादा के साथ भ्रूण और बाद भ्रूण monolayer epithelia भीतर imaginal डिस्क 1-3 बुलाया: मक्खी में विकास दो व्यापक चरणों में विभाजित किया जा सकता है. Imaginal डिस्क का चित्र पहली कीट विकास 1 पर उसकी व्यापक मोनोग्राफ का हिस्सा के रूप में अगस्त Weismann द्वारा 1864 में प्रकाशित किए गए थे. इन डिस्क्स 1-14 उड़ वयस्क के भीतर पाए जाते हैं कि वयस्क संरचनाओं के एक उच्च प्रतिशत को जन्म दे अंततः जल्दी पोटा संबंधी चरणों का भारी histolysis जीवित है, और, लार्वा चरणों के दौरान नमूनों हैं, embryogenesis दौरान उनके विकास शुरू करते हैं. लार्वा के विकास के दौरान प्रत्येक डिस्क भाग्य, आकृति और आकार के बारे में कई महत्वपूर्ण निर्णय करता है. पहले और दूसरे लार्वा instars भीतर, डिस्क, एक प्राथमिक भाग्य को गोद लेने के साथ स्थापित किया गया काम सौंपासही आकार को गोद लेने और कोशिकाओं 15-16 की अपेक्षित संख्या पैदा करने, डिब्बे सीमाओं hing. तीसरे लार्वा instar और जल्दी पूर्व पोटा संबंधी चरण के दौरान, imaginal डिस्क को विभाजित करने के लिए जारी है और कोशिकाओं उनके टर्मिनल भाग्य 16 अपनाने के रूप में नमूनों हैं.
ड्रोसोफिला विकासात्मक जीव विज्ञान के शुरुआती इतिहास के दौरान, imaginal डिस्क सामान्य विकास के संदर्भ में और एक हानि या लाभ के समारोह उत्परिवर्ती व्यवहार्य था जिसमें सीमित मामलों में लगभग विशेष रूप से अध्ययन किया गया. एक्स रे का उपयोग घातक म्यूटेशन के लिए अनुमति दी mitotic पुनर्संयोजन लार्वा और वयस्क ऊतकों के भीतर सेल क्लोन में विश्लेषण किया प्रेरित करने के लिए. इस विधि लार्वा और वयस्क ऊतकों दोनों में म्यूटेशन नुकसान का विश्लेषण और लाभ के समारोह के लिए ट्रांसजेनिक विधियों के लागू होने से सुधार किया गया है. जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ऊतकों की आणविक परिदृश्य वर्णन करने के लिए एंटीबॉडी, ट्रांसक्रिप्शनल पत्रकारों और प्रोटीन जाल की संख्या भी const हैantly बढ़ रहा है. उत्परिवर्ती सेल क्लोन नुकसान का विश्लेषण और लाभ के समारोह के लिए इन आणविक मार्कर का उपयोग यह तेजी संभव उत्परिवर्ती कोशिकाओं के विकास के दौरान उनके जंगली प्रकार चचेरे भाई से विचलित कैसे की एक वास्तविक समय समझ हासिल करने के लिए बनाया गया है. ठीक से इन उपकरणों और अभिकर्मकों का लाभ लेने के लिए, देखी फोटो खिंचवाने और विश्लेषण किया जा सकता है कि imaginal डिस्क की उच्च गुणवत्ता की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है. इस पांडुलिपि के लक्ष्य आंख antennal डिस्क जटिल (चित्रा 1 ए) के अलगाव और तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करना है. यह भी सफलतापूर्वक पंख, halteres, T1-T3 पैर और जननांगों (चित्रा 1 बी ई) को जन्म दे कि उन सहित अतिरिक्त डिस्क की एक विस्तृत विविधता को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मामूली संशोधनों के साथ यह प्रक्रिया लगभग अस्सी साल के लिए ड्रोसोफिला से imaginal डिस्क को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
सबसे जीन म्यू दौरान व्यक्त कर रहे हैं क्योंकि जैसा कि ऊपर वर्णित है,विकास की और ऊतकों की एक भीड़ में चरणों LTIPLE, यह पशु तीसरे instar लार्वा चरण से पहले अच्छी तरह से मर जाता है के रूप में अशक्त म्यूटेंट पूरी आँख पर है कि प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अक्सर असंभव है. चार विधियों ऐसे काफी अधिक विनयशील रेटिना के रूप में और अधिक विकसित ऊतकों का अध्ययन किया है. पहले एक अन्यथा जंगली प्रकार के ऊतकों 17-19 के भीतर उत्परिवर्ती सेल क्लोन पैदा करने की Flippase (FLP) / Flippase पुनर्संयोजन लक्ष्य (FRT) विधि है. इस उदाहरण में उत्परिवर्ती ऊतक ऐसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में एक दृश्य मार्कर के अभाव द्वारा की पहचान की है और GFP मौजूद है जिसमें आसपास के जंगली प्रकार के ऊतकों (चित्रा 2 डी) की तुलना में किया जा सकता है. दूसरा एक transgene कोशिकाओं 20 की आबादी में व्यक्त किया जाता है, जिसमें "FLP आउट" विधि है. इस उदाहरण में सेल क्लोन GFP संवाददाता का अभाव है कि आसपास के जंगली प्रकार के ऊतकों (चित्रा को GFP की उपस्थिति से पहचान और तुलना कर रहे हैं2 ई). तीसरे FLP / FRT उत्परिवर्ती क्लोन और FLP आउट अभिव्यक्ति सिस्टम 21 के तत्वों को जोड़ती है जो एक Repressible सेल मार्कर (MARCM) तकनीक, साथ मोजाइक विश्लेषण है. इस विधि के साथ एक transgene एक साथ एक व्यक्ति आनुवंशिक लोकस के लिए उत्परिवर्ती हैं कि कोशिकाओं की आबादी के भीतर व्यक्त किया जा सकता है. FLP आउट क्लोन की तरह, MARCM क्लोन GFP की उपस्थिति से पहचान और GFP मार्कर (चित्रा 2 एफ) का अभाव है कि आसपास के जंगली प्रकार के ऊतकों की तुलना में कर रहे हैं. और अंत में, जीन और आरएनएआई निर्माणों विशिष्ट प्रमोटर-GAL4 निर्माणों के नियंत्रण में imaginal ऊतकों के भीतर व्यक्त किया जा सकता है. उत्परिवर्ती या अधिक अभिव्यक्ति क्लोन या पैटर्न सीधे सटे जंगली प्रकार के ऊतकों की तुलना में किया जा सकता है के बाद से इन चार तरीकों imaginal डिस्क अध्ययन में रुचि बढ़ गई है. इस प्रक्रिया में वर्णित विधि विकसित किया गया है कि ताकि ड्रोसोफिला में वयस्क ऊतकों के बाद भ्रूण के विकास का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं,विशेष रूप से आंख antennal डिस्क से व्युत्पन्न उन, विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक प्राप्त करने में सक्षम हो जाएगा. व्यक्तिगत शोधकर्ताओं मामूली संशोधन किए गए हैं, इस प्रक्रिया (हम यहाँ का वर्णन है) के कोर काफी हद तक अनछुए रह गया है. उच्च गुणवत्ता ऊतक प्राप्त हम यह लिखा प्रोटोकॉल और साथ वीडियो एक मूल्यवान शिक्षण संसाधन के रूप में काम करेगा आशा imaginal डिस्क के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से.
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Protocol
लार्वा के 1. तैयारी
- विच्छेदन बफर के साथ एक 35 मिमी पेट्री डिश भरें.
- पेट्री डिश में लार्वा प्लेस और उन्हें कुछ ही मिनट (स्वयं सफाई कदम) के लिए चारों ओर तैरने के लिए अनुमति देते हैं.
- एक सिलिकॉन आधारित विच्छेदन प्लेट पर विच्छेदन बफर का एक पूल के लिए लार्वा स्थानांतरण. इस पूल प्लेट के एक किनारे पर होना चाहिए. विच्छेदन प्लेट एक गिलास पेट्री डिश के भीतर डाला और कठोर कर दिया गया है कि एक सिलिकॉन समाधान के होते हैं.
- एक पाश्चर-pipet का प्रयोग, विच्छेदन प्लेट के बीच में विच्छेदन बफर का एक बड़ा पूल जगह है.
- # 5 संदंश का प्रयोग, विच्छेदन बफर का बड़ा पूल के लिए छोटे पूल से एक भी साफ लार्वा हस्तांतरण.
लार्वा के 2 मोटे विच्छेदन
- लार्वा विच्छेदन बफर का बड़ा पूल के भीतर अभी भी है संदंश साथ लार्वा आलिंगन. संदंश की दूसरी जोड़ी anim पकड़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि संदंश की एक जोड़ी मुंह हुक हड़पने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएअल अभी भी (1/3 शरीर की लंबाई में धीरे लार्वा हड़पने).
- जल्दी संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ दूर शरीर के बाकी खींच जबकि मुंह हुक के पास छल्ली युक्त संदंश की जोड़ी स्थिर पकड़.
- लार्वा फाड़ शुरू होता है जब आप तनाव में मामूली रिहाई लगेगा. संदंश से लार्वा को छोड़ दें और बाहर फैल लार्वा की "हिम्मत" के लिए अनुमति देते हैं. यह अपने सामान्य रचना में रहने के लिए imaginal डिस्क के लिए अनुमति देता है और विकृत होने से उन्हें रोकता है.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ जगह में लार्वा के सामने के छोर पकड़ को फिर मुंह हुक समझ. का प्रयोग संदंश की दूसरी जोड़ी भीतरी हिम्मत सहित लार्वा की 2/3 कम हटा दें. नोट: मुंह हुक, आंख antennal डिस्क, मस्तिष्क गोलार्द्धों, उदर नाड़ीग्रन्थि, लार ग्रंथियों, कुछ पैर डिस्क युक्त एक जटिल, और overlying छल्ली रहेगा.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ धीरे overlying छल्ली, लार ग्रंथियों, पैर डिस्क और हटानेअन्य ऊतक. नोट: केवल मुंह हुक, आंख antennal डिस्क, मस्तिष्क गोलार्द्धों है रहना चाहिए कि ऊतक, और उदर नाड़ीग्रन्थि (चित्रा 3).
- दोहराएँ 15-20 मिनट के लिए अतिरिक्त लार्वा साथ 2.1-2.5 कदम. नोट: समय की लंबी अवधि के लिए विच्छेदन बफर में रहते हैं कि imaginal डिस्क अपमानित करने के लिए करते हैं और अंत में फोटो खिंचवाने के लिए आदर्श नमूनों की तुलना में कम के रूप में दिखाई देगा. इस प्रकार, सभी विच्छेदित ऊतकों पीएलपी लगानेवाला के लिए स्थानांतरित किया जाना चाहिए 20 मिनट की एक अधिकतम के बाद (नीचे देखें).
एंटीबॉडी के साथ 3 फिक्सेशन और ऊतकों की धुंधला
- एक पी 200 Pipetman का उपयोग करना, ठंड Paraformaldehyde-लाइसिन-periodate (पीएलपी) लगानेवाला युक्त एक घड़ी गिलास को विच्छेदित ऊतकों हस्तांतरण. 50 μl को हस्तांतरित विच्छेदन बफर की सीमा मात्रा पीएलपी के कमजोर पड़ने कम करने के लिए. टिप उद्घाटन विच्छेदित ऊतकों को समायोजित करने के लिए पर्याप्त रूप से बड़ा है तो एक धार के साथ टिप में कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग याएक टंगस्टन सुई विच्छेदित ऊतकों पूरी तरह से उचित निर्धारण होने के लिए आदेश में डूबे हुए हैं सुनिश्चित करें. 45 मिनट के लिए ठंडे पीएलपी लगानेवाला में विच्छेदित ऊतकों सेते हैं. इस ऊष्मायन आंदोलन के बिना आरटी पर जगह ले सकते हैं.
- एक पी 200 Pipetman का प्रयोग, 45 मिनट के लिए एक और कटौती पीले टिप का उपयोग बफर धोने के लिए (आरटी) विच्छेदित ऊतकों हस्तांतरण. 50 μl को हस्तांतरित पीएलपी की सीमा मात्रा धोने बफर के कमजोर पड़ने कम करने के लिए. नोट: सभी विच्छेदित ऊतकों पूरी तरह से जलमग्न हो जाना चाहिए.
- 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब को विच्छेदित ऊतक के 20-30 सेट स्थानांतरण. नोट: आंख antennal डिस्क परिसरों की बड़ी संख्या ट्यूब के भीतर संयुक्त रहे हैं, ट्यूब के नीचे ऊतक एंटीबॉडी को ठीक से नहीं खुल जाएगा कि वहाँ एक संभावना है. इष्टतम परिणामों के लिए अधिक नहीं 20-30 आंख antennal डिस्क परिसरों एक एकल ट्यूब के भीतर मौजूद होना चाहिए. विच्छेदित ऊतक microfuge ट्यूब के नीचे करने के आदी हो जाएगा. इसलिए, में बाद के चरणों यूहटाने और धोने बफर, अवरुद्ध समाधान, और एंटीबॉडी को बदलने के लिए एक Pipetman se.
- धोने बफर निकालें और अवरुद्ध समाधान के 100 μl के साथ बदलें: धो बफर में 10% सामान्य बकरी सीरम. 10 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष रोटेटर पर कोमल रोटेशन के साथ आरटी पर सेते हैं.
- अवरुद्ध समाधान निकालें और उचित रूप से 10% सामान्य बकरी सीरम में पतला किया गया है कि प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 μl के साथ बदलें. 16 घंटे के लिए कोमल रोटेशन के साथ आरटी पर सेते हैं.
- प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और धोने बफर के 750 μl के साथ बदलें. एक nutator पर ट्यूब प्लेस और 10 मिनट के लिए आरटी पर nutate के लिए अनुमति देते हैं. नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी (4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर) को बचाया और बाद में पुन: उपयोग किया जा सकता है. एंटीबॉडी कई बार पुनर्प्रयोग गैर विशिष्ट बंधन को कम करने में मदद कर सकते हैं.
- सिर तो, ट्यूब के नीचे बसा धोने बफर हटाने और उचित रूप से 10% सामान्य सीरम में पतला किया गया है कि माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μl जोड़ने के लिए अनुमति. कोमल रोटेशन के लिए साथ आरटी पर सेते 2̵1, 4 घंटा.
- ऊतक से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और धोने बफर के 500 μl के साथ बदलें. ऊतक ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें.
- एक पी 200 और एक कट पीले टिप का उपयोग करना, विदारक पकवान पर रखा गया है कि धोने बफर के एक पूल के लिए सभी विच्छेदित ऊतकों हस्तांतरण. ठीक विच्छेदन के अगले कदम के साथ आगे बढ़ने जबकि, ऊतक धोने बफर में सेते जाएगा. इस अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी को दूर करने में मदद करता है.
4 नेत्र Antennal डिस्क परिसर के ठीक विच्छेदन और स्लाइड पर बढ़ते
- नीचे की ओर का सामना करना पड़ परिसर के उदर पक्ष के साथ मुंह हुक से छल्ली पकड़ संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. संदंश की एक दूसरी जोड़ी के साथ मस्तिष्क और आंख डिस्क के बीच अंतरिक्ष में (चित्रा 3, लाल तीर) दूसरे संदंश बंद करने और तेजी से मुंह हुक से दूर मस्तिष्क खींच कर दो मस्तिष्क पालियों हटा दें.
- मुंह हुक पर पकड़ जारी रखते हुए बंद चुटकीआंख antennal डिस्क की antennal खंड और मुंह हुक (चित्रा 3, नीले तीर) के बीच संबंध के लिए संभव के रूप में बंद ऊतक. नोट: आंख antennal डिस्क परिसरों सभी ऊतक (चित्रा 1 ए) से मुक्त होना चाहिए. स्लाइड पर रखा जा सकता है कि यात्रा की सभी वांछित ऊतक विच्छेदित कर दिया गया है जब तक जारी रखें. इस प्रोटोकॉल विंग, haltere, पैर और जननांग imaginal डिस्क (चित्रा 1 बी ई) को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
- टिशू पेपर के दो छोटे टुकड़े (coverslips का आकार) लगभग 3 में जोड़ें. अलग विदारक पकवान पर. पकवान पर एक गिलास स्लाइड जगह - टिशू पेपर के दो टुकड़े स्लाइड के सिरों के तहत होना चाहिए. इस विदारक पकवान की सिलिकॉन आधार से चिपके से स्लाइड पाएगा.
- एक काटा हुआ टिप के साथ एक पी -20 का प्रयोग, गिलास खुर्दबीन स्लाइड के बीच करने के लिए एक विरोधी विरंजन एजेंट के 9 μl जोड़ें. फ्लोरोसेंट साथ देखे जाने पर यह ऊतक के विरंजन रोकताप्रकाश.
- वही काटा हुआ टिप का उपयोग करना, सब आंख antennal डिस्क इकट्ठा और विरोधी विरंजन अभिकर्मक की बूंद के लिए उन्हें जोड़ने. पर किया जाता है कि धोने बफर की मात्रा को कम. 10 μl या कम करने के लिए धोने बफर की राशि को सीमित करने का प्रयास करें.
- अलग और विरोधी विरंजन अभिकर्मक की बूंद के भीतर आंख antennal डिस्क बाहर का प्रसार करने के संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. डिस्क कई मिनट के लिए विरोधी विरंजन अभिकर्मक में सेते दें. नोट: ऊतक विरोधी विरंजन अभिकर्मक अवशोषित के रूप में डिस्क स्पष्ट हो जाएगा.
- ठीक एक तूलिका का प्रयोग धीरे नमूना पर एक coverslip कम है. यह हवा के बुलबुले के गठन से बचाता है.
- स्टोर प्रकाश या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग आंख antennal या अन्य imaginal डिस्क देखने के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड.
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Representative Results
मज़बूती से ऊपर वर्णित विधि सीटू जांच, ट्रांसक्रिप्शनल पत्रकारों, प्रोटीन जाल और एंटीबॉडी के साथ विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता की सामग्री का उत्पादन करता है. चित्र 1 में हम नियमित रूप से इस विधि के साथ बरामद कर रहे हैं कि आंख एंटीना, जननांग, पंख, haltere और पैर डिस्क प्रदर्शित करते हैं. इन डिस्क्स एफ actin को बांधता है और इसलिए प्रत्येक कोशिका की रूपरेखा जो एक phalloidin संयुग्मित फ्लोरोफोरे, साथ इलाज किया गया है. ऊतक तो ठीक से आंख डिस्क की Morphogenetic कुंड तय कर दी गई है, गाढ़ा ऊतक के किनारों जननांग, स्पर्शतंतु और पैर डिस्क में सिलवटों, और पंख और haltere डिस्क की पृष्ठीय उदर अक्ष सभी के रूप में तेज किनारों दिखाई देगा . एक ऊतक ठीक से तो तय हो गई है, तो एंटीबॉडी, फ्लोरोसेंट प्रोटीन और सीटू जांच में भी तेज पैटर्न खोलेगा. कई उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. जबकि विभिन्न एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया है कि शीर्ष तीन पैनलों प्रदर्शन डिस्ककम तीन पैनलों GFP कोशिकाओं की आबादी चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है जिसमें डिस्क दिखा.
आंख antennal डिस्क की सबसे मुख्य विशेषताओं में से एक पृष्ठीय उदर अक्ष 1, 22 के साथ चल रहे ऊतक के भीतर एक खरोज के रूप में देखा जा सकता है जो Morphogenetic कुंड (चित्रा 1 ए), है. सभी कोशिकाओं तीसरे लार्वा instar से पहले के भीतर विकासशील आंख, unpatterned undifferentiated, और एक दूसरे से आकृति विज्ञान अप्रभेद्य हैं. तीसरे लार्वा instar के शुरू में Morphogenetic कुंड आंख क्षेत्र के पीछे मार्जिन पर शुरू की और आंख / स्पर्शतंतु सीमा 22 की ओर पूर्व से प्रगति. कुंड आंख क्षेत्र में प्रगति अव्यवस्थित कोशिकाओं के समुद्र समय समय पर स्थान दिया इकाई आँखें या ommatidia (चित्रा 1 ए) 22-23 के एक आदेश सरणी में तब्दील हो जाता है. आगे Pax6 Homolog अंधा (Ey) भी शामिल है कि एक जीन विनियामक नेटवर्क कुंड के चैनलों कोशिकाओंएक आँख भाग्य (2A चित्रा) 15 की ओर. कुंड खुद की दीक्षा और प्रगति के रास्ते 24-29 संकेत हाथी (एच एच) और Decapentaplegic (डीपीपी) की गतिविधियों पर निर्भर है. दरअसल एक DPP-lacZ रिपोर्टर ईमानदारी कुंड (चित्रा 2B) 30-31 के भीतर डीपीपी लोकस की अभिव्यक्ति को दर्शाता है. कोशिकाओं कुंड से बाहर निकलें और अपने टर्मिनल भाग्य को अपनाने के लिए शुरू के रूप में, वे इस तरह के एक अखिल neuronal शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन (चित्रा -2) 32-34 encodes जो भ्रूण घातक असामान्य दृष्टि (elav), के रूप में सेल विशिष्ट मार्करों व्यक्त करते हैं.
चित्रा 1 ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के imaginal डिस्क. (
आँख imaginal डिस्क चित्रा 2 Clonal और अभिव्यक्ति विश्लेषण (ए - एफ). आँख imaginal डिस्क के confocal छवियों. (ए) Pax6 प्रोटीन अंधा (Ey) मोटे तौर पर आगे Morphogenetic कुंड का वितरित किया जाता है. (बी) एक DPP-lacZ ट्रांसक्रिप्शनल reporteआर Hh संकेतन का जवाब और Morphogenetic कुंड के भीतर व्यक्त किया है. (सी) Elav Morphogenetic कुंड के पीछे सभी विकासशील फोटोरिसेप्टर में वितरित किया जाता है अखिल neuronal शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन. (डी) FLP / FRT प्रणाली द्वारा उत्पन्न हानि के समारोह क्लोन युक्त एक आंख डिस्क. क्लोन GFP (ई) की कमी से पहचाने जाते हैं. FLP आउट सिस्टम के साथ उत्पन्न अधिक अभिव्यक्ति क्लोन युक्त एक आंख डिस्क. क्लोन सकारात्मक GFP के साथ चिह्नित हैं. (एफ) MARCM क्लोन युक्त एक आंख डिस्क. FLP आउट प्रणाली की तरह, MARCM क्लोन GFP की मौजूदगी से पहचाना जा सकता है. सभी का पता चला प्रोटीन और जीनोटाइप आंकड़ा भीतर सूचीबद्ध हैं. पूर्वकाल सही करने के लिए है और पृष्ठीय ऊपर है.
चित्रा 3 नेत्र एंटीना मस्तिष्क जटिल. एक स्कूलपहले दिन मोटे विच्छेदन उत्पादों की ematic ड्राइंग. तय किया जाना चाहिए कि केवल ऊतकों, आंख एंटीना डिस्क और मस्तिष्क (- नहीं दिखाया उदर नाड़ीग्रन्थि के रूप में अच्छी तरह से संलग्न रहेगा अक्सर बार) मुंह हुक हैं. बैंगनी = मस्तिष्क, हरी = आंख एंटीना डिस्क, भूरा = मुंह हुक. पूर्वकाल सही करने के लिए है. पैर, पंख, haltere और जननांग डिस्क विदारक हैं, लार्वा के बाहरी छल्ली अभी भी इन ऊतकों से जुड़ी होनी चाहिए. आप विभिन्न एंटीबॉडी, ब्लॉक और धोने के समाधान के माध्यम से बाद के स्थानान्तरण के दौरान imaginal डिस्क खो सकता है के रूप में overlying छल्ली न निकालें. अतिरिक्त ऊतक ठीक विच्छेदन कदम (4.1-4.2) के दौरान हटाया जा सकता है.
चित्रा 4 ड्रोसोफिला लार्वा के भीतर imaginal डिस्क की स्थिति. स्कीमाएक तिहाई instar लार्वा के भीतर आंख एंटीना, पैर, पंख, haltere और जननांग डिस्क के रिश्तेदार की स्थिति की टिक ड्राइंग. आंख antennal डिस्क हरे रंग में रंग जाता है, पैर डिस्क नीले रंग में, लगाम डिस्क बैंगनी में है, पंख डिस्क / भूरे रंग में नारंगी और जननांग डिस्क हल्के भूरे रंग में है. पूर्वकाल सही करने के लिए है.
| समाधान के नाम |
| 8% Paraformaldehyde |
| 0.2 एम सोडियम फास्फेट अकेले आधार |
| 0.2 एम सोडियम फास्फेट Disbasic |
| 1 एन सोडियम हीड्राकसीड |
| 10% ट्राइटन |
| 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (विच्छेदन बफर) |
| 0.1 एम सोडियम फास्फेट बफर 0.1% ट्राइटन (धो बफर) |
| लाइसिन बफर |
| 2% paraformaldehyde-लाइसिन-periodate लगानेवाला (पीएलपी) |
| 10% सामान्य बकरी सीरम |
तालिका 1: आवश्यक समाधान की सूची.
| 8% Paraformaldehyde शेयर समाधान |
| एक 50 मिलीलीटर Erlenmeyer फ्लास्क में निम्नलिखित जोड़ें: |
| 2.0 ग्राम paraformaldehyde |
| आसुत जल का 23.0 मिलीलीटर |
| 1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड के 4.0 बूँदें (एक गिलास पाश्चर pipet से) |
| समाधान एक सज्जन फोड़ा पहुँचता है जब तक हलचल प्लेट पर मिक्स और गर्मी |
| Paraformaldehyde पूरी तरह भंग है जब तक धीरे उबाल करने की अनुमति दें |
| (पूर्व प्रत्येक विच्छेदन के लिए ताजा कर) ठंड जब तक बर्फ पर रखें |
| 0.1 एम फॉस्फेट बफर (विच्छेदन (पी) बफर) |
| एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में निम्नलिखित जोड़ें: |
| 18.0 मिलीलीटर 0.2 एम सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय |
| 7.0 मिलीलीटर 0.2 एम सोडियम फास्फेट अकेले आधार |
| 25.0 मिलीलीटर आसुत जल |
| स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस (1 सप्ताह शेल्फ जीवन) पर |
| 0.1 एम फॉस्फेट + डिटर्जेंट बफर (वाश (डब्ल्यू) बफर) |
| एक से 50एमएल शंक्वाकार ट्यूब निम्नलिखित जोड़ें: |
| 18.0 मिलीलीटर 0.2 एम सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय |
| 7.0 मिलीलीटर 0.2 एम सोडियम फास्फेट अकेले आधार |
| 25.0 मिलीलीटर आसुत जल |
| 0.5 मिलीलीटर 10% ट्राइटन |
| आरटी पर स्टोर (1 सप्ताह शेल्फ जीवन) |
| लाइसिन (एल) बफर |
| एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में निम्नलिखित जोड़ें: |
| 0.4 ग्राम लाइसिन |
| 1.2 मिलीलीटर 0.2 एम सोडियम फास्फेट द्विक्षारकीय |
| 8.0 मिलीलीटर विच्छेदन (पी) बफर |
| 10.0 मिलीलीटर आसुत जल |
| लाइसिन पूरी तरह भंग है जब तक समाधान हिला |
| (पूर्व प्रत्येक विच्छेदन के लिए ताजा कर) ठंड जब तक बर्फ पर रखें |
| 2% paraformaldehyde - लाइसिन - periodate (पीएलपी) लगानेवाला |
| 0.1 ग्राम सोडियम periodate |
| लाइसिन (एल) बफर के 15.0 मिलीलीटर |
| 8% paraformaldehyde की 5.0 मिलीलीटर |
| सोडियम periodate पूरी तरह भंग है अच्छी तरह से जब तक हल हिला |
| (पूर्व प्रत्येक विच्छेदन के लिए ताजा कर) ठंड जब तक बर्फ पर रखें |
तालिका 2: आवश्यक समाधान के लिए व्यंजनों.
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Discussion
इस प्रक्रिया काफी हद तक अलगाव और आंख antennal डिस्क के बाद उपचार पर ध्यान केंद्रित किया गया है, यह अलग और विंग, haltere, पैर और जननांग डिस्क (चित्रा 4) का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए उत्तरदायी है. (आंख antennal डिस्क के खिलाफ) इन डिस्क के लिए अलग प्रोटोकॉल का केवल आवश्यक संशोधन मोटे विच्छेदन (प्रोटोकॉल की धारा 2) की विधि है. पहले वक्ष पैर (T1) जोड़ी लार्वा के पूर्वकाल में पाया जाता है और आंख antennal डिस्क अलगाव के लिए प्रोटोकॉल का पालन करके ठीक किया जा सकता. हालांकि दूसरे वक्ष पैर (टी 2) डिस्क छल्ली से जुड़े होते हैं. संदंश की एक और जोड़ी जानवर के उदर छल्ली पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जबकि (जैसा कि ऊपर वर्णित) संदंश की एक जोड़ी मुंह हुक पकड़ करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए इन डिस्क्स को अलग करने के लिए (से लार्वा के बारे में 1/3 पकड़ करने के लिए सुनिश्चित करें मुंह हुक. लार्वा बस LAR के बाकी हिस्सों से दूर वेंट्रल छल्ली फाड़ द्वारा पट्टिका किया जा सकता हैVA. टी 2 पैर छल्ली से जुड़ी रहेगी. तीसरे वक्ष (T3) पैर भी छल्ली से जुड़ा हुआ है जो अपने आप में एक जटिल, के हिस्से के रूप में दक्षिणपंथी और haltere डिस्क से जुड़ा हुआ है. आप प्रक्रिया के ठीक विच्छेदन भाग के दौरान डिस्क इस स्तर पर छल्ली से डिस्क जटिल और टी 2 पैर अलग या बाद के निर्धारण / एंटीबॉडी ऊष्मायन चरणों के दौरान एक साथ छल्ली डिस्क जटिल रखने और अलग करने के लिए चुन सकते हैं (धारा 4) . जननांग डिस्क ठीक करने के लिए, यह संदंश की एक जोड़ी के साथ midsection पर लार्वा समझ और फिर दूर midsection में शुरू करने और लार्वा के पीछे के अंत में समाप्त होने संदंश के अन्य जोड़ी के साथ उदर छल्ली छील करने के लिए सबसे अच्छा है. यह संदंश दूर सभी बाहरी ऊतक स्पष्ट और फिर एक पी 200 Pipetman और जिसका अंत एक धार के साथ काट दिया गया है एक पीले रंग की टिप का उपयोग लगानेवाला समाधान के लिए सिर्फ जननांग डिस्क हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सिफारिश की है.
यह प्रक्रिया TISS के लिए सबसे उपयुक्त हैऐसे imaginal डिस्क के रूप में सीमित मोटाई की ues और काम करता है सबसे अच्छा इस्तेमाल किया जा रहा एंटीबॉडी उच्च अनुमापांक और विशिष्टता की हैं. हालांकि, यह इस तरह के वयस्क अंडाशय, वृषण, और मस्तिष्क के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कम अनुमापांक एंटीबॉडी या वांछित "पृष्ठभूमि" धुंधला से अधिक देना है कि उन लोगों के साथ मोटा ऊतकों के साथ अच्छी तरह से काम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता. मोटा ऊतकों के साथ काम कर रहा है, यह इष्टतम परिणाम केवल paraformaldehyde की एकाग्रता बढ़ती है और / या समय की लंबी अवधि के लिए पीएलपी लगानेवाला में incubating द्वारा प्राप्त किया जा सकता का सुझाव दिया है. विच्छेदित ऊतकों के समुचित निर्धारण इस प्रोटोकॉल के साथ सफलता के लिए आवश्यक है के बाद से यह भी paraformaldehyde एकाग्रता बढ़ती है और / या निर्धारण लंबाई बढ़ाने की दक्षता phalloidin (चित्रा 1) के साथ मूल्यांकन किया जा सुझाव दिया है. विशेष रूप से, करीब ध्यान ऊतक के भीतर सेल रूपरेखा और अन्य शारीरिक स्थलों की "कुशाग्रता" करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए (यानी, morphogenetic कुंड). एक अन्य तरीका ठीक से तय हो गई है अपने ऊतक (विशेष रूप से मोटा नमूने) 8% paraformaldehyde और पूर्व प्रत्येक विच्छेदन के लिए ताजा पीएलपी समाधान तैयार करने के लिए है कि यह सुनिश्चित करने के लिए. ऊतक समय का संक्षिप्त अवधि के लिए विच्छेदित है और ऊतकों के रूप में जल्द से जल्द लगानेवाला में स्थानांतरित कर रहा है और अगर अंत में, विच्छेदन के समग्र गुणवत्ता बढ़ाई जा सकती है. यह 15-20 मिनट से अधिक समय नहीं के लिए विदारक सुझाव दिया है. छोटी अवधि के लिए विदारक ऊतक संरक्षण की गुणवत्ता बढ़ जाती है.
इस प्रोटोकॉल एंटीबॉडी की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन यह कुछ एंटीबॉडी पीएलपी लगानेवाला के साथ अच्छी तरह से काम नहीं करते कि सच है. एक कुख्यात उदाहरण रफ (आरओ) प्रतिलेखन कारक पहचानता है कि एंटीबॉडी है. किसी न किसी के भीतर व्यक्त किया है और फोटोरिसेप्टर 35 के विकास का एक सबसेट के विनिर्देशन के लिए आवश्यक है. विरोधी रो एंटीबॉडी नहीं पीएलपी के साथ, सबसे अच्छा काम करता है, लेकिन बल्कि एक पाइप के साथ - EGTA - 4 MgSO (पीईएम) बीuffer 36. इसी तरह, अन्य एंटीबॉडी अभी भी अन्य fixatives में incubated किया गया है कि ऊतकों पर सबसे अच्छा काम कर सकते हैं. यह जब तक अन्यथा कहा, पीएलपी लगानेवाला पहले की कोशिश की जानी चाहिए, सुझाव दिया है. शुरू करना चाहिए एक वैकल्पिक लगानेवाला खोजने की प्रक्रिया फिर असफल हैं.
सामना करने के लिए एक आम मुद्दा प्रश्न में एंटीबॉडी का काम एकाग्रता है. अक्सर बार आप अपने हित के ऊतकों में प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक विशेष एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए पहली शोधकर्ता हो सकता है. काम कर रहे एकाग्रता अन्य ऊतकों के लिए सूचित किया जाता है से विचलित कर सकते हैं. यह सिफारिश की एकाग्रता पहले की कोशिश की जा सुझाव दिया है. एक संकेत नहीं देखा जा सकता है अगर एंटीबॉडी की एकाग्रता में वृद्धि. सिफारिश की एकाग्रता देता है तो दूसरी ओर, तो एंटीबॉडी गिराए उच्च पृष्ठभूमि धुंधला करने की कोशिश की जानी चाहिए. एंटीबॉडी के बीच काम कर रहे सांद्रता भिन्न हो सकते हैं. विरोधी जबकि 5: उदाहरण के लिए, विरोधी आंखें अनुपस्थित (eya) एंटीबॉडी 1 पतला है500 कमजोर पड़ने: Elav एंटीबॉडी भी एक 1 पर अच्छी तरह से काम करता है. 3000: कुछ एंटीबॉडी भी जहाँ तक नीचे 1 के रूप में पतला किया जा सकता है. साथ ही, इस प्रक्रिया, लिखित रूप में, उच्च विशिष्टता एंटीबॉडी के साथ सबसे अच्छा काम करता है. कई अनुभवी है लेकिन, जैसा कि कुछ एंटीबॉडी के ऊतकों को गैर विशेष रूप से बाध्य कर सकते हैं और यह एक उप इष्टतम छवि बना सकते हैं. यह स्थिति अक्सर तय imaginal डिस्क में जोड़ा जा रहा से पहले तय भ्रूण या लार्वा शवों के साथ पतला एंटीबॉडी incubating द्वारा सुधारा जा सकता है. गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला के स्तर पर निर्भर करता है, "पूर्व अवशोषण" के लिए आवश्यक लंबाई भिन्न हो सकते हैं और एक परीक्षण के आधार पर बाहर काम करना होगा. यह कई बार फिर से उपयोग कर एंटीबॉडी द्वारा या पूर्व अवशोषण के कई दौर के संचालन से संकेत / शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए भी संभव है.
डिस्क प्रकाशन और / या प्रस्तुतियों में इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जिस पर निर्णय लेने, इसे उन्मुख शिखर पक्ष के साथ उन्मुख किया गया है कि डिस्क का चयन करने के लिए सबसे अच्छा है वार्डों. यह भी मुड़ा नहीं कर रहे हैं कि डिस्क का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. यह आंख antennal डिस्क की विशेष रूप से सच है. डिस्क के उदर पक्ष गुना करने के लिए जाता है और दुर्भाग्य से, छोटे से एक हो रहा से इसे रोकने के लिए क्या कर सकते है. एक समाधान के इन अब तक कम गुना करने के लिए करते हैं के रूप में छोटे डिस्क टुकड़े करना है. एक अन्य विकल्प है कि आप पूरी तरह से सपाट है कि एक मिल तक सिर्फ डिस्क की बड़ी संख्या को काटना है. आंख antennal डिस्क के समग्र आकार लार्वा बर्बाद कर दिया है जिस दर से प्रभावित हो सकते हैं. एक भी जल्दी अलावा मस्तिष्क डिस्क जटिल गुजरता है, जिसके माध्यम से छेद लार्वा खींचती है तो छोटा है और आंख antennal डिस्क बाहर मुड़ा और / या बढ़ाया आता है. यह लार्वा छेद बड़ा हो जाएगा के बाद से आंसू शुरू होता है जब तक धीरे धीरे खींचने के लिए सबसे अच्छा है. तो फिर आप धीरे धीरे मस्तिष्क आंख antennal डिस्क जटिल खींचने के लिए जारी रख सकते हैं. आप भी धीरे धीरे खींच कभी नहीं कर सकते हैं कि मन में रखिए. इसके अलावा आप ऊतक आंसू दर है जिस पर अन्य ऊतकों के अलगाव में एक कारक नहीं है कि ध्यान दें.
ve_content "> ड्रोसोफिला के जीवन चक्र तीन लार्वा चरण होते हैं. महत्वपूर्ण विकासात्मक घटनाओं इस प्रकार यह (इस प्रक्रिया का मुख्य लक्ष्य है) न सिर्फ तीसरे लार्वा instars से ऊतकों को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, इन चरणों में से हर एक के दौरान जगह ले लेकिन यह भी दोनों पहले और दूसरे लार्वा से एक मामूली अपवाद के साथ, इस प्रक्रिया दूसरे instar डिस्क को अलग करने, लिखित रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. के रूप में अच्छी तरह से instars. प्रक्रिया के ठीक विच्छेदन भाग (धारा 4) के दौरान यह तेज टंगस्टन की सिफारिश की है तार मुंह हुक, मस्तिष्क और लार ग्रंथियों की तरह बाहरी ऊतक से आंख antennal डिस्क अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. टंगस्टन तार भी एक दूसरे को और overlying छल्ली से टी 2 / T3 पैर, पंख और haltere डिस्क अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . यह टंगस्टन तार (ऊतकों को अलग करने के लिए उपयोग किया जाएगा जो अंत) के एक छोर एक उबलते सोडियम नाइट्रेट स्नान में हीटिंग द्वारा बढ़ाई जा अनुशंसा करते हैं कि दूसरे छोर एक पिन शिकंजा में डाला जा सकता है,. वेंआप और अधिक आसानी से टंगस्टन तार पकड़ करने की अनुमति देगा है. दुर्भाग्य से, यह आप स्लाइड पर पूरे आंख antennal डिस्क / मस्तिष्क / मुंह हुक जटिल जगह और एक coverslip के साथ कवर कि, इसलिए यह सिफारिश की है बरकरार पहले instar डिस्क को अलग करने के लिए काफी मुश्किल है. विच्छेदित ऊतक की राशि पूर्व स्लाइड पर डिस्क / मस्तिष्क / मुंह हुक जटिल बढ़ते छल्ली लार ग्रंथियों को दूर करने के लिए एक तेज टंगस्टन तार का उपयोग और overlying द्वारा कम किया जा सकता है. यह अभी भी मस्तिष्क और मुंह हुक से जुड़ा हुआ है जब 37 (चित्रा 6A, कुमार और मूसा, 2001 के डी देखें) पहली instar आंख antennal डिस्क की पहचान करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. अन्य imaginal डिस्क छल्ली से अलग और देखने के लिए एक स्लाइड पर रखा जाना होगा.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
हम JPK मूल imaginal डिस्क विच्छेदन प्रक्रिया को पढ़ाने के लिए डोनाल्ड तैयार और केविन मूसा को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी चित्रा 1 बी में जननांग डिस्क और चित्रा 3 चित्रा 2A, ब्रैंडन Weasner में आंख डिस्क के लिए बोनी Weasner धन्यवाद, मक्खी दाग के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र और एंटीबॉडी के लिए विकासात्मक अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक. सीएमएस स्वास्थ्य (एनआईएच) GCMS प्रशिक्षण अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान (T32-GM007757), फ्रैंक डब्ल्यू पुटनाम रिसर्च फैलोशिप, और रॉबर्ट ब्रिग्स रिसर्च फैलोशिप से एक वजीफा द्वारा समर्थित किया गया है. JPK राष्ट्रीय नेत्र संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित है (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
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