Abstract
Uma parcela significativa do desenvolvimento pós-embrionário na mosca da fruta, Drosophila melanogaster, ocorre dentro de um conjunto de estruturas de saco-como chamados discos imaginais. Estes discos de dar origem a uma elevada percentagem de estruturas de adulto que são encontrados dentro da mosca adulta. Aqui nós descrevemos um protocolo que foi otimizado para recuperar estes discos e prepará-los para a análise com anticorpos, repórteres de transcrição e armadilhas de proteína. Este procedimento é o mais adequado para os tecidos finos como discos imaginais, mas pode ser facilmente modificado para utilização com tecidos mais espessos, tais como o cérebro adulto e ovário de larvas. O protocolo escrito e vídeo que acompanha irá orientar o leitor / espectador através da dissecção de larvas de terceiro estádio, a fixação de tecidos e tratamento de discos imaginais com anticorpos. O protocolo pode ser utilizado para dissecar discos imaginais de jovens larvas de primeiro e segundo instar, bem. A vantagem deste protocolo é de que é relativamente curta e tem seren optimizado para a preservação de alta qualidade do tecido dissecado. Outra vantagem é que o processo de fixação, que é empregue funciona bem com o número esmagadora de anticorpos que reconhecem as proteínas de Drosophila. Em nossa experiência, há um número muito pequeno de anticorpos sensíveis que não funcionam bem com este procedimento. Nessas situações, o remédio parece ser a utilização de um cocktail de fixação alternativo, continuando a seguir as orientações que temos estabelecidos para as etapas de dissecação e incubações de anticorpos.
Introduction
Por mais de um século, a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, tem sido um sistema premier para estudar o desenvolvimento, comportamento e fisiologia. Desenvolvimento na mosca pode ser dividido em duas grandes etapas: embrionárias e pós-embrionárias com muito de este último ter lugar dentro de monocamada epitélios chamados discos imaginais 1-3. Desenhos de discos imaginais foram publicados pela primeira vez em 1864 por August Weismann como parte de sua ampla monografia sobre o desenvolvimento do inseto 1. Estes discos começam a se desenvolver durante a embriogênese, são modelados durante os estágios larvais, sobreviver à histólise maciça dos pupa primeiros, e, finalmente, dar origem a uma elevada percentagem de estruturas adultas que são encontrados dentro da mosca adulta 1-14. Durante o desenvolvimento larval cada disco faz várias decisões críticas sobre o destino, forma e tamanho. Dentro do primeiro e segundo estágios larvais, os discos têm a tarefa de adotar um destino primário, establishing limites dos compartimentos, adotando a forma correta e gerar o número necessário de células 15-16. Durante o terceiro estágio larval e início do estágio de pré-pupa, os discos imaginais continuam a se dividir e são modelados como células adotar seus destinos terminal 16.
Durante o início da história da biologia do desenvolvimento Drosophila, discos imaginais foram estudados quase exclusivamente no contexto do desenvolvimento normal e nos casos limitados em que a perda ou mutante ganho de função era viável. A utilização de Raios-X para induzir a recombinação mitótico permitido para mutações letais para ser analisada em clones de células no interior dos tecidos de larvas e de adultos. Este método tem sido melhorada através da introdução de métodos transgênicos para analisar a perda e ganho de função de mutações em ambos os tecidos larvais e adultas. O número de anticorpos, repórteres de transcrição e de proteínas armadilhas para descrever a paisagem molecular de tipo selvagem e mutantes de tecidos é também constantly crescente. Usando esses marcadores moleculares para analisar a perda e ganho de função clones de células mutante tornou cada vez mais viável para obter uma compreensão em tempo real de como as células mutantes se desviar de seus primos de tipo selvagem durante o desenvolvimento. Para aproveitar de forma adequada essas ferramentas e reagentes é fundamental ter preparações de alta qualidade de discos imaginais que podem ser vistos, fotografados e analisados. O objetivo deste manuscrito é proporcionar um protocolo optimizado para o isolamento e a preparação do complexo de disco olho-antenal (Figura 1A). Também pode ser utilizado com êxito para isolar uma grande variedade de discos adicionais, tais como aqueles que dão origem às asas, pernas halteres, T1-T3 e os órgãos genitais (Figura 1B-E). Este procedimento, com pequenas modificações, foi usado para isolar discos imaginais de Drosophila por quase 80 anos.
Como descrito acima, uma vez que a maioria dos genes são expressos durante multiple fases de desenvolvimento e de uma grande variedade de tecidos, ela é muitas vezes impossível para estudar os efeitos que os mutantes nulos tem em todo o olho, o animal morre muito antes do estágio de larva de terceiro instar. Quatro métodos de ter feito o estudo dos tecidos mais desenvolvidos, como a retina significativamente mais tratável. A primeira é o método flipase (FLP) / flipase Recombinação alvo (FRT) de geração de clones de células mutantes dentro de uma outra forma de tecido tipo selvagem 17-19. Neste exemplo, o tecido mutante é identificado pela ausência de um marcador visual tal como uma Proteína Fluorescente Verde (GFP) e pode ser comparado com o tecido circundante do tipo selvagem, em que está presente a GFP (Figura 2D). A segunda é o método "flp-out" em que um transgene é expresso numa população de células 20. Neste exemplo, os clones de células são identificadas pela presença de GFP e em comparação com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o repórter GFP (Figura2E). A terceira é a Análise mosaico com uma técnica de marcador de células reprimível (MARCM), que combina elementos do clone mutante FLP / FRT e sistemas de expressão flp-out 21. Com este método de um transgene podem ser expressas dentro de uma população de células que são simultaneamente mutante para um locus genético individual. Como os clones flp-out, MARCM clones são identificados pela presença de GFP e comparado com o tecido circundante do tipo selvagem que não possui o marcador GFP (Figura 2F). E, por fim, as construções de genes e de ARNi pode ser expresso em tecidos imaginais sob o controlo de construções de promotor GAL4-específicos. Estes quatro métodos têm aumentado o interesse em estudar discos imaginais desde clones ou padrões mutantes ou sobre-expressão pode ser directamente comparada com o tecido adjacente de tipo selvagem. O método descrito neste procedimento foi desenvolvido para que os pesquisadores que estudam o desenvolvimento pós-embrionário de tecidos adultos em Drosophila,particularmente aquelas derivadas a partir do disco de olho-antenais e será capaz de se obterem tecidos de alta qualidade para a análise. Embora os pesquisadores individuais fizeram pequenas modificações, o cerne deste processo (que descrevemos aqui) se manteve praticamente inalterado. Desde a obtenção de tecido de alta qualidade é fundamental para o estudo dos discos imaginais Esperamos que este protocolo escrito e vídeo que acompanha irá servir como um recurso valioso de ensino.
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Protocol
1 Preparação de Larvas
- Preencha de 35 mm placa de Petri com tampão dissecção.
- Coloque larvas em placa de Petri e permitir-lhes nadar por alguns minutos (etapa de auto-limpeza).
- Transferência das larvas para um tanque de tampão numa placa de dissecação dissecção à base de silicone. Esta associação deve situar-se a aresta da placa. A placa de dissecação consiste de uma solução de silicone, que foi vazada e endurecida dentro de uma placa de Petri de vidro.
- Usando uma pipeta de pasteur-, colocar um conjunto maior de tampão de dissecção no meio da placa de dissecação.
- Usando # 5 fórceps, transferir uma única larva limpo da pequena piscina para a maior piscina de tampão dissecção.
2. Grosso Dissecção de larvas
- Enquanto a larva ainda está dentro do grande grupo de tampão de dissecção apertar a larva com a pinça. Um par de pinças devem ser utilizados para agarrar os ganchos na boca, enquanto o outro par de pinças é usado para manter o animal ainda (pegue a larva suavemente a 1/3 do comprimento do corpo).
- Prender firmemente o par de fórceps contendo a cutícula perto dos ganchos na boca enquanto rapidamente puxando o resto do corpo de distância com o segundo par de fórceps.
- Quando a larva começa a rasgar você vai sentir uma ligeira liberação de tensão. Solte a larva do fórceps e permitir a "coragem" da larva para derramar. Isto permite que os discos imaginais de permanecer na sua conformação normal e os impede de se deformarem.
- Com um par de pinças de compreender os ganchos na boca de novo para manter a extremidade da frente da larva no lugar. Usando o outro par de fórceps remover a dois terços inferior das larvas, incluindo os intestinos internos. Nota: um complexo contendo os ganchos na boca, os discos de olho-antenal, hemisférios cerebrais, gânglio ventral, as glândulas salivares, alguns discos de perna, ea cutícula sobrejacente permanecerá.
- Com um par de fórceps remover suavemente a cutícula sobrejacente, glândulas salivares, os discos de perna eoutros tecidos. Nota: único tecido que deve permanecer é os ganchos na boca, olho-antenais discos, os hemisférios cerebrais, e gânglio ventral (Figura 3).
- Repita os passos de 2,1-2,5 com larvas adicional para 15-20 min. Nota: Os discos imaginais que permanecem no buffer de dissecção por longos períodos de tempo tendem a se degradar e, finalmente, será exibido com menos de espécimes ideais para ser fotografado. Assim, depois de um máximo de 20 min todos os tecidos dissecados deve ser transferido para o fixador de PLP (ver abaixo).
3 Fixação e coloração de tecidos com anticorpos
- Usando um Pipetman P-200, transferir os tecidos dissecados para um vidro de relógio contendo frio paraformaldeído-lisina-periodato (PLP) fixador. Limite de volume de tampão de dissecção transferidos para 50 mL para minimizar a diluição do PLP. Certifique-se de cortar a ponta com uma lâmina de barbear para que a abertura da ponta é grande o suficiente para acomodar os tecidos dissecados. Utilizando um par de pinças ouuma agulha de tungsténio assegurar que os tecidos são dissecados completamente submerso na ordem para a fixação adequada para ocorrer. Incubar tecidos dissecados em fixador PLP frio durante 45 min. Esta incubação pode ter lugar à temperatura ambiente sem agitação.
- Usando um Pipetman P-200, transferir os tecidos dissecados para tampão de lavagem (RT), utilizando um outro ponta amarela corte durante 45 minutos. Limite de Volume de PLP transferidos para 50 mL para minimizar a diluição do tampão de lavagem. Nota: todos os tecidos dissecados deve ser completamente submerso.
- Transferir 20-30 conjuntos de tecido dissecado de 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Nota: se um maior número de complexos de discos oculares-antenais são combinados dentro do tubo, existe uma possibilidade de que o tecido na parte inferior do tubo não serão correctamente exposto para os anticorpos. Para melhores resultados, no máximo, 20-30 complexos disco olho-antenas devem estar presentes em um único tubo. O tecido dissecado vai assentar no fundo do tubo de microcentrífuga. Etapas Portanto, em subseqüentes usi, uma pipeta para retirar e substituir o tampão de lavagem, a solução de bloqueio, e os anticorpos.
- Remover o tampão de lavagem e substituir com 100 ul de solução de bloqueio: 10% de soro normal de cabra em tampão de lavagem. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave sobre um tampo de mesa rotador durante 10 min.
- Retirar solução de bloqueio e substituir com 100 ul de anticorpos primários que tenha sido apropriadamente diluído em 10% de soro de cabra normal. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave durante 16 horas.
- Remover os anticorpos primários e substituir com 750 ul de tampão de lavagem. Colocar os tubos em um nutator e permitir a nutate à TA durante 10 min. Nota: O anticorpo primário pode ser guardado (armazenar a 4 ° C) e depois reutilizado. Reutilizar anticorpos várias vezes pode ajudar na redução da ligação não específica.
- Permitir cabeças para assentar no fundo do tubo, em seguida, remover o tampão de lavagem e adicionar 100 uL de anticorpos secundários que tenham sido apropriadamente diluído em 10% de soro normal. Incubar à temperatura ambiente com rotação suave para 2̵1, 4 h.
- Retirar as soluções de anticorpo secundário a partir de tecido e substituir com 500 ul de tampão de lavagem. Permitir que o tecido se depositem no fundo do tubo.
- Usando um P-200 e uma ponta amarela corte, transferir todos os tecidos dissecados para uma piscina de tampão de lavagem que tenha sido colocado no prato de dissecação. Enquanto prosseguir com o próximo passo da dissecção fina, o tecido vai incubar em tampão de lavagem. Isto ajuda a remover o excesso de anticorpos secundários.
4. Belas Dissecção da Complexos Disco Eye-antenal e montagem em lâminas
- Use um par de pinças para apertar a cutícula pelos ganchos na boca com o lado ventral do complexo virada para baixo. Com um segundo par de fórceps remover os dois lobos cerebrais, fechando a segunda pinça no espaço entre os discos do cérebro e do olho (Figura 3, a seta vermelha) e puxando rapidamente o cérebro longe dos ganchos na boca.
- Embora continuando a agarrar os ganchos na boca, belisqueo tecido tão perto quanto possível a ligação entre a secção da antena do disco olho-antenais e os ganchos na boca (Figura 3, seta azul). Nota: os complexos de discos olho-antenas deve ser livre de todo o tecido (Figura 1A). Continuar até que todo o tecido desejado desejado que pode ser colocado em lâminas foi dissecado. Este protocolo pode ser adaptado para isolar asa, haltere, perna e discos imaginais genital (Figura 1B-E).
- Adicionar dois pequenos pedaços de papel de seda (tamanho das lamelas) de aproximadamente 3. Além do prato de dissecação. Coloque uma lâmina de vidro sobre o prato - os dois pedaços de papel de tecido deve ser de acordo com as extremidades da corrediça. Isso impedirá que o slide de degola para a base de silicone do prato de dissecação.
- Usando um P-20 com uma ponta sem cortes, adicionar 9 ul de um agente anti-branqueamento para o meio da lamela de microscópio de vidro. Isto impede que o branqueamento do tecido quando visualizado com fluorescenteluz.
- Usando a mesma ponta sem cortes, reunir todos os discos olho-antenal e adicioná-los à gota de reagente anti-branqueamento. Minimizar a quantidade de tampão de lavagem que é transportado. Tentar limitar a quantidade de solução de lavagem de 10 ul ou menos.
- Use uma pinça para separar e espalhar-se os discos de olho-antenal dentro da gota de reagente anti-branqueamento. Permitir que os discos a incubar em reagente anti-branqueamento por vários minutos. Nota: Os discos ficará clara como o tecido absorve o reagente anti-branqueamento.
- Usando um pincel fino delicadamente abaixar uma lamela sobre a amostra. Isto evita a formação de bolhas de ar.
- Loja desliza a -20 ° C até que esteja pronto para ver os discos imaginais olho-antenais ou outros que utilizam luz ou microscopia fluorescente.
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Representative Results
O método que é descrito acima, de forma fiável produz material de alta qualidade para a análise com sondas in situ, nos repórteres de transcrição, armadilhas de proteínas e anticorpos. Na Figura 1 exibir discos olho-de antena, genitais, asa, haltere e pernas que são rotineiramente recuperados com este método. Estes discos foram tratados com um fluoróforo faloidina-conjugado, que se liga à actina F e, por conseguinte, define cada célula. Se o tecido tiver sido fixado correctamente, então o sulco morfogenética do disco olho, as bordas do tecido concêntrico dobras nos discos genital, antenais e das pernas, e o eixo dorsal-ventral dos discos laterais e haltere aparecerão bordos afiados . Se um tecido é devidamente fixado em seguida anticorpos, proteínas fluorescentes e em sondas in situ também irá revelar padrões afiados. Vários exemplos são apresentados na Figura 2. Os três primeiros painéis discos de vídeo que tenham sido corados com anticorpos diferentes, enquanto otrês painéis inferiores mostram os discos, em que a GFP é utilizado para marcar populações de células.
Uma das características mais marcantes do disco olho-antenal é o sulco morfogenético (Figura 1A), que pode ser visto como um recorte dentro do tecido que corre ao longo do eixo dorso-ventral 1, 22. Antes do terceiro instar larval todas as células dentro o olho em desenvolvimento são unpatterned, indiferenciado, e morfologicamente indistinguíveis uns dos outros. No início do terceiro estádio larvar sulco morfogenética inicia na margem posterior do olho campo e progride em direcção ao olho anteriormente / borda da antena 22. Como o sulco progride através do campo de olho o mar de células desordenadas é transformada em uma série ordenada de olhos unidades espaçadas periodicamente ou ommatidia (Figura 1A) 22-23. À frente do sulco uma rede de genes que inclui o Pax6 homólogo Eyeless (Ey) células canaispara um destino do olho (Figura 2A) 15. O início ea progressão do próprio sulco é dependente das atividades do Hedgehog (HH) e decapentaplégico (DPP) vias de sinalização 24-29. Com efeito, um repórter DPP-lacZ reflecte fielmente a expressão do locus de DPP no interior do sulco (Figura 2B) 30-31. Como células sair do sulco e começar a adoptar os seus destinos terminais, eles expressam marcadores celulares específicos, tais como visão anormal letal embrionário (elav), que codifica uma proteína de ligação de ARN pan-neuronais (Figura 2C) 32-34.
Figura 1 Os discos imaginais de Drosophila melanogaster. (
Figura 2. análise clonal e expressão do disco imaginal olho (A - F). Imagens confocais de discos imaginais do olho. (A) A proteína Pax6 Cego (Ey) é distribuído amplamente à frente do sulco morfogenética. (B) um inibidor de DPP-lacZ transcricional Reporter responde a sinalização Hh e se expressa dentro do sulco morfogenético. (C) O ARN de ligação proteína-pan neuronal Elav é distribuída em todos os fotorreceptores em desenvolvimento por trás do sulco morfogenética. (D) Um disco olho contendo clones de perda de função gerados pelo sistema FLP / FRT. Os clones são identificados pela ausência de GFP (E). Um disco do olho contendo a sobre-expressão de clones gerados com o sistema flp-out. Clones são positivamente marcadas com GFP. (F) Um disco de olho contendo clones MARCM. Como o sistema flp-out, os clones MARCM podem ser identificados pela presença de GFP. Todas as proteínas e genótipos detectados são listados dentro da figura. Anterior é para a direita e dorsal é para cima.
Figura 3 complexo Eye-antena-cérebro. Uma schdesenho Ematic do primeiro dia de dissecação produtos grosseiras. Os únicos tecidos que devem ser corrigidos são os ganchos na boca, os discos de olho-de antena e cérebro (muitas vezes o gânglio ventral permanecerão anexados bem - não mostrados). Roxo = cérebro, = discos de olho-de antenas verdes, marrons = ganchos na boca. Anterior é para a direita. Se dissecando perna, asa, haltere e discos genitais, a cutícula externa da larva ainda deve ser anexado a estes tecidos. Não remova a cutícula sobrejacente como você pode perder os discos imaginais durante as transferências subsequentes, através de diversas soluções de anticorpos, bloco e lavagem. O excesso de tecido pode ser removido durante os passos de dissecação fina (4,1-4,2).
Figura 4 posição dos discos imaginais de Drosophila na larva. Um esquemadesenho tic da posição relativa dos discos de olho-de antenas, pernas, asas, haltere e genitais dentro de uma larva de terceiro instar. O disco olho-antenal é colorida em verde, os discos da perna são em azul, o disco halter está no roxo, o disco asa é na cor marrom / laranja eo disco genital é castanho claro. Anterior é para a direita.
| Nome de Solução |
| 8% paraformaldeído |
| 0,2 M de fosfato de sódio monobásico |
| 0,2 M de fosfato de sódio Disbasic |
| 1 N de hidróxido de sódio |
| 10% de Triton |
| 0,1 M de tampão fosfato de sódio (tampão de dissecção) |
| 0,1 M de tampão fosfato de sódio + 0,1% de Triton (tampão de lavagem) |
| Lisina Tampão |
| 2% paraformaldeído-Lisina-Periodato fixadora (PLP) |
| 10% de soro normal de cabra |
Tabela 1: Lista das soluções necessárias.
| Solução-mãe de paraformaldeído 8% |
| Para um balão de Erlenmeyer de 50 ml adicionar o seguinte: |
| 2,0 g de paraformaldeído |
| 23,0 ml de água destilada |
| 4,0 gotas de 1 N hidróxido de sódio (a partir de uma pipeta de Pasteur de vidro) |
| Misture e calor em uma placa de agitação até que a solução levantar fervura suave |
| Deixe ferver suavemente até que esteja completamente dissolvido paraformaldeído |
| Coloque no gelo até frio (fazer fresco antes de cada dissecção) |
| 0,1 M de tampão fosfato (dissecção (P) Tampão) |
| Para um tubo cônico de 50 ml, adicione o seguinte: |
| 18,0 ml de 0,2 M de fosfato de sódio dibásico |
| 7,0 ml de 0,2 M de fosfato de sódio monobásico |
| 25,0 ml de água destilada |
| Armazenar a 4 ° C (uma semana prazo de validade) |
| 0,1 M + fosfato de detergente Buffer (lavagem (W) Tampão) |
| Para uma 50ml tubo cônico de acrescentar o seguinte: |
| 18,0 ml de 0,2 M de fosfato de sódio dibásico |
| 7,0 ml de 0,2 M de fosfato de sódio monobásico |
| 25,0 ml de água destilada |
| 0,5 ml de 10% Triton |
| Guarde-o em temperatura ambiente (uma semana prazo de validade) |
| Lisina (L) Tampão |
| Para um tubo cônico de 50 ml, adicione o seguinte: |
| 0,4 g Lisina |
| 1,2 ml de 0,2 M de fosfato de sódio dibásico |
| 8,0 ml Dissection (P) Tampão |
| 10,0 ml de água destilada |
| Agitar até obter uma solução de lisina é completamente dissolvida |
| Coloque no gelo até frio (fazer fresco antes de cada dissecção) |
| 2% paraformaldeído - lisina - Periodato (PLP) fixador |
| 0,1 g de periodato de sódio |
| 15,0 ml de lisina (L) de tampão |
| 5,0 ml de 8% de paraformaldeído |
| Agitar até solução de periodato de sódio é completamente dissolvida |
| Coloque no gelo até frio (fazer fresco antes de cada dissecção) |
Tabela 2: Receitas para soluções necessárias.
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Discussion
Embora este procedimento concentrou-se principalmente sobre o isolamento e tratamento subsequente dos discos de olho-antenais e que é passível de ser utilizado para isolar e analisar a asa, haltere, perna e discos genital (Figura 4). A única modificação necessária do protocolo para isolar estes discos (em oposição ao disco olho-antenal) é o método de dissecação grosseira (seção 2 do protocolo). A primeira perna (T1) par torácica é encontrada na anterior da larva e pode ser recuperado, seguindo o protocolo de isolamento de disco olho-antenais. No entanto a segunda etapa torácico (T2) discos estão ligados à cutícula. Para isolar estes discos de um par de pinças devem ser utilizadas para manter os ganchos na boca (conforme descrito acima), enquanto um outro par de pinças devem ser usadas de modo a apertar a cutícula ventral do animal (certificar-se de modo a apertar a larva cerca de 1/3 do ganchos na boca. larva O filete pode ser simplesmente rasgando a cutícula ventral do resto do larva. As pernas T2 permanecerá ligado à cutícula. O terceiro torácica (T3) da perna é ligado aos discos laterais e haltere como parte de um complexo, que por si só, também está ligado à cutícula. Você pode optar por separar o complexo disco e as pernas T2 da cutícula, nesta fase, ou manter o complexo cutícula discos juntos durante a fixação / etapas subseqüentes de incubação de anticorpos e isolar os discos durante dissecção fina do processo (secção 4) . Para recuperar discos genitais, é melhor entender as larvas na barriga com um par de pinças e, em seguida, retire a cutícula ventral acabar com o outro par de fórceps começando no meio e terminando na extremidade posterior da larva. Recomenda-se que a pinça ser usado para limpar todos os tecidos estranhos e, em seguida, transferir apenas o disco genital para a solução fixadora usando um P-200 e uma ponta de pipeta amarela cujo final foi cortada com uma lâmina de barbear.
Este procedimento é o mais adequado para tissues de espessura limitada, tais como discos imaginais e funciona melhor se os anticorpos serem utilizados são de alto título e especificidade. No entanto, ele pode ser adaptado para trabalhar bem com tecidos mais espessos, tais como o do ovário adulto, testículos e cérebro, bem como com os anticorpos de título baixo ou aqueles que dão maior do que o "fundo" de coloração desejada. Quando se trabalha com tecidos mais espessos, sugere-se que os melhores resultados podem ser obtidos por simples aumento da concentração de formaldeído e / ou incubação no fixador PLP durante longos períodos de tempo. Uma vez que a fixação adequada dos tecidos dissecados é essencial para o sucesso com este protocolo é também sugerido que a eficácia de aumento da concentração de formaldeído e / ou aumentando o comprimento de fixação ser avaliada com faloidina (Figura 1). Em particular, uma atenção especial deve ser dada à "nitidez" de contornos celulares e outros marcos físicos dentro do tecido (ou seja, o morphogsulco enetic). Outra forma de garantir que o seu tecido (particularmente amostras mais espessas) está fixa é preparar o paraformaldeído 8% e soluções PLP frescas antes de cada dissecção. E, finalmente, a qualidade global da dissecção pode ser aumentada, se o tecido é dissecado por curtos períodos de tempo e o tecido é transferido para fixador tão rapidamente quanto possível. Sugere-se que o dissecante por não mais de 15-20 minutos. Dissecando por períodos mais curtos aumenta a qualidade de preservação tecidual.
Este protocolo funciona bem com uma ampla gama de anticorpos, mas a verdade é que alguns anticorpos não funcionam bem com o fixador de PLP. Um exemplo notável é o anticorpo que reconhece o factor de transcrição áspera (Ro). Áspera é expressa dentro e é necessário para a especificação de um subconjunto de desenvolver fotoreceptores 35. O anticorpo anti-Ro funciona melhor, não com PLP, mas sim com Pipes - EGTA - MgSO4 (PEM) bpode ser prejudicado 36. Da mesma forma, outros anticorpos podem funcionar melhor em tecidos que foram incubadas em ainda outros fixadores. Sugere-se que, salvo indicação em contrário, o fixador PLP deve ser julgado em primeiro lugar. Se não tiver êxito, então o processo de encontrar um fixador alternativo deve começar.
Um problema comum a enfrentar é a concentração de trabalho do anticorpo em questão. Muitas vezes você pode ser o primeiro pesquisador a utilização de um anticorpo específico para detectar proteínas em seu tecido de interesse. A concentração de trabalho pode se desviar do que é relatado para outros tecidos. Sugere-se que a concentração recomendada ser tentada em primeiro lugar. Aumentar a concentração do anticorpo, se um sinal não pode ser visto. Por outro lado, se a concentração recomendada dá elevada coloração de fundo, então a diluição do anticorpo devem ser tentadas. Concentrações de trabalho entre os anticorpos podem variar. Por exemplo, o anti-olhos Ausente (Eya) anticorpo é diluída 1: 5, enquanto que o antiAnticorpo elav trabalha bem mesmo a uma diluição de 1: 500. Alguns anticorpos pode até ser diluído, tanto para baixo como 1: 3000. Além disso, este procedimento, como está escrito, funciona melhor com anticorpos elevada especificidade. No entanto, como muitos experimentaram, alguns anticorpos podem ligar-se não especificamente para o tecido e isso pode criar uma imagem de sub-óptima. Esta situação pode ser frequentemente corrigidos por incubação do anticorpo diluído com embriões fixos ou carcaças de larvas antes de serem adicionadas aos discos imaginais fixos. Dependendo do nível de coloração de fundo não específica, o comprimento necessário de "pré-absorção" pode variar e terá de ser trabalhado a título experimental. É igualmente possível aumentar a relação sinal / ruído de re-utilização de anticorpos ou várias vezes através da realização de várias etapas de pré-absorção.
Ao decidir sobre o que os discos devem ser usadas em publicações e / ou apresentações, é melhor escolher os discos que foram orientadas com o lado apical voltada para cima enfermarias. Também é melhor usar discos que não são dobrados. Isto é particularmente verdade para o disco de olho-antenais. O lado ventral do disco tende a dobrar e, infelizmente, há pouco se pode fazer para impedir que isso aconteça. Uma solução é dissecar discos mais jovens como estes tendem a dobrar muito menos. Outra opção é apenas para dissecar um grande número de discos até obter um que é completamente plana. A forma global do olho-antenais disco pode ser afectada pela velocidade à qual a larva é despedaçada. Se se puxar a larva demasiado rapidamente para além do orifício através do qual o complexo cérebro-disco passa é pequena e o disco de olho-antenais sai dobrado e / ou alongadas. É melhor puxar lentamente até que a larva começa a rasgar uma vez que o furo vai ser maior. Em seguida, você pode continuar a puxar o complexo disco-olho-cérebro antenas lentamente. Tenha em mente que você nunca pode puxar muito devagar. Além disso, observe que a taxa em que você rasgue o tecido não é um fator para o isolamento de outros tecidos.
ve_content "> O ciclo de vida da Drosophila consiste em três fases larvares. eventos de desenvolvimento importantes ocorrem durante cada uma dessas fases, portanto, pode ser importante para isolar os tecidos não apenas de terceiros estágios larvais (que é o foco principal deste procedimento) mas também de ambos primeiro e segundo ínstares larval também. Com uma pequena excepção, este procedimento pode ser utilizado, como está escrito, para isolar os discos segundo instar. durante dissecção fina do processo (secção 4), recomenda-se que o tungstênio afiada fio deve ser utilizado para separar o disco do olho-antenal do tecido estranho, como os ganchos na boca, cérebro e glândulas salivares. tungsténio O fio pode também ser usado para separar os discos T2 / T3 perna e asa haltere um do outro e a cutícula sobrejacente . É recomendado que uma extremidade do fio de tungsténio (a extremidade que vai ser usada para separar os tecidos) ser afiada por aquecimento num banho de nitrato de sódio em ebulição A outra extremidade pode ser inserida em torno de um pino;. thé lhe permitirá manter o fio de tungstênio com mais facilidade. Infelizmente, é muito mais difícil isolar os discos intactos primeiro estádio, por isso é recomendado que você coloque todo o CD / cérebro / boca complexo gancho de olho-antenal na lâmina e cobrir com uma lamela. A quantidade de tecido dissecado podem ser minimizados através da utilização de um fio de tungsténio afiado para remover as glândulas salivares e recobre cutícula antes da montagem do complexo de gancho disco / cérebro / boca sobre a lâmina. É relativamente fácil para identificar o primeiro disco de olho-antenais estádio em que ainda está ligado ao cérebro e boca ganchos (ver Figura 6A, D de Kumar e Moses, 2001) 37. Os outros discos imaginais terá de ser separada da cutícula e colocada numa lâmina de observação.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Donald Pronto e Kevin Moisés para ensinar JPK o procedimento de dissecção disco imaginal original. Agradecemos também a Bonnie Weasner para o disco genital na Figura 1B eo disco olho na Figura 2A, Brandon Weasner para a Figura 3, a Bloomington Drosophila da Centro de manchas de moscas e de Estudos do Desenvolvimento Hybridoma Banco de anticorpos. CMS tem sido apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIH) GCMS Formação Grant (T32-GM007757), o Frank W. Putnam Research Fellowship, ea Research Fellowship Robert Briggs. JPK é suportado por uma concessão do National Eye Institute (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
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