Abstract
Une partie importante du développement post-embryonnaire chez la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a lieu au sein d'un ensemble de structures de sac-comme les appelés disques imaginaux. Ces disques donnent lieu à un pourcentage élevé de structures adultes qui se trouvent à l'intérieur de la mouche adulte. Nous décrivons ici un protocole qui a été optimisé pour récupérer ces disques et de les préparer pour l'analyse avec des anticorps, des journalistes de la transcription et les pièges de protéines. Cette procédure est plus adapté pour les tissus légers tels que les disques imaginaux, mais peut être facilement modifié pour une utilisation avec des tissus plus épais tels que le cerveau adulte et larvaire ovaire. Le protocole écrit et la vidéo qui accompagne va guider le lecteur / spectateur à travers la dissection de troisième stade larvaire, fixation de tissu, et le traitement des disques imaginaux avec des anticorps. Le protocole peut être utilisé pour disséquer les disques imaginaux de jeunes larves de premier et deuxième stade aussi. L'avantage de ce protocole est qu'il est relativement court et il a êtrefr optimisé pour la préservation de haute qualité du tissu disséqué. Un autre avantage est que la procédure de fixation qui est utilisé fonctionne bien avec la très grande majorité des anticorps qui reconnaissent des protéines de Drosophila. Dans notre expérience, il ya un très petit nombre d'anticorps sensibles qui ne fonctionnent pas bien avec cette procédure. Dans ces situations, le remède semble être d'utiliser une fixation cocktail autre tout en continuant à suivre les lignes directrices que nous avons définies pour les étapes de dissection et les incubations d'anticorps.
Introduction
Depuis plus d'un siècle, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, a été un principal système pour étudier le développement, le comportement et la physiologie. Développement de la mouche peut être divisé en deux grandes étapes: embryonnaires et post-embryonnaires avec beaucoup de celle-ci ayant lieu au sein de l'épithélium monocouche appelés disques imaginaux 1-3. Dessins de disques imaginaux ont d'abord été publiés en 1864 par Août Weismann dans le cadre de son vaste monographie sur le développement des insectes 1. Ces disques commencent leur développement au cours de l'embryogenèse, sont motifs pendant les stades larvaires, survivre à la histolyse massive des pupes début, et finalement donner lieu à un pourcentage élevé de structures adultes que l'on trouve au sein de la mouche adulte 1-14. Au cours du développement larvaire chaque disque fait plusieurs décisions importantes concernant le destin, la forme et la taille. Dans les premier et deuxième stades larvaires, les disques sont chargés de l'adoption d'un sort primaire, establishing limites du compartiment, l'adoption de la forme correcte et générer le nombre requis de cellules 15-16. Au cours du troisième stade larvaire et au début du stade pré-pupe, les disques imaginaux continuent à se diviser et sont modelées comme des cellules adoptent leurs destins terminaux 16.
Au cours de l'histoire des débuts de la biologie du développement chez la drosophile, les disques imaginaux ont été étudiés presque exclusivement dans le contexte du développement normal et dans les cas limités où une perte ou un mutant gain de fonction était viable. L'utilisation des rayons X pour induire une recombinaison mitotique permis de mutations létales à analyser dans des clones de cellules dans les tissus de larves et d'adultes. Cette méthode a été améliorée par l'introduction de méthodes transgéniques pour analyser la perte et gain de fonction des mutations dans deux tissus larvaires et adultes. Le nombre d'anticorps, les journalistes de la transcription et les pièges de protéines pour décrire le paysage moléculaire de type sauvage et mutantes tissus est également constde plus en plus antly. L'utilisation de ces marqueurs moléculaires pour analyser la perte et gain de fonction des clones de cellules mutantes a fait de plus en plus possible d'acquérir une compréhension en temps réel de la façon dont les cellules mutantes s'écartent de leurs cousins de type sauvage au cours du développement. Pour bien prendre avantage de ces outils et des réactifs, il est essentiel d'avoir des préparations de disques imaginaux qui peut être consulté, photographiés et analysés haute qualité. Le but de ce manuscrit est de fournir un protocole optimisé pour l'isolement et la préparation du complexe de disque eye-antennaire (Figure 1A). Il peut également être utilisé avec succès pour isoler une grande variété de disques supplémentaires, y compris celles qui donnent lieu à des ailes, des haltères, des jambes T1-T3 et les organes génitaux (figure 1B-E). Ce procédé, avec des modifications mineures, a été utilisée pour isoler les disques imaginaux de la drosophile pendant près de 80 années.
Comme décrit ci-dessus, étant donné que la plupart des gènes sont exprimés au cours de multiple stades de développement et dans une multitude de tissus, il est souvent impossible d'étudier les effets que les mutants nuls ont sur l'ensemble de l'œil que l'animal meurt bien avant le stade larvaire troisième stade larvaire. Quatre méthodes ont fait l'étude des tissus plus avancés tels que la rétine beaucoup plus docile. Le premier est le procédé flippase (FLP) / flippase recombinaison cible (FRT) de générer des clones de cellules mutantes dans un tissu de type sauvage 17-19 autrement. Dans ce cas, le tissu mutant est identifié par l'absence d'un repère visuel tel que la protéine fluorescente verte (GFP) et peut être comparé au tissu environnant de type sauvage dans lequel la GFP est présente (figure 2D). La seconde est la méthode "flp-out" dans laquelle un transgène est exprimé dans une population de cellules 20. Dans ce cas, les clones de cellules sont identifiés par la présence de GFP et par rapport au tissu environnant de type sauvage qui n'a pas le rapporteur GFP (Figure2E). Le troisième est l'analyse Mosaïque avec une technique répressible marqueur cellulaire (marcm), qui combine des éléments du clone mutant FLP / FRT et systèmes d'expression flp-out 21. Avec cette méthode, un transgène peut être exprimé dans une population de cellules qui sont à la fois pour un mutant locus génétique particulier. Comme les clones de flp-out, marcm clones sont identifiés par la présence de GFP et comparés au tissu de type sauvage environnante qui n'a pas le marqueur GFP (Figure 2F). Et enfin, les gènes et les constructions ARNi peuvent être exprimés dans les tissus imaginaux sous le contrôle des constructions spécifiques promoteur GAL4. Ces quatre méthodes ont accru l'intérêt dans l'étude des disques imaginaux depuis clones mutants ou des motifs ou sur-expression peuvent être directement comparés aux tissus adjacents de type sauvage. La méthode décrite dans cette procédure a été mise au point afin que les chercheurs qui étudient le développement post-embryonnaire des tissus adultes chez la drosophile,notamment ceux issus de disque eye-antennaire, pourront obtenir des tissus de haute qualité pour l'analyse. Bien que les chercheurs individuels ont apporté de légères modifications, le noyau de cette procédure (que nous décrivons ici) est resté largement inchangé. Depuis l'obtention de tissus de haute qualité est essentiel à l'étude des disques imaginaux nous espérons que ce protocole écrit et la vidéo qui accompagne va servir de ressource pédagogique précieuse.
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Protocol
1 Préparation de larves
- Remplissez une boîte de 35 mm de Pétri avec un tampon de dissection.
- Placez les larves en boîte de Petri et leur permettre de nager pendant quelques minutes (étape d'auto-nettoyage).
- Transférer les larves à un pool de mémoire tampon de dissection sur une plaque de dissection à base de silicone. Cette piscine doit être à un bord de la plaque. La plaque de dissection se compose d'une solution de silicone qui a été coulé et durci dans une boîte de Pétri en verre.
- L'utilisation d'un pasteur-pipette, placer un plus grand bassin de tampon de dissection au milieu de la plaque de dissection.
- Utilisation # 5 pinces, transférer une seule larve nettoyé depuis la petite piscine de la plus grande piscine de tampon de dissection.
2 gros Dissection de larves
- Alors que la larve est toujours dans la grande piscine de tampon de dissection serrer la larve avec la pince. Une paire de pinces doit être utilisé pour saisir les crochets de la bouche tandis que l'autre paire de pinces est utilisé pour maintenir la animal encore (saisir la larve doucement à un tiers la longueur du corps).
- Hold Steady la paire de pinces contenant la cuticule près de la bouche des crochets tout en tirant rapidement le reste du corps à l'écart avec la deuxième paire de pinces.
- Lorsque la larve commence à se déchirer, vous vous sentirez un léger dégagement de la tension. Relâchez la larve de la pince et de permettre les "entrailles" de la larve à déborder. Cela permet aux disques imaginaux de rester dans leur conformation normale et les empêche de se déformer.
- Avec une paire de pinces saisir les crochets buccaux à nouveau pour tenir l'extrémité avant de la larve en place. Utilisation de l'autre paire de pinces enlever la partie inférieure de 3.2 larves dont le cran interne. Remarque: un complexe contenant les crochets de la bouche, les disques de l'oeil-antennaire, hémisphères du cerveau, ganglion ventral, les glandes salivaires, des disques de la jambe, et la cuticule recouvrant resteront.
- Avec une paire de pinces retirez délicatement la cuticule recouvrant, les glandes salivaires, les disques de la jambe etd'autres tissus. Remarque: seul tissu qui devraient rester sont les crochets de la bouche, des disques d'oeil-antennaire, hémisphères du cerveau, et ganglion ventral (Figure 3).
- Répétez les étapes 2.1-2.5 avec des larves supplémentaire pour 15-20 min. Remarque: les disques imaginaux qui restent dans le tampon de dissection pour des périodes plus longues ont tendance à se dégrader et, finalement, apparaissent comme moins de spécimens parfaits pour être photographiés. Ainsi, après un maximum de 20 minutes tous les tissus disséqués devraient être transférés au fixateur de PLP (voir ci-dessous).
3. fixation et coloration des tissus avec des anticorps
- L'utilisation d'un Pipetman P-200, transférer les tissus disséqués à un verre de montre contenant froid Paraformaldéhyde-lysine-Periodate (PLP) fixateur. volume de limite de tampon de dissection transféré à 50 pi de minimiser la dilution de PLP. Veillez à couper la pointe d'une lame de rasoir de sorte que l'ouverture de la pointe est assez grand pour accueillir les tissus disséqués. En utilisant une paire de pinces ouune aiguille de tungstène veiller à ce que les tissus disséqués sont complètement immergés dans l'ordre pour la fixation correcte de se produire. Incuber les tissus disséqués dans fixateur de PLP froid pendant 45 min. Cette incubation peut avoir lieu à température ambiante sans agitation.
- L'utilisation d'un Pipetman P-200, transférer les tissus disséqués pour le tampon de lavage (RT) en utilisant une autre astuce jaune coupé pendant 45 min. Limiter le volume de transfert de PLP à 50 ul de réduire au minimum la dilution de la solution de lavage. Remarque: tous les tissus disséqués doivent être complètement immergés.
- Transfert 20-30 ensembles de tissus disséqués à 1,5 ml tube de centrifugeuse. Remarque: si un plus grand nombre de complexes de disque eye-antennaire sont combinés à l'intérieur du tube, il est possible que le tissu au niveau du fond du tube n'est pas correctement exposée aux anticorps. Pour des résultats optimaux pas plus de 20-30 complexes de disque eye-antennaire doivent être présents dans un seul tube. Le tissu disséqué se déposent au fond du tube de centrifugeuse. Étapes conséquent, dans la suite uSE Pipetman pour retirer et remplacer le tampon de lavage, la solution de blocage, et des anticorps.
- Retirer le tampon de lavage et le remplacer par 100 ul de solution de blocage: 10% de sérum de chèvre normal dans du tampon de lavage. Incuber à température ambiante avec une légère rotation sur une partie supérieure de la coiffe de table pendant 10 minutes.
- Retirer la solution de blocage et le remplacer avec 100 ul d'anticorps primaires qui ont été dilués de manière appropriée dans 10% de sérum de chèvre normal. Incuber à température ambiante avec une légère rotation pendant 16 heures.
- Retirer les anticorps primaires et les remplacer par 750 ul de tampon de lavage. Placer les tubes dans un nutator et permettre à nutation à température ambiante pendant 10 min. Remarque: L'anticorps primaire peut être sauvé (conserver à 4 ° C) et réutilisé plus tard. Réutilisation des anticorps à plusieurs reprises peut aider à réduire la liaison non spécifique.
- Permettre aux têtes de se déposer au fond du tube, puis retirer le tampon de lavage et ajoute 100 ul d'anticorps secondaire qui ont été dilués de manière appropriée dans 10% de sérum normal. Incuber à température ambiante avec une légère rotation pour 2̵1; 4 h.
- Retirer solutions d'anticorps secondaires à partir de tissu et le remplacer par 500 ul de tampon de lavage. Laisser tissu à reposer au fond du tube.
- L'utilisation d'un P-200 et une pointe jaune de coupe, de transférer tous les tissus disséqués à un pool de tampon de lavage qui a été placé sur le plat de dissection. Tout en procédant à la prochaine étape de dissection fine, le tissu sera incuber dans le tampon de lavage. Cela aide à éliminer les anticorps secondaires excédentaires.
4. dissection fine de Eye-antennaire disque Complexes et montage sur Diapositives
- Utilisez une paire de pinces pour serrer la cuticule par les crochets buccaux avec la face ventrale du complexe vers le bas. Avec une deuxième paire de pinces enlever les deux lobes du cerveau par la fermeture des pinces dans le deuxième espace entre les disques de l'oeil et le cerveau (figure 3, la flèche rouge) et en tirant rapidement le cerveau à l'écart des crochets de la bouche.
- Tout en continuant à garder les crochets buccaux, pincezle tissu le plus proche possible de la connexion entre la section du disque antennaire eye-antennaire et les crochets de la bouche (figure 3, flèche bleue). Note: les complexes de disque eye-antennaire devraient être libres de tous les tissus (figure 1A). Continuez jusqu'à ce que tous les tissus désiré désiré qui peut être placé sur des lames a été disséqué. Ce protocole peut être adapté pour isoler aile, haltère, la jambe et les disques imaginaux génitales (figure 1B-E).
- Ajouter deux petits morceaux de papier de soie (taille des lamelles) environ 3. Part sur le plat de dissection. Placez une lame de verre sur le plat - les deux morceaux de papier de soie doivent être sous les extrémités de la lame. Cela permettra d'éviter le tiroir de coller à la base de silicone de la coupelle de dissection.
- Utilisation d'un P-20 avec une extrémité non coupée, 9 ul d'ajouter un agent anti-blanchiment au milieu de la lame de microscope en verre. Cela empêche le blanchiment des tissus lorsqu'on la visionne à fluorescentlumière.
- En utilisant la même pointe uncut, rassembler tous les disques de l'oeil-antennaire et les ajouter à la goutte de réactif anti-blanchiment. Minimiser la quantité de tampon de lavage qui est reporté. Essayer de limiter la quantité de tampon de lavage à 10 ul ou moins.
- Utilisez une paire de pinces pour séparer et étaler les disques de l'oeil-antennaire dans la goutte de réactif anti-blanchiment. Laisser les disques à incuber dans un réactif anti-blanchiment pendant plusieurs minutes. Remarque: les disques se tournent clairement que le tissu absorbe le réactif anti-blanchiment.
- L'aide d'un pinceau fin abaissez doucement une lamelle sur l'échantillon. Ceci permet d'éviter la formation de bulles d'air.
- Magasin glisse à -20 ° C jusqu'au moment de voir les disques imaginaux yeux des antennes ou autres en utilisant la lumière ou la microscopie à fluorescence.
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Representative Results
La méthode décrite ci-dessus de manière fiable produit du matériel de haute qualité pour l'analyse des sondes in situ, les journalistes de la transcription, les pièges de protéines et d'anticorps. Dans la figure 1, nous affichons œil-antenne, génitales, ailes, haltère et jambes disques qui sont systématiquement récupérés avec cette méthode. Ces disques ont été traités avec un fluorophore de la phalloïdine-conjugué, qui se lie à l'actine F et décrit par conséquent chaque cellule. Si le tissu a été fixé correctement puis le sillon morphogénétique du disque de l'oeil, les bords du tissu concentrique plis dans les disques des organes génitaux, des antennes et de la jambe, et l'axe de la dorsale-ventrale des disques d'aile et haltère apparaissent tous les bords en tant que tranchants . Si un tissu est correctement fixé alors des anticorps, des protéines fluorescentes et sondes in situ seront également révéler des tendances nettes. Plusieurs exemples sont présentés dans la figure 2. Les trois panneaux supérieurs disques d'affichage qui ont été colorées avec des anticorps tandis que les différentsinférieures trois panneaux montrent disques sur lesquels GFP est utilisée pour marquer des populations de cellules.
Une des caractéristiques les plus frappantes du disque œil-antennaire est la morphogénétique sillon (figure 1A), qui peut être considérée comme une empreinte dans le tissu le long de l'axe dorso-ventral 1, 22. Avant le troisième stade larvaire toutes les cellules dans le développement de l'œil sont sans dessin, indifférenciée, et morphologiquement indiscernables les uns des autres. Au début du troisième stade larvaire du sillon morphogénétique initie à la marge postérieure de la zone des yeux et de la progression en avant vers l'oeil / frontière antennaire 22. Comme le sillon progresse à travers le champ de l'œil de la mer de cellules désordonnées se transforme en un ensemble ordonné de yeux unitaires espacés périodiquement ou ommatidia (figure 1A) 22-23. D'avance sur le sillon d'un réseau de régulation génique qui comprend le Pax6 homologue Eyeless (Ey) des cellules des canauxvers un destin de l'œil (figure 2A) 15. L'initiation et la progression du sillon lui-même est tributaire des activités de the Hedgehog (Hh) et decapentaplegic (DPP) les voies de signalisation 24-29. En effet, un journaliste de la DPP-lacZ reflète fidèlement l'expression du locus dpp dans le sillon (figure 2B) 30-31. Comme les cellules sortent du sillon et commencent à adopter leurs destins terminaux, ils expriment des marqueurs cellulaires spécifiques tels que la vision létale embryonnaire anormal (elav), qui code pour une protéine de liaison d'ARN pan-neuronal (figure 2C) 32-34.
Figure 1: Les disques imaginaux de Drosophila melanogaster. (
Figure 2: analyse clonale et l'expression du disque imaginai de l'oeil (A - F). Images confocales de disques imaginaux d'yeux. (A) La protéine Pax6 Eyeless (Ey) est largement distribué en avant du sillon morphogénétique. (B) Un dpp-lacZ transcription reporter répond à la signalisation Hh et est exprimée dans le sillon morphogénétique. (C) La protéine de liaison d'ARN pan-neuronal Elav est distribué dans tous les photorécepteurs derrière le sillon développement morphogénétique. (D) un disque de l'oeil contenant les clones de perte de fonction générées par le système FLP / FRT. Les clones sont identifiés par l'absence de la GFP (E). Disque d'oeil contenant plus de l'expression de clones générés par le système FLP-out. Les clones sont positivement marquées à la GFP. (F) Un disque de l'oeil contenant les clones marcm. Comme le système FLP-out, les clones de marcm peuvent être identifiés par la présence de GFP. Toutes les protéines et les génotypes détectés sont répertoriés dans la figure. Antérieur, est à la droite et dorsale est écoulé.
Figure 3 complexe Eye-antenne-cerveau. Un schdessin hématique des produits de dissection grossiers premier jour. Les seuls tissus qui doivent être fixés les crochets buccaux, disques œil-antenne et le cerveau (souvent fois le ganglion ventral restera attachés ainsi - non représentés). Violet = cerveau, vert = disques œil-antenne, brun = crochets buccaux. Antérieur, est à la droite. Si dissection jambe, aile, haltère et disques génitales, la cuticule de la larve doit toujours être attaché à ces tissus. Ne pas enlever la cuticule recouvrant que vous risquez de perdre les disques imaginaux pendant les transferts ultérieurs à travers diverses solutions d'anticorps, blocs et de lavage. L'excès de tissu peut être retiré au cours des étapes de dissection fines (4.1-4.2).
Figure 4 Position de disques imaginaux dans la larve de drosophile. Un schématic dessin de la position relative des disques eye-antenne, les jambes, les ailes, et Haltère génitales à l'intérieur d'un troisième stade larvaire. Le disque de l'œil-antennaire est coloré en vert, les disques de la jambe sont en bleu, le disque licol est en violet, le disque de l'aile est brun / orange et le disque génital est marron clair. Antérieur, est à la droite.
| Nom de la solution |
| 8% Paraformaldéhyde |
| 0,2 M de phosphate de sodium monobasique |
| 0,2 M de phosphate de sodium Disbasic |
| 1 N d'hydroxyde de sodium |
| 10% de Triton |
| 0,1 M de phosphate de sodium tampon (Buffer Dissection) |
| 0,1 M de phosphate de sodium tampon + 0,1% de Triton (tampon de lavage) |
| Lysine tampon |
| 2% Paraformaldéhyde-lysine-Periodate fixatrice (PLP) |
| 10% sérum de chèvre normal |
Tableau 1: Liste des solutions requises.
| 8% solution Paraformaldéhyde stock |
| Pour un Erlenmeyer de 50 ml ajouter ce qui suit: |
| 2,0 g de paraformaldéhyde |
| 23,0 ml d'eau distillée |
| 4,0 gouttes de 1 N d'hydroxyde de sodium (à partir d'une pipette Pasteur en verre) |
| Mélanger et de la chaleur sur une plaque d'agitation jusqu'à ce que la solution atteigne une ébullition douce |
| Laisser bouillir doucement jusqu'à ce que le paraformaldéhyde est complètement dissous |
| Placez sur la glace jusqu'à ce que le froid (faire frais avant chaque dissection) |
| 0,1 M de tampon phosphate (dissection (P) du tampon) |
| Pour un tube conique de 50 ml ajouter ce qui suit: |
| 18,0 ml de 0,2 M de phosphate de sodium dibasique |
| 7,0 ml 0,2 M de phosphate de sodium monobasique |
| 25,0 ml d'eau distillée |
| Conserver à 4 ° C (1 semaine durée de vie) |
| 0,1 M phosphate + détergent tampon (lavage (W) Buffer) |
| Pour une 50tube conique ml ajouter ce qui suit: |
| 18,0 ml de 0,2 M de phosphate de sodium dibasique |
| 7,0 ml 0,2 M de phosphate de sodium monobasique |
| 25,0 ml d'eau distillée |
| 0,5 ml de 10% de Triton |
| Conserver à température ambiante (1 semaine durée de vie) |
| La lysine (L) du tampon |
| Pour un tube conique de 50 ml ajouter ce qui suit: |
| 0,4 g Lysine |
| 1,2 ml 0,2 M de phosphate de sodium dibasique |
| 8,0 ml Dissection (P) Tampon |
| 10,0 ml d'eau distillée |
| Agiter la solution jusqu'à ce que la lysine est complètement dissous |
| Placez sur la glace jusqu'à ce que le froid (faire frais avant chaque dissection) |
| 2% Paraformaldéhyde - lysine - Periodate (PLP) fixateur |
| 0,1 g Sodium periodate |
| 15,0 ml de lysine (L) du tampon |
| 5,0 ml de 8% Paraformaldéhyde |
| Agiter solution bien jusqu'à ce que le periodate de sodium soit complètement dissous |
| Placez sur la glace jusqu'à ce que le froid (faire frais avant chaque dissection) |
Tableau 2: Recettes pour les solutions requises.
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Discussion
Bien que cette procédure ait surtout porté sur l'isolement et le traitement ultérieur des disques eye-antennaire, il est susceptible d'être utilisé pour isoler et analyser l'aile, haltère, la jambe et les disques génitales (figure 4). La seule modification nécessaire du protocole pour isoler ces disques (par opposition au disque eye-antennaire) est la méthode de dissection grossière (de l'article 2 du protocole). La première branche (T1) thoracique paire se trouve à la partie antérieure de la larve et peut être récupéré en suivant le protocole de l'isolement du disque eye-antennaire. Toutefois, les disques seconde branche thoracique (T2) sont fixés à la cuticule. Pour isoler ces disques une paire de pinces doit être utilisé pour maintenir les crochets buccaux (tel que décrit ci-dessus) tandis que l'autre paire de pinces doit être utilisé pour serrer la cuticule ventrale de l'animal (assurez-vous de serrer la larve sur un tiers de la crochets buccaux. La larve ne peuvent tout simplement être Filet en déchirant la cuticule ventrale l'écart du reste de la larva. Les jambes T2 resteront attachés à la cuticule. Le troisième thoracique (T3) est fixé à la jambe des disques d'aile et haltère comme partie d'un complexe, qui elle-même est également attaché à la cuticule. Vous pouvez choisir de séparer le complexe de disque et les jambes T2 de la cuticule à ce stade ou garder le complexe cuticule disque ensemble pendant les fixation / anticorps étapes ultérieures d'incubation et d'isoler les disques au cours de la partie de dissection fine de la procédure (article 4) . Pour récupérer des disques génitales, il est préférable de saisir les larves au vagin avec une paire de pinces, puis peler la cuticule ventrale loin avec l'autre paire de pinces à partir de la section médiane et se terminant à l'extrémité postérieure de la larve. Il est recommandé que le forceps être utilisés pour dissiper tout tissu étranger et ensuite transférer simplement le disque génitales à la solution de fixation à l'aide d'un Pipetman P-200 et une pointe jaune dont l'extrémité a été coupé avec une lame de rasoir.
Cette procédure est le mieux adapté pour tissues de faible épaisseur tels que les disques imaginaux et fonctionne mieux si les anticorps utilisés sont de haute titre et la spécificité. Cependant, il peut être adapté pour fonctionner avec des tissus plus épais tels que les ovaires adultes, des testicules et du cerveau, ainsi que des anticorps de faible titre ou ceux qui donnent supérieur à "blanc" coloration désirée. Lorsque l'on travaille avec des tissus plus épais, il est suggéré que des résultats optimaux peuvent être obtenus par une simple augmentation de la concentration de paraformaldéhyde et / ou l'incubation dans le fixateur de PLP pour des périodes de temps plus longues. Depuis une bonne fixation des tissus disséqués est essentiel pour le succès de ce protocole, il est également suggéré que l'efficacité de l'augmentation de la concentration de paraformaldéhyde et / ou l'augmentation de la longueur de la fixation être évaluée avec la phalloïdine (Figure 1). En particulier, une attention particulière devrait être accordée à la "netteté" de lignes cellulaires et d'autres points de repère physiques dans le tissu (c'est à dire, la morphogsillon GÉNÉTIQUE). Une autre façon de s'assurer que votre tissu (en particulier les échantillons plus épais) est correctement fixée est de préparer le 8% de paraformaldéhyde et solutions PLP frais avant chaque dissection. Et enfin, la qualité globale de la dissection peut être augmentée si le tissu est disséqué pour de courtes périodes de temps et de tissus est transféré dans le fixateur le plus tôt possible. Il est suggéré que la dissection pour pas plus de 15-20 min. Dissection pour des durées plus courtes augmente la qualité de la conservation des tissus.
Ce protocole fonctionne bien avec un large éventail d'anticorps, mais il est vrai que certains anticorps ne fonctionnent pas bien avec le fixateur de PLP. Un exemple notoire est l'anticorps qui reconnaît l'état brut (Ro) facteur de transcription. Rugueux est exprimée dans et est nécessaire pour la spécification d'un sous-ensemble de développer photorécepteurs 35. L'anticorps anti-Ro qui fonctionne le mieux, non pas avec PLP, mais plutôt avec un TUYAUX - EGTA - MgSO 4 (PEM) buffer 36. De même, d'autres anticorps peuvent travailler mieux sur les tissus qui ont été incubés dans encore d'autres fixateurs. Il est suggéré que, sauf indication contraire, le fixateur de PLP devrait être essayé en premier. En cas d'échec, le processus de trouver un autre fixateur doit commencer.
Un problème commun à affronter est la concentration de travail de l'anticorps en question. Souvent, vous pouvez être le premier chercheur à utiliser un anticorps particulier pour détecter les protéines dans votre tissu d'intérêt. La concentration de travail peut différer de ce qui est rapporté pour d'autres tissus. Il est suggéré que la concentration recommandée être essayé en premier. Augmenter la concentration de l'anticorps, si un signal ne peut pas être vu. D'autre part, si la concentration recommandée donne une coloration de fond élevée puis en diluant l'anticorps doit être jugé. Concentrations de travail entre les anticorps peuvent varier. Par exemple, la lutte contre Absent-Eyes (Eya) anticorps est dilué 1: 5, tandis que le anti-Anticorps Elav fonctionne bien, même à une dilution de 1: 500. Certains anticorps peuvent même être dilués aussi loin que 1: 3000. En outre, cette procédure, telle que rédigée, qui fonctionne le mieux avec des anticorps de haute spécificité. Cependant, comme beaucoup l'ont connu, certains anticorps peuvent se lier de manière non spécifique au tissu, ce qui peut créer une image sous-optimale. Cette situation peut être souvent corrigé par incubation avec l'anticorps dilué embryons fixes ou des carcasses de larves avant d'être ajoutés aux disques imaginaux fixes. Selon le niveau de bruit de fond non spécifique, la longueur nécessaire de "pré-absorption» peut varier et devra être élaboré sur la base d'un procès. Il est également possible d'augmenter le rapport signal / bruit en réutilisant plusieurs fois les anticorps ou en effectuant plusieurs cycles de pré-absorption.
Au moment de décider sur lequel les disques doivent être utilisés dans les publications et / ou des présentations, il est préférable de choisir des disques qui ont été orientés vers le côté apical orienté jusqu'à les pupilles. Il est également préférable d'utiliser des disques qui ne sont pas pliées. C'est notamment le cas du disque d'eye-antennaire. La face ventrale du disque a tendance à plier et, malheureusement, il ya peu de choses à faire pour empêcher que cela se produise. Une solution consiste à disséquer les disques les plus jeunes que ceux-ci ont tendance à se replier beaucoup moins. Une autre option est de simplement disséquer un grand nombre de disques jusqu'à ce que vous obtenez un qui est complètement à plat. La forme générale de disque d'eye-antennaire peut être affectée par la vitesse à laquelle la larve est déchiré. Si on tire la chenille à l'écart trop rapidement le trou par lequel le complexe cerveau passe-disque est faible et que le disque d'eye-antennaire ressort plié et / ou étiré. Il est préférable de tirer lentement jusqu'à ce que la larve commence à se déchirer depuis le trou sera plus grande. Ensuite, vous pouvez continuer à tirer le complexe de disque cerveau-oeil-antennaire lentement. Gardez à l'esprit que vous ne pouvez jamais tirer trop lentement. A noter également, que la vitesse à laquelle vous déchirer le tissu n'est pas un facteur dans l'isolement d'autres tissus.
ve_content "> Le cycle de vie de la drosophile se compose de trois phases larvaires. événements de développement importants ont lieu pendant chacune de ces phases, donc il peut être important d'isoler des tissus non seulement de larves de troisième stade (ce qui est l'objectif principal de cette procédure) mais aussi de la première et deuxième larvaire stades ainsi. Avec une petite exception près, cette procédure peut être utilisée, tel que rédigé, pour isoler les disques de deuxième stade. Pendant la partie de dissection fine de la procédure (article 4), il est recommandé de tungstène forte fil doit être utilisé pour séparer le disque de eye-antennaire de tissus étrangers comme des crochets buccaux, du cerveau et des glandes salivaires. fil de tungstène peut aussi être utilisée pour séparer les disques jambe T2 / T3, ailes et Haltère une de l'autre et la cuticule recouvrant . Il est recommandé que l'une des extrémités du fil de tungstène (l'extrémité qui sera utilisée pour séparer les tissus) est aiguisée par chauffage dans un bain de nitrate de sodium bouillant L'autre extrémité peut être insérée dans un étau de broche; Th.est vous permettra de tenir le fil de tungstène plus facilement. Malheureusement, il est beaucoup plus difficile d'isoler intactes premiers disques de stade, il est donc recommandé que vous placez l'ensemble du complexe de crochet disque / cerveau / bouche œil-antennaire sur la lame et couvrir avec une lamelle. La quantité de tissu disséqué peut être minimisée par l'utilisation d'un fil de tungstène pointu pour retirer les glandes salivaires et recouvrant cuticule avant de monter le complexe de crochet disque / cerveau / bouche sur la lame. Il est relativement facile d'identifier le premier disque de l'œil-antennaire stade où il est encore attaché au cerveau et de la bouche des crochets (voir la figure 6A, D Kumar et Moïse, 2001) 37. Les autres disques imaginaux devront être séparée de la cuticule et placé sur une lame pour l'affichage.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Donald Prêt et Kevin Moïse pour l'enseignement de JPK la procédure imaginal d'origine disque de dissection. Nous remercions également Bonnie Weasner pour le disque génitales dans la figure 1B et le disque de l'œil à la figure 2A, Brandon Weasner de la figure 3, le Stock Center Bloomington drosophile pour les taches de mouches et le Developmental Studies Hybridoma Banque des anticorps. CMS a été soutenue par une bourse de la National Institutes of Health (NIH) GCMS subvention de formation (T32-GM007757), Frank W. Putnam bourses de recherche et bourses de recherche Robert Briggs. JPK est soutenu par une subvention de la National Eye Institute (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
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