Abstract
En vesentlig del av post-embryonal utvikling i bananflue, Drosophila melanogaster, foregår innenfor et sett av sac-lignende strukturer som kalles imaginal plater. Disse skivene gi opphav til en høy andel av voksne strukturer som finnes innenfor den voksne fly. Her beskriver vi en protokoll som har blitt optimalisert for å gjenopprette disse platene og forberede dem for analyse med antistoffer, transkripsjons journalister og protein feller. Denne prosedyren er best egnet for tynne vev som imaginal plater, men kan enkelt endres for bruk med tykkere vev som larve hjernen og voksen eggstokk. Den skriftlige protokoll og medfølgende videoen vil veilede leseren / seeren gjennom disseksjon av tredje stadium larver, fiksering av vev, og behandling av imaginal plater med antistoffer. Protokollen kan brukes til å dissekere Imaginal plater fra yngre første og andre stadiums larver i tillegg. Fordelen med denne protokollen er at den er forholdsvis kort, og den har blien optimalisert for den høye kvaliteten bevaring av den dissekerte vev. En annen fordel er at fikseringsfremgangsmåten som er anvendt fungerer godt med overveldende antall av antistoffer som gjenkjenner Drosophila-proteinene. Etter vår erfaring er det et svært lite antall sensitive antistoffer som ikke fungerer godt med denne prosedyren. I slike situasjoner, synes den rette til å være å bruke en alternativ fiksering cocktail mens du fortsetter å følge de retningslinjer som vi har fastsatt for disseksjon trinn og antistoff inkubasjoner.
Introduction
For mer enn et århundre bananflue, Drosophila melanogaster, har vært en ledende system for å studere utvikling, atferd og fysiologi. Utvikling i fly kan deles inn i to hovedstadier: embryonale og post-embryonale med mye av den sistnevnte finner sted innenfor epitel monolag kalt Imaginal plater 1-3. Tegninger av imaginal plater ble først publisert i 1864 i august Weismann som en del av sin brede monografi om insekt utvikling en. Disse platene begynner sin utvikling under embryogenesen er mønstret i løpet av larvestadier, overleve den massive histolysis av de tidlige pupal stadier, og til slutt gi opphav til en høy andel av voksne strukturer som finnes innenfor den voksne fly 1-14. Under larveutvikling hver plate gjør flere kritiske avgjørelser angående skjebne, form og størrelse. Innenfor de første og andre larve instars, er platene skal vedta en primær skjebne, etahengsle kupé grenser, vedta riktig form og generere den nødvendige antall celler 15-16. I løpet av tredje larve instar og tidlig pre-pupal scenen, de imaginal plater fortsette å dele seg og blir mønstret som celler vedta sine terminal skjebner 16.
Under den tidlige historien Drosophila utviklingsbiologi, ble imaginal plater studert nesten utelukkende i sammenheng med normal utvikling og i de begrensede tilfeller der et tap eller gevinst-of-funksjon mutant var levedyktig. Bruken av røntgenstråler for å indusere mitotisk rekombinasjon tillatt for dødelige mutasjoner for å bli analysert i cellekloner innenfor larve og voksne vev. Denne metoden har blitt forbedret ved innføringen av transgene metoder for å analysere tap og vinning-of-funksjon mutasjoner i både larver og voksne vev. Antallet antistoffer, transkripsjons reportere og protein feller for å beskrive den molekylære landskapet av villtype og mutant vev er også constantly økende. Ved hjelp av disse molekylære markører for å analysere tap og få-av-funksjon mutant cellekloner har gjort det stadig mulig å oppnå en sanntids forståelse av hvordan mutante celler avviker fra deres villtype fett under utvikling. Til riktig dra nytte av disse verktøyene og reagenser er det avgjørende å ha høy kvalitet preparater av imaginal plater som kan vises, fotografert og analysert. Målet med dette manuskriptet er å gi en optimalisert protokoll for isolering og utarbeidelse av øye-antennal plate kompleks (figur 1A). Den kan også med hell brukes for å isolere et bredt utvalg av flere plater, inkludert de som gir opphav til de vinger, halteres, T1-T3 ben og kjønnsorganene (figur 1B-E). Denne prosedyren, med mindre modifikasjoner, har blitt brukt til å isolere imaginal plater fra Drosophila i nesten åtti år.
Som beskrevet ovenfor, siden de fleste genene blir uttrykt under multiple utviklingsstadier og i en rekke vev, er det ofte umulig å studere effekter som null mutanter har på hele øyet som dyret dør i god tid før det tredje instar larvestadiet. Fire metoder har gjort studier av mer utviklede vev slik som retina betydelig mer medgjørlig. Den første er den Flippase (FLP) / Flippase Rekombinasjon Target (FRT) metode for generering av mutante cellekloner i en ellers vill type vev 17-19. I dette tilfellet den mutante vev blir identifisert ved fravær av en visuell markør slik som grønt fluorescerende protein (GFP) og kan bli sammenlignet med det omliggende vev villtype hvori GFP er til stede (figur 2D). Den andre er den «FLP-out"-metoden, hvor en transgenet blir uttrykt i en populasjon av celler 20. I dette tilfellet cellekloner er identifisert ved tilstedeværelsen av GFP og i forhold til det omkringliggende vill type vev som mangler GFP reporter (figur2E). Den tredje er Mosaic Analyse med et Repressible Cell Marker (MARCM) teknikken, som kombinerer elementer av FLP / FRT mutant klone og FLP-out ekspresjonssystemer 21. Med denne metoden et transgen kan uttrykkes i en populasjon av celler som er samtidig en individuell mutant for genetisk locus. Som FLP-ut kloner, er MARCM kloner identifisert ved tilstedeværelsen av GFP og i forhold til det omkringliggende vill type vev som mangler GFP markør (figur 2F). Og til slutt, kan genene og RNAi konstruerer uttrykkes innen imaginal vev under kontroll av spesifikke promoter-Gal4 konstruksjoner. Disse fire metoder har økt interessen for å studere imaginal plater siden mutant eller over-uttrykk kloner eller mønstre kan sammenlignes direkte med tilstøtende villtype vev. Metoden som beskrives i denne prosedyren er utviklet slik at forskere som studerer den post-embryoutvikling av voksne vev i Drosophila,spesielt de som er avledet fra det øye-antennal plate, vil være i stand til å oppnå høy kvalitet vev for analyse. Selv om enkelte forskere har gjort små endringer, har kjernen i denne prosedyren (som vi beskriver her) holdt seg stort sett uendret. Siden oppnå høy kvalitet vev er kritisk til studiet av de imaginal plater Vi håper dette skriftlig protokoll og medfølgende videoen vil tjene som en verdifull undervisning ressurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Larver
- Fyll en 35 mm petriskål med disseksjon buffer.
- Plasser larver i petriskål og tillate dem å svømme rundt i noen minutter (selvrensende trinn).
- Overfør larver til en pool av disseksjon buffer på et silikonbasert disseksjon plate. Dette utvalget skal være i den ene kanten av tallerkenen. Den disseksjon plate består av en silikon-løsning som har blitt tømt og herdet i løpet av en glasspetriskål.
- Ved hjelp av en pasteur-pipette, plassere en større pool av disseksjon buffer i midten av disseksjon plate.
- Bruke # 5 tang, overføre en enkelt rengjøres larve fra den lille bassenget til større pool av disseksjon buffer.
2. Grov Disseksjon av Larver
- Mens larven er fortsatt innenfor det store bassenget av disseksjon buffer hekte larven med pinsett. Ett par av pins skal brukes for å ta tak i munnen kroker, mens det andre paret av tenger blir brukt til å holde Animal fortsatt (grip larven forsiktig på 1/3 kroppslengde).
- Hold jevn pinsett inneholdende skjellaget nær munningen kroker samtidig raskt å trekke resten av legemet bort med det andre paret av tenger.
- Når larven begynner å rive fra hverandre vil du føle en svak utgivelse i spenning. Slipp larve fra tang og tillate "guts" av larven å renne ut. Dette gjør det mulig for de imaginal plater for å forbli i sin normale konformasjon og hindrer dem fra å bli deformert.
- Med en pinsett gripe munnen kroker igjen for å holde den fremre enden av larven på plass. Ved hjelp av det andre paret av tenger fjerne den nedre 2/3 av larvene med de indre mot. Merk: et kompleks som inneholder munn kroker, Eye-antennal plater, hjernehalvdelene, ventral ganglion, spyttkjertler, noen leg-plater, og den overliggende skjellaget vil forbli.
- Med en pinsett forsiktig fjerne liggende skjellaget, spyttkjertlene, leg-plater ogandre vev. Merk: bare vev som bør forbli er munningen kroker, øye-antennal plater, hjernehalvdelene, og ventral ganglion (figur 3).
- Gjenta trinn 02.01 til 02.05 med ekstra larver for 15-20 min. Merk: imaginal plater som forblir i disseksjon buffer for lengre perioder av gangen har en tendens til å svekke og til slutt vil fremstå som mindre enn ideelle prøver å bli fotografert. Således, etter at et maksimum på 20 min alle dissekerte vev skal overføres til PLP fikseringsmiddel (se nedenfor).
3. fiksering og farging av vev med Antistoffer
- Ved hjelp av en P-200 Pipetman, overføre dissekert vev til en klokke glass som inneholder kaldt Paraformaldehyde-lysin-periodat (PLP) fiksativ. Volumgrense på overført disseksjon buffer til 50 mL for å redusere utvanning av PLP. Sørg for å kutte spissen med et barberblad slik at spissen åpningen er stor nok til å romme de dissekerte vev. Ved hjelp av en pinsett elleren wolfram nål sikre at de dissekerte vev er helt nedsenket i rekkefølge for riktig fiksering skal skje. Inkuber dissekerte vev i kaldt PLP fiksativ i 45 min. Dette inkubasjon kan skje ved RT uten agitasjon.
- Ved hjelp av en P-200 Pipetman, overfører de dissekerte vev for å vaske-buffer (RT) ved hjelp av en annen kutte gul spissen i 45 min. Grense volumet overført PLP til 50 pl for å minimalisere fortynning av vaskebufferen. Merk: alle dissekert vev skal være helt under vann.
- Overfør 20 til 30 sett med dissekert vev til 1,5 ml mikro-sentrifugerør. Merk: dersom et større antall øye-antennal skål komplekser er kombinert inne i røret, er det en mulighet for at vevet på bunnen av røret ikke vil bli utsatt for på riktig måte til de antistoffer. For optimalt resultat ikke mer enn 20-30 øye-antennal plate komplekser bør være til stede i et enkelt rør. De dissekerte vev vil slå seg ned til bunnen av den mikro-sentrifugerør. Derfor, i etterfølgende trinn uSE en Pipetman å fjerne og erstatte vaskebuffer, blokkering løsning, og antistoffer.
- Fjern vaskebuffer og erstatt med 100 ul blokkeringsløsning: 10% normal geiteserum i vaskebuffer. Inkuber ved romtemperatur med forsiktig rotasjon på en bordplate rotator i 10 min.
- Fjern blokkeringsløsning og erstatt med 100 ul av primære antistoffer som er hensiktsmessig fortynnet i 10% normalt geiteserum. Inkuber ved romtemperatur med forsiktig rotasjon i 16 timer.
- Fjern primære antistoffer og erstatte med 750 mL vaskebuffer. Plasser rørene på en nutator og tillate å nutate ved RT i 10 min. Merk: Den primære antistoffet kan lagres (oppbevares ved 4 ° C) og brukes på nytt senere. Gjenbruk av antistoffer flere ganger kan bidra til å redusere ikke-spesifikk binding.
- Tillater hodene å sette seg på bunnen av røret, og deretter fjerne vaskebuffer og tilsett 100 ul av sekundære antistoffer som er hensiktsmessig fortynnet i 10% normalt serum. Inkuber ved RT med milde rotasjon for 2̵1, 4 hr.
- Fjern sekundært antistoff løsninger fra vev og erstatte med 500 mL av vaskebuffer. Tillat vev for å sette seg på bunnen av røret.
- Ved hjelp av en P-200 og et kutt gul spiss, overføre alle dissekert vev til en pool av vaskebuffer som har blitt plassert på dissekere parabolen. Mens fortsetter med det neste trinn av fine disseksjon, vil vevet inkuberes i vaskebufferen. Dette hjelper til å fjerne overskytende sekundære antistoffer.
4. Fin Disseksjon av Eye-antennal Disc komplekser og montering på lysbilder
- Bruk en pinsett til å hekte skjellaget ved munningen kroker med ventral siden av komplekset vender nedover. Med et andre par av pins fjerne de to hjernelapper ved å lukke den andre tang i rommet mellom hjernen og øye-plater (figur 3, rød pil) og raskt å trekke i hjernen bort fra munningen kroker.
- Mens du fortsetter å holde på munnen kroker, klype offvevet så nær som mulig til forbindelsen mellom antennal del av øye-antennal plate og munn kroker (figur 3, blå pil). Merk: Eye-antennal plate komplekser bør være fri for alle vev (figur 1A). Fortsett til alle ønskede vev ønsket som kan plasseres på lysbilder har blitt dissekert. Denne protokollen kan tilpasses for å isolere vinge, haltere, ben og kjønns imaginal plater (Figur 1B-E).
- Bortsett Legg til to små biter av silkepapir (størrelse av dekkglass) ca 3 in. På dissekere parabolen. Plasser en glass-slide på parabolen - to stykker av silkepapir bør være under endene av raset. Dette vil hindre at lysbildet fester seg til silikon base av dissekere parabolen.
- Ved hjelp av en P-20 med en spiss uslipte, tilsett 9 pl av et anti-blekemiddel til midten av glasset objektglass. Dette hindrer bleking av vevet når sett med fluorescerendelys.
- Ved bruk av samme uncut spissen, samles alle øyen-antennal plater og legge dem til slipp av anti-bleking reagens. Minimere mengden av vaskebuffer som blir overført. Prøv å begrense mengden av vaskebuffer til 10 ul eller mindre.
- Bruk en pinsett til å skille og spre ut Eye-antennal plater innenfor dråpe anti-bleking reagens. Tillat plater å ruge i anti-bleking reagens i flere minutter. Merk: plater vil slå klart som vevet absorberer anti-bleking reagens.
- Ved hjelp av en fin pensel forsiktig senke en dekkglass på prøven. Dette hindrer dannelse av luftbobler.
- Butikken lysbilder ved -20 ° C til den er klar for å vise øye-antennal eller andre imaginal plater ved hjelp av lys eller fluoriserende mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metoden som er beskrevet ovenfor pålitelig produserer høykvalitets materiale for analyse med in situ sonder, transkripsjons journalister, protein feller og antistoffer. I figur 1 viser vi øye-antenne, genital, vinge, haltere og leg-plater som er rutinemessig utvinnes med denne metoden. Disse platene har blitt behandlet med en phalloidin-konjugert fluorofor, som binder seg til F-aktin og derfor skisserer hver celle. Hvis vevet er blitt festet på riktig måte så den morfogenetiske fure i øyet platen, kantene av konsentriske folder vev i kjønnsorganene, antennal og leg-plater, og dorsal-ventral aksen av vinge og haltere plater vil alle være skarpe kanter . Hvis en vev er skikkelig festet deretter antistoffer, fluorescerende proteiner og in situ-sonder vil også avsløre skarpe mønstre. Flere eksempler er vist i figur 2. De tre paneler skjermplater som er blitt farget med forskjellige antistoffer Menslavere tre paneler viser plater med GFP brukes til å markere populasjoner av celler.
En av de mest slående trekk ved øyet-antennal platen er morfogenetiske fure (figur 1A), som kan bli sett på som et innrykk innen vev som går langs rygg-ventral aksen 1, 22. Før den tredje larve instar alle cellene i det fremkallende øye er unpatterned, udifferensiert og ikke skilles morfologisk fra hverandre. Ved starten av den tredje larve instar morfogenetiske fure starter på bakre margin på øyet feltet og utvikler anteriorly mot øyet / antennal grensen 22. Som furen utvikler seg over øyet feltet havet av uordnede celler er forvandlet til en ordnet rekke med jevne mellomrom enhets øyne eller ommatidia (figur 1A) 22-23. Forkant av furen et gen regulatoriske nettverk som inkluderer Pax6 homolog Eyeless (Ey) kanaler cellermot øye skjebne (figur 2A) 15. Initiering og progresjon av fåra selv er avhengig av aktivitetene the Hedgehog (Hh) og Decapentaplegic (DPP) signalveier 24-29. Faktisk en DPP-lacZ reporter reflekterer trofast uttrykk for DPP locus innen furen (figur 2B) 30-31. Som celler avslutte fure og begynne å vedta sine terminal skjebner, uttrykker de cellespesifikke markører som embryonale dødelig unormalt syn (elav), som koder for et pan-nevronale RNA bindende protein (figur 2C) 32-34.
Figur 1. imaginal plater av Drosophila melanogaster. (
Figur 2. Klonal analyse og ekspresjon av øyet imaginal platen (A - F). Confocal bilder av øyet Imaginal plater. (A) Den Pax6 protein Eyeless (Ey) er fordelt stort sett i forkant av morfogenetiske fure. (B) En DPP-lacZ transcriptional reporter reagerer på Hh signalering og er uttrykt i morfogenetiske fure. (C) Den pan-nevronale RNA bindende protein Elav distribueres i alle utviklingsfotoreseptorer bak morfogenetiske fure. (D) Et øye-plate inneholdende tap-av-funksjon-kloner generert av FLP / FRT-systemet. De kloner som er identifisert ved mangelen på GFP (E). Et øye plate som inneholder over-uttrykk kloner generert med FLP-out system. Kloner er positivt merket med GFP. (F) Et øye plate som inneholder MARCM kloner. Som FLP-ut-systemet, kan de MARCM klonene bli identifisert ved tilstedeværelse av GFP. Alle detekterte proteiner og genotyper er oppført i figuren. Anterior er til høyre og rygg er opp.
Figur 3. Eye-antenne-hjerne kompleks. Et schematic tegning av den første dagen grove disseksjon produkter. De eneste vev som skal være løst er munnen kroker, øye-antenne plater og hjernen (ofte ganger ventral ganglion vil forbli festet i tillegg - ikke vist). Lilla = hjerne, grønn = eye-antenne plater, brune = munn kroker. Anterior er til høyre. Hvis dissekere etappe, vinge, haltere og genital plater, bør den ytterste skjellaget av larven fortsatt være knyttet til disse vev. Ikke fjern liggende skjellaget som du kan miste de imaginal plater under påfølgende overføringer gjennom ulike antistoff, blokkere og vaskeløsninger. Det overskytende vev kan fjernes under de fine disseksjon trinn (4.1 til 4.2).
Figur 4. Plassering av imaginal plater innenfor Drosophila larve. Et skjematic tegning av den relative plasseringen av øye-antenne, ben, vinge, haltere og genital plater innenfor en tredje instar larve. Den oppsikts antennal plate er farget i grønt, bein plater er i blått, er grimen plate i lilla, er vingen plate i brun / oransje og genital plate i lys brun. Anterior er til høyre.
| Navn på løsning |
| 8% Paraformaldehyde |
| 0,2 M natriumfosfat Enbasisk |
| 0,2 M natriumfosfat Disbasic |
| 1 N Natriumhydroksid |
| 10% Triton |
| 0,1 M natriumfosfat-buffer (Buffer Disseksjon) |
| 0,1 M natriumfosfatbuffer + 0,1% Triton (vaskebuffer) |
| Lysinbuffer |
| 2% Paraformaldehyde-lysin-periodat fiksativ (PLP) |
| 10% Normal geit serum |
Tabell 1: Liste over Obligatoriske Solutions.
| 8% Paraformaldehyde stamløsning |
| Til en 50 ml Erlenmeyerkolbe legge følgende: |
| 2,0 g paraformaldehyd |
| 23,0 ml destillert vann |
| 4,0 dråper 1 N natriumhydroksyd (fra et glass pasteur pipette) |
| Miks og varme på en røre plate til løsning når en mild koke |
| La det forsiktig koke til paraformaldehyde er helt oppløst |
| Plasser på is inntil kaldt (lage fersk før hver disseksjon) |
| 0,1 M fosfatbuffer (Disseksjon (P) buffer) |
| Til en 50 ml konisk tube legge til følgende: |
| 18,0 ml 0,2 M dinatriumhydrogenfosfat |
| 7,0 ml 0,2 M natriumfosfat, monobasisk |
| 25,0 ml destillert vann |
| Oppbevar ved 4 ° C (1 uke holdbarhet) |
| 0,1 M Phosphate + Vaskemiddel Buffer (Wash (W) Buffer) |
| Til en 50ml konisk rør legge til følgende: |
| 18,0 ml 0,2 M dinatriumhydrogenfosfat |
| 7,0 ml 0,2 M natriumfosfat, monobasisk |
| 25,0 ml destillert vann |
| 0,5 ml 10% Triton |
| Oppbevares ved RT (1 uke holdbarhet) |
| Lysin (L) Buffer |
| Til en 50 ml konisk tube legge til følgende: |
| 0,4 g Lysin |
| 1,2 ml 0,2 M dinatriumhydrogenfosfat |
| 8,0 ml Disseksjon (P) Buffer |
| 10,0 ml destillert vann |
| Rist-oppløsning inntil lysin er fullstendig oppløst |
| Plasser på is inntil kaldt (lage fersk før hver disseksjon) |
| 2% Paraformaldehyde - lysin - periodat (PLP) fiksativ |
| 0,1 g natriumperjodat |
| 15,0 ml av lysin (L)-buffer |
| 5,0 ml av 8% Paraformaldehyde |
| Rist løsning godt inntil natriumperjodat er helt oppløst |
| Plasser på is inntil kaldt (lage fersk før hver disseksjon) |
Tabell 2: Oppskrifter for Nødvendige Solutions.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om denne fremgangsmåten har i stor grad fokusert på isolering og påfølgende behandling av øye-antennal plater, det er mottagelig for å bli brukt for å isolere og analysere vingen, haltere, ben og genital-plater (figur 4). Den eneste nødvendige modifikasjon av protokollen for å isolere disse platene (i motsetning til øyet-antennal plate) er metoden for grov disseksjon (§ 2 i protokollen). Det første ben torakale (T1) paret er funnet på den fremre av larven og kan utvinnes ved å følge protokollen for øye-antennal plate isolasjon. Men de andre ben torakale (T2) plater er festet til hårstråene. For å isolere disse platene en pinsett bør brukes til å holde munnen kroker (som beskrevet over) mens en annen pinsett bør brukes til å hekte den ventral cuticle av dyret (sørg for å hekte larven om 1/3 fra munn kroker. kan Larven bare være filetere ved å rive den ventral hårstråene bort fra resten av LARva. T2 ben forblir festet til hårstråene. Den tredje thorax (T3) ben er festet til vingen og haltere plater som en del av et kompleks, som i seg selv er også festet til hårstråene. Du kan velge å skille platen komplekse og T2 bena fra skjellaget på dette stadiet eller holde skjellaget-disc kompleks sammen i løpet av de påfølgende feste / antistoff ruge trinn og isolere skivene under den fine disseksjon del av prosedyren (§ 4) . For å utvinne genital plater, er det best å ta tak i larver på midsection med ett par pinsett og deretter skrelle ventral hårstråene bort med den andre pinsett starter på midsection og endte på bakre enden av larven. Det anbefales at tang brukes til å fjerne all overflødig vev og deretter overføre bare genital platen til fiksativ løsning ved hjelp av en P-200 Pipetman og en gul tips hvis slutt har blitt kuttet med et barberblad.
Denne fremgangsmåten er best egnet for tissdier av begrenset tykkelse som imaginal plater og fungerer best hvis de antistoffer som brukes er av høy titer og spesifisitet. Den kan imidlertid tilpasses til å fungere godt med tykkere vev som det voksne eggstokk, testis, og hjernen, så vel som med lav titer antistoffer eller de som gir høyere enn ønsket "bakgrunnen" farging. Når man arbeider med tykkere vev, er det foreslått at optimale resultater kan oppnås ved ganske enkelt å øke konsentrasjonen av paraformaldehyd og / eller inkubering i PLP fiksativ i lengre perioder av gangen. Siden riktig fiksering av dissekerte vev er avgjørende for suksess med denne protokollen er det også foreslått at effektiviteten av å øke paraformaldehyd konsentrasjon og / eller ved å øke fikseringslengden vurderes med phalloidin (figur 1). Særlig bør nøye betales til "skarphet" av celle skisserer og andre fysiske landemerker i vevet (dvs. morphogenetic fure). En annen måte å sikre at din vev (særlig tykkere prøver) er fast på riktig måte er å forberede 8% paraformaldehyde og PLP løsninger frisk før hver disseksjon. Og endelig kan den totale kvaliteten av disseksjon økes hvis vev dissekeres for korte tidsperioder, og vevet blir overført inn i fikseringsmiddel så snart som mulig. Det foreslås at dissekere for ikke lenger enn 15-20 min. Dissekere for kortere lengder øker kvaliteten av vev bevaring.
Denne protokollen fungerer godt med et bredt spekter av antistoffer, men det er sant at noen antistoffer ikke virker godt med PLP fiksativ. Ett eksempel er beryktet antistoff som gjenkjenner den grove (Ro) transkripsjonsfaktor. Ru er uttrykt i, og er nødvendig for spesifisering av en undergruppe av utvikling av fotoreseptorene 35. Den anti-Ro antistoff fungerer best, ikke med PLP, men heller med en RØR - EGTA - MgSO 4 (PEM) bUffer 36. Likeledes kan andre antistoff virker best på vev som har blitt inkubert i ytterligere andre fiksativer. Det foreslås at, med mindre annet er oppgitt, bør PLP fiksativ prøves først. Hvis mislykket da prosessen med å finne en alternativ fikseringsmiddel bør begynne.
Et vanlig problem å møte er arbeids konsentrasjonen av antistoff i spørsmålet. Ofte ganger du kan være den første forskeren til å bruke en bestemt antistoff for å påvise proteiner i vev av interesse. Arbeids konsentrasjon kan avvike fra det som er rapportert for andre vev. Det foreslås at den anbefalte konsentrasjon prøves først. Økning av konsentrasjonen av antistoffet hvis et signal ikke kan sees. På den annen side, hvis den anbefalte konsentrasjon gir høy bakgrunnsfarging deretter fortynning av antistoffet skal prøves. Arbeids konsentrasjoner blant antistoffer kan variere. For eksempel er den anti-Øyne Fraværende (Eya) antistoff fortynnet 1: 5, mens antiElav antistoff fungerer bra selv ved en 1: 500 fortynning. Noen antistoffer kan også fortynnes så langt ned som 1: 3000. I tillegg denne prosedyren, som skrevet, fungerer best med høy spesifisitet antistoffer. Imidlertid, som mange har erfart, kan noen antistoffer binder ikke-spesifikt til vevet, og dette kan skape en sub-optimalt bilde. Denne situasjonen kan ofte korrigeres ved å inkubere fortynnet antistoff med faste embryoer eller larve skrotter før blir lagt til de faste imaginal plater. Avhengig av nivå av ikke-spesifikk bakgrunn flekker, kan den nødvendige lengden på "pre-absorpsjon" variere og må være utarbeidet på en prøveordning. Det er også mulig å øke signal / støyforholdet ved å re-antistoffer ved hjelp av flere ganger eller ved å gjennomføre flere runder med pre-absorpsjon.
Når de bestemmer seg for hvilke plater bør brukes i publikasjoner og / eller presentasjoner, er det best å velge plater som har blitt rettet med den apikale siden orientert opp avdelinger. Det er også best å bruke plater som ikke er brettet. Dette gjelder særlig i øyet-antennal plate. Den ventrale siden av platen har en tendens til å kaste seg, og dessverre er det lite man kan gjøre for å hindre at dette skjer. En løsning er å dissekere yngre plater som disse har en tendens til å kaste langt mindre. Et annet alternativ er å bare dissekere et stort antall plater til du får en som er helt flat. Den generelle formen på øyet-antennal plate kan bli påvirket av den hastigheten som larven er revet fra hverandre. Hvis man trekker larven hverandre for raskt hullet gjennom hvilket hjerne-platen passerer komplekset er liten og den øye-antennal platen kommer ut foldet og / eller strukket. Det er best å trekke sakte fram larven begynner å rive siden hullet blir større. Deretter kan du fortsette å trekke hjernen-øye-antennal plate kompleks sakte. Husk at du aldri kan trekke for sakte. Vær også oppmerksom på at den hastigheten som du river vev er ikke en faktor i isolering av andre vev.
ve_content "> livssyklus Drosophila består av tre larve faser. Viktige utviklings arrangementer finner sted i løpet av hver og en av disse fasene, og dermed kan det være viktig å isolere vev ikke bare fra tredjelarve instars (som er hovedfokus i denne prosedyren) men også fra både første og andre larve instars også. med en mindre unntak, kan denne fremgangsmåten brukes, som skrevet, for å isolere Annet stadiums-plater. Under den fine disseksjon del av fremgangsmåten (seksjon 4) er det anbefalt at skarpe wolfram ledning skal brukes til å skille de øye-antennal platen fra ytre vev som munn kroker, hjerne og spyttkjertlene. Wolframtråd kan også brukes til å separere T2 / T3 ben, vinge og haltere plater fra hverandre, og den overliggende hårstråene . Det er anbefalt at den ene enden av wolframtråd (enden som vil bli brukt for å separere vev) slipes ved oppvarming i et kokende natriumnitrat-bad Den andre enden kan innføres i et fint skrustikke,. ther vil tillate deg å holde wolfram wire lettere. Dessverre er det betydelig vanskeligere å isolere intakte første INSTAR plater, derfor anbefales det at du plasserer hele øyet-antennal plate / hjerne / munn krok kompleks på lysbildet og dekk med et dekkglass. Mengden av dissekert vev kan bli minimalisert ved hjelp av en skarp wolframtråd for å fjerne spyttkjertlene og overliggende skjellaget forut for montering av platen / hjerne / munn krok kompleks på lysbildet. Det er relativt lett å identifisere den første stadium øye-antennal plate når det er fortsatt festet til hjernen og munnen kroker (se Figur 6A, D av Kumar og Moses, 2001) 37. De andre imaginal plater vil måtte skilles fra skjellaget og plassert på et lysbilde for visning.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Donald Ready og Kevin Moses for undervisning JPK den opprinnelige imaginal platen disseksjon prosedyren. Vi takker også Bonnie Weasner for genital platen i figur 1B og øyet platen i figur 2A, Brandon Weasner for figur 3, Bloomington Drosophila Stock Center for flue flekker og utviklingsstudier Hybridom Bank for antistoffer. CMS har vært støttet av et stipend fra National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), Frank W. Putnam Stipendiat, og Robert Briggs Stipendiat. JPK er støttet av et stipend fra National Eye Institute (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
