Abstract
Una parte importante del desarrollo post-embrionario en la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se lleva a cabo dentro de un conjunto de estructuras en forma de saco llamadas discos imaginales. Estos discos dan lugar a un alto porcentaje de estructuras adultas que se encuentran dentro de la mosca adulta. Aquí se describe un protocolo que ha sido optimizada para recuperar estos discos y prepararlos para el análisis con anticuerpos, marcadores transcripcionales y trampas de proteína. Este procedimiento es el más adecuado para los tejidos finos como los discos imaginales, pero se puede modificar fácilmente para su uso con tejidos más gruesos, como el cerebro y el adulto ovario larval. El protocolo escrito y video que acompaña guiarán el lector / espectador a través de la disección de las larvas de tercer estadio, la fijación de tejido, y el tratamiento de los discos imaginales con anticuerpos. El protocolo se puede utilizar para diseccionar discos imaginales de larvas jóvenes primero y segundo instar también. La ventaja de este protocolo es que es relativamente corto y tiene seres optimizado para la preservación de la alta calidad del tejido diseccionado. Otra ventaja es que el procedimiento de fijación que se emplea funciona bien con el abrumador número de anticuerpos que reconocen proteínas de Drosophila. En nuestra experiencia, hay un número muy pequeño de anticuerpos sensibles que no funcionan bien con este procedimiento. En estas situaciones, el remedio parece ser el uso de un cóctel de fijación alternativo sin dejar de seguir las pautas que hemos establecidos para los pasos de disección e incubaciones de anticuerpos.
Introduction
Durante más de un siglo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, ha sido un sistema principal para estudiar el desarrollo, comportamiento y fisiología. Desarrollo en la mosca se puede dividir en dos grandes etapas: embrionarias y post-embrionarias con gran parte de la toma lugar dentro de este último epitelios monocapa llamadas discos imaginales 1-3. Dibujos de los discos imaginales se publicaron por primera vez en 1864 por August Weismann como parte de su amplia monografía sobre el desarrollo del insecto 1. Estos discos comienzan su desarrollo durante la embriogénesis, se modelan durante las etapas larvales, sobrevivir a la histolysis masiva de las primeras etapas de pupa, y en última instancia, dar lugar a un alto porcentaje de estructuras adultas que se encuentran dentro de la mosca adulta 1-14. Durante el desarrollo larvario cada disco hace varias decisiones críticas con respecto a la suerte, forma y tamaño. Dentro de la primera y segunda etapas larvales, los discos tienen la tarea de adoptar un destino primario, establisHing límites de compartimento, la adopción de la forma correcta y generar el número necesario de células 15-16. Durante el tercer estadio larval y la etapa pre-pupa temprano, los discos imaginales continúan dividiéndose y se modelan como células adoptan sus destinos terminales 16.
Durante la historia temprana de la biología del desarrollo de Drosophila, discos imaginales se estudiaron casi exclusivamente en el contexto del desarrollo normal y en los pocos casos en los que una pérdida o mutante de ganancia de función era viable. El uso de rayos X para inducir la recombinación mitótica permitido para las mutaciones letales para ser analizada en clones de células dentro de los tejidos de larvas y adultos. Este método ha sido mejorado por la introducción de métodos transgénicos para analizar la pérdida y ganancia de función de las mutaciones en ambos tejidos de larvas y adultos. El número de anticuerpos, reporteros transcripcionales y trampas de proteína para describir el paisaje molecular de tipo salvaje y mutantes tejidos es también constndo RT crecimiento. El uso de estos marcadores moleculares para analizar la pérdida y ganancia de función de clones de células mutante ha hecho cada vez más factible obtener una comprensión en tiempo real de cómo las células mutantes se desvían de sus primos de tipo salvaje durante el desarrollo. Para aprovechar adecuadamente estas herramientas y reactivos que es fundamental contar con los preparativos de la alta calidad de los discos imaginales que se pueden ver, fotografiados y analizados. El objetivo de este manuscrito es proporcionar un protocolo optimizado para el aislamiento y la preparación del complejo de disco ojo antenal (Figura 1A). También puede ser utilizado con éxito para aislar una amplia variedad de discos adicionales, incluyendo los que dan lugar a las alas, haleteres, piernas T1-T3 y los genitales (Figura 1B-E). Este procedimiento, con modificaciones menores, se ha utilizado para aislar los discos imaginales de Drosophila durante casi ochenta años.
Como se describió anteriormente, ya que la mayoría de los genes se expresan durante multiple etapas de desarrollo y en una multitud de tejidos, a menudo es imposible estudiar los efectos que tienen los mutantes nulos en todo el ojo como el animal muere mucho antes de la etapa de larva de tercer instar. Cuatro métodos han hecho el estudio de los tejidos más desarrollados, como la retina significativamente más manejable. El primero es el método flipasa (FLP) / flipasa Recombinación Target (FRT) de generar clones de células mutantes dentro de un tipo de tejido de otro modo salvaje 17-19. En este caso, el tejido mutante se identifica por la ausencia de un marcador visual tal como la proteína fluorescente verde (GFP) y puede ser comparado con el tejido circundante de tipo salvaje en la que está presente GFP (Figura 2D). El segundo es el método "flp-out" en el que un transgén se expresa en una población de células 20. En este caso, los clones de células se identifican por la presencia de GFP y se compararon con el tejido circundante de tipo salvaje que carece del reportero GFP (Figura2E). El tercero es el Análisis Mosaico con una técnica de marcador celular reprimible (MARCM), que combina elementos de los sistemas de expresión de FLP-Salida 21 clon mutante FLP / FRT y. Con este método un transgén puede ser expresado dentro de una población de células que son simultáneamente mutante para un locus genético individual. Como clones flp-out, MARCM clones se identifican por la presencia de GFP y se comparan con el tejido circundante de tipo salvaje que carece del marcador de GFP (Figura 2F). Y por último, los genes y las construcciones de ARNi se pueden expresar dentro de los tejidos imaginales bajo el control de constructos específicos promotor GAL4. Estos cuatro métodos han aumentado el interés en el estudio de los discos imaginales desde clones mutantes o patrones o sobre-expresión se pueden comparar directamente con los tejidos de tipo natural adyacente. El método descrito en este procedimiento ha sido desarrollado para que los investigadores que estudian el desarrollo post-embrionario de los tejidos adultos en Drosophila,especialmente las derivadas de la disco-ojo antenal, podrán obtener tejido de alta calidad para el análisis. Aunque los investigadores individuales han hecho ligeras modificaciones, el núcleo de este procedimiento (que se describe aquí) se ha mantenido prácticamente inalterada. Desde la obtención de tejido de alta calidad es fundamental para el estudio de los discos imaginales Esperamos que este protocolo escrito y video que acompaña servirán como recurso didáctico valioso.
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Protocol
1 Preparación de larvas
- Llene un 35 mm placa de Petri con tampón de disección.
- Coloque las larvas en placa de Petri y les permiten nadar alrededor durante unos minutos (paso de auto-limpieza).
- Transferencia de las larvas a una piscina de tampón de disección en una placa de disección a base de silicona. Esta piscina debe estar en un borde de la placa. La placa de disección consiste en una solución de silicona que ha sido vertido y endurecido dentro de una placa de Petri de vidrio.
- Usando una pipeta pasteur-, colocar un mayor número de tampón de disección en el medio de la placa de disección.
- Utilizando # 5 pinzas, transferir una sola larva limpiado desde la pequeña piscina de la piscina más grande de tampón de disección.
2. Grueso Disección de larvas
- Mientras que la larva está todavía dentro de la gran piscina de búfer disección estrechar la larva con las pinzas. Un par de fórceps se debe utilizar para agarrar los ganchos de la boca mientras que el otro par de pinzas se utiliza para mantener la animal todavía (agarrar la larva suavemente a un tercio la longitud del cuerpo).
- Mantener estable el par de pinzas que contienen la cutícula cerca de los ganchos de la boca mientras se tira rápidamente el resto del cuerpo de distancia con el segundo par de pinzas.
- Cuando la larva comienza a desgarrar usted se sentirá una leve liberación de la tensión. Suelte la larva de las pinzas y permitir las "entrañas" de la larva a derramarse. Esto permite que los discos imaginales a permanecer en su conformación normal y les impide que se deforme.
- Con un par de pinzas agarrar los ganchos de la boca de nuevo para sujetar el extremo frontal de la larva en su lugar. Usando el otro par de fórceps extirpar la sección inferior 2/3 de las larvas incluyendo las agallas interiores. Nota: un complejo que contiene los ganchos de la boca, los discos de ojos antenal, hemisferios cerebrales, ganglio ventral, las glándulas salivales, algunos discos de la pierna, y la cutícula que recubre permanecerán.
- Con un par de pinzas eliminar suavemente la cutícula suprayacente, glándulas salivales, los discos y las piernasotro tejido. Nota: sólo el tejido que debe permanecer es los ganchos de la boca, los discos de ojos antenal, hemisferios cerebrales, y el ganglio ventral (Figura 3).
- Repita los pasos 2.1 a 2.5 con larvas adicional durante 15-20 min. Nota: Los discos imaginales que permanecen en tampón de disección durante períodos de tiempo más largos tienden a degradarse y, finalmente, aparecen como menos de ejemplares ideales para ser fotografiados. Así, después de un máximo de 20 min todos los tejidos disecados deben ser transferidos a la fijador PLP (ver más abajo).
3. fijación y la tinción de tejido con anticuerpos
- El uso de un Pipetman P-200, transfiera los tejidos disecados a un vidrio de reloj que contiene frío paraformaldehído-lisina-Periodato (PLP) fijador. Límite de volumen de tampón de disección transferido a 50 l para minimizar la dilución de PLP. Asegúrese de cortar la punta con una cuchilla de afeitar de manera que la abertura de la punta es lo suficientemente grande para dar cabida a los tejidos disecados. Con un par de pinzas ouna aguja de tungsteno asegurar que los tejidos disecados están completamente sumergidos en orden para la fijación adecuada que se produzca. Incubar los tejidos disecados en fijador PLP frío durante 45 min. Esta incubación puede tener lugar a temperatura ambiente sin agitación.
- El uso de un Pipetman P-200, transferir los tejidos disecados a tampón de lavado (RT) utilizando otra punta amarilla cortar durante 45 min. Límite de volumen PLP transferido a 50 l para reducir al mínimo la dilución del tampón de lavado. Nota: todos los tejidos disecados deben estar totalmente sumergidos.
- Transferencia de 20-30 conjuntos de tejido diseccionado a 1,5 ml tubo de microcentrífuga. Nota: si los números más grandes de los complejos de disco de ojo de antenal se combinan dentro del tubo, hay una posibilidad de que el tejido en la parte inferior del tubo no quedará correctamente expuesto a los anticuerpos. Para obtener resultados óptimos no más de 20-30 complejos de disco antenal oculares deben estar presentes dentro de un único tubo. El tejido diseccionado se depositan en el fondo del tubo de microcentrífuga. Pasos Por lo tanto, en posteriores use una Pipetman de quitar y reemplazar el tampón de lavado, solución de bloqueo, y los anticuerpos.
- Retire tampón de lavado y reemplazar con 100 l de solución de bloqueo: 10% de suero normal de cabra en tampón de lavado. Incubar a temperatura ambiente con rotación suave en una parte superior de los rotadores mesa para 10 min.
- Eliminar la solución de bloqueo y reemplazar con 100 l de anticuerpos primarios que se han diluido apropiadamente en 10% de suero normal de cabra. Incubar a temperatura ambiente con rotación suave durante 16 horas.
- Retire anticuerpos primarios y reemplazar con 750 l de tampón de lavado. Colocar los tubos en un nutator y permitir a nutate a TA durante 10 min. Nota: El anticuerpo primario se puede guardar (almacenar a 4 ° C) y volver a utilizar más adelante. La reutilización de anticuerpos múltiples veces puede ayudar en la reducción de la unión no específica.
- Permitir cabezas a asentarse en el fondo del tubo, a continuación, eliminar el tampón de lavado y se añaden 100 l de anticuerpos secundarios que han sido diluidos apropiadamente en 10% de suero normal. Incubar a temperatura ambiente con rotación suave para 2̵1; 4 hr.
- Retire soluciones de anticuerpos secundarios de tejidos y reemplazar con 500 l de tampón de lavado. Permitir que el tejido se depositan en el fondo del tubo.
- El uso de un P-200 y una punta amarilla corte, transferir todos los tejidos disecados a una piscina de tampón de lavado que se ha colocado en el plato de disección. Mientras que proceder con el siguiente paso de la disección fina, el tejido se incuba en el tampón de lavado. Esto ayuda a eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.
4. Fine Disección de Eye-antenal discos Complejos y montaje en portaobjetos
- Utilice un par de fórceps para estrechar la cutícula por los ganchos de la boca con el lado ventral del complejo hacia abajo. Con un segundo par de pinzas quitar los dos lóbulos cerebrales mediante el cierre de los segundos fórceps en el espacio entre los discos del cerebro y del ojo (Figura 3, flecha roja) y rápidamente tirando del cerebro lejos de los ganchos de la boca.
- Sin dejar de aferrarse a los ganchos de la boca, pellizcarel tejido lo más cerca posible a la conexión entre la sección de antenal del disco de ojos antenal y los ganchos de la boca (Figura 3, flecha azul). Nota: los complejos de disco antenal ojos deben estar libres de todo el tejido (Figura 1A). Continúe hasta que todo el tejido deseado deseada que puede ser colocado en portaobjetos ha sido diseccionado. Este protocolo se puede adaptar para aislar ala, haltere, la pierna y discos imaginales genitales (Figura 1B-E).
- Añadir dos pequeños trozos de papel de seda (tamaño del cubreobjetos) aproximadamente 3 pulg. De distancia en el plato de disección. Coloque una lámina de vidrio sobre el plato - los dos trozos de papel de seda deben estar bajo los términos de la diapositiva. Esto evitará que la corredera se pegue a la base de silicona del plato de disección.
- El uso de un P-20 con una punta sin cortar, añadir 9 l de un agente anti-blanqueamiento a la mitad del portaobjetos de microscopio de vidrio. Esto evita la decoloración de los tejidos cuando se ve con fluorescenteluz.
- Usando la misma punta sin cortar, recoger todos los discos de ojos antenal y añadirlos a la gota de reactivo anti-blanqueo. Minimizar la cantidad de tampón de lavado que se lleva sobre. Trate de limitar la cantidad de tampón de lavado a 10 l o menos.
- Use un par de pinzas para separar y extender los discos de ojos antenal dentro de la gota de reactivo anti-blanqueo. Permitir que los discos se incuben en el reactivo anti-blanqueo por varios minutos. Nota: Los discos se volverán claros como el tejido absorbe el reactivo anti-blanqueo.
- El uso de un pincel fino baje suavemente un cubreobjetos sobre la muestra. Esto evita la formación de burbujas de aire.
- Tienda desliza a -20 ° C hasta el momento de ver los discos imaginales ojo-antenales u otros que utilizan la luz o microscopía de fluorescencia.
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Representative Results
El método que se ha descrito anteriormente de forma fiable produce material de alta calidad para el análisis con sondas in situ, reporteros transcripcionales, trampas de proteínas y anticuerpos. En la Figura 1 mostramos ojo-antena, genitales, ala, haltera y piernas discos que se recuperan de forma rutinaria con este método. Estos discos han sido tratados con un fluoróforo-faloidina conjugada, que se une a la actina F y por lo tanto describe cada célula. Si el tejido ha sido fijado correctamente entonces la morfogénesis surco del disco ojo, los bordes del tejido concéntrico pliegues en los discos genital, antenales y de la pierna, y el eje dorso-ventral de los discos del ala y se Haltère todos aparecen bordes afilados . Si un tejido se fija correctamente entonces anticuerpos, proteínas fluorescentes y sondas in situ también revelar patrones afilados. Varios ejemplos se muestran en la Figura 2. Los primeros tres paneles de visualización de discos que han sido teñidas con diferentes anticuerpos mientras que lostres paneles inferiores muestran los discos en los que las buenas prácticas agrarias se utiliza para marcar las poblaciones de células.
Una de las características más llamativas del disco de ojos antenal es la morfogénesis surco (Figura 1A), que puede ser visto como una hendidura en el tejido a lo largo del eje dorsal-ventral 1, 22. Antes del tercer estadio larval todas las células dentro el ojo en desarrollo son no pautada, indiferenciada, y morfológicamente indistinguibles unos de otros. Al comienzo de la tercera estadio larval la morfogénesis surco se inicia en el margen posterior del ojo y el campo progresa en sentido anterior hacia el ojo / frontera antenal 22. Como el surco progresa a través del campo del ojo el mar de células desordenadas se transforma en una matriz ordenada de ojos unidad espaciadas periódicamente o ommatidia (Figura 1A) 22-23. Por delante del surco de una red de regulación de genes que incluye el homólogo Pax6 Sin Ojos (Ey) células canaleshacia un destino ojo (Figura 2A) 15. El inicio y la progresión de la propia surco depende de las actividades de la Hedgehog (Hh) y decapentaplegic (DPP) vías de señalización 24-29. De hecho, un reportero de DPP-lacZ refleja fielmente la expresión del locus dpp dentro del surco (Figura 2B) 30-31. Como las células salen del surco y empiezan a adoptar sus destinos terminales, que expresan marcadores específicos de células tales como embriones letal visión anormal (elav), que codifica una proteína de unión a ARN pan-neuronal (Figura 2C) 32-34.
Figura 1. Los discos imaginales de Drosophila melanogaster. (
Figura 2. análisis clonal y expresión del disco imaginal ojo (A - F). Confocal de imágenes de discos imaginales del ojo. (A) La proteína Pax6 Sin Ojos (Ey) se distribuye ampliamente por delante de la morfogénesis surco. (B) Un DPP-lacZ transcripcional Reporter responde a la señalización de Hh y se expresa dentro de la morfogénesis surco. (C) La proteína de unión a ARN pan-neuronal Elav se distribuye en todos los fotorreceptores en desarrollo detrás de la morfogénesis surco. (D) Un ojo de disco que contiene clones pérdida de función de las generadas por el sistema FLP / FRT. Los clones se identifican por la falta de GFP (E). Un ojo de disco que contiene más de expresión clones generados con el sistema flp-out. Los clones están marcados positivamente con GFP. (F) Un ojo de disco que contiene clones MARCM. Al igual que el sistema de FLP-out, los clones MARCM pueden ser identificados por la presencia de GFP. Todas las proteínas y los genotipos detectados se enumeran dentro de la figura. Anterior es a la derecha y dorsal es hacia arriba.
Figura 3. complejo Eye-antena-cerebro. Un schdibujo Ematic de los productos secundarios de la primera disección día. Los únicos tejidos que deben ser corregidos son los ganchos de la boca, los discos de ojo-antena y el cerebro (a menudo veces el ganglio ventral permanecerá adjuntos, así - no presentados). Purple = cerebro, = discos ojo antenas verdes, marrones = ganchos de la boca. Anterior es a la derecha. Si la disección de la pierna, ala, haltera y discos genitales, la cutícula externa de la larva todavía debe atribuirse a estos tejidos. No quite la cutícula que recubre como usted podría perder los discos imaginales durante los traslados posteriores a través de diversas soluciones de anticuerpos, de bloques y de aseo. El exceso de tejido puede ser removido durante las etapas de disección finas (4.1 a 4.2).
Figura 4 Posición de los discos imaginales dentro de la larva de Drosophila. Un esquemaDibujo de tic de la posición relativa de los discos de ojo-antena, de la pierna, ala, Haltère y genitales dentro de un tercer instar de la larva. El disco de ojos antenal es de color verde, los discos de las piernas están en azul, el disco halter es de color morado, el ala disco está en marrón / naranja y el disco genital es de color marrón claro. Anterior es a la derecha.
| Nombre de la Solución |
| 8% de paraformaldehído |
| 0,2 M de fosfato de sodio monobásico |
| 0,2 M de fosfato de sodio Disbasic |
| 1 N de hidróxido de sodio |
| 10% de Triton |
| 0,1 M fosfato de sodio Buffer (Buffer Disección) |
| 0,1 M fosfato de sodio Buffer + 0,1% Triton (tampón de lavado) |
| Lisina Buffer |
| 2% paraformaldehído-lisina-Periodato Fijador (PLP) |
| 10% de suero de cabra normal |
Tabla 1: Lista de soluciones requeridas.
| 8% de solución de paraformaldehído de stock |
| En un matraz Erlenmeyer de 50 ml añadir lo siguiente: |
| 2,0 g de paraformaldehído |
| 23,0 ml de agua destilada |
| 4.0 gotas de 1 N de hidróxido de sodio (de una pipeta pasteur de vidrio) |
| Mezclar y calentar en una placa de agitación hasta que la solución alcanza un hervor suave |
| Dejar hervir suavemente hasta que se disuelva por completo paraformaldehído |
| Coloque en hielo hasta que se enfríe (hacer fresca antes de cada disección) |
| 0,1 M tampón fosfato (Disección (P) Buffer) |
| Para un tubo cónico de 50 ml añadir lo siguiente: |
| 18,0 ml 0,2 M de fosfato de sodio dibásico |
| 7,0 ml 0,2 M de fosfato de sodio monobásico |
| 25,0 ml de agua destilada |
| Almacenar a 4 ° C (1 semana caducidad) |
| 0,1 M de fosfato + Detergente Buffer (Wash (W) Buffer) |
| Para un 50tubo cónico ml agregar lo siguiente: |
| 18,0 ml 0,2 M de fosfato de sodio dibásico |
| 7,0 ml 0,2 M de fosfato de sodio monobásico |
| 25,0 ml de agua destilada |
| 0,5 ml 10% de Triton |
| Conservar a temperatura ambiente (1 semana caducidad) |
| Lisina (L) Buffer |
| Para un tubo cónico de 50 ml añadir lo siguiente: |
| 0,4 g Lisina |
| 1,2 ml 0,2 M de fosfato de sodio dibásico |
| 8,0 ml Disección (P) Buffer |
| 10.0 ml de agua destilada |
| Agitar solución hasta que se disuelve completamente lisina |
| Coloque en hielo hasta que se enfríe (hacer fresca antes de cada disección) |
| Paraformaldehído al 2% - Lisina - Periodato (PLP) fijador |
| 0,1 g peryodato de sodio |
| 15,0 ml de lisina (L) de tampón |
| 5,0 ml de 8% de paraformaldehído |
| Agitar bien hasta que la solución de peryodato de sodio se disuelve completamente |
| Coloque en hielo hasta que se enfríe (hacer fresca antes de cada disección) |
Tabla 2: Recetas para soluciones requeridas.
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Discussion
Aunque este procedimiento se ha centrado en gran medida en el aislamiento y el tratamiento posterior de los discos de ojo de antenal, es susceptible de ser utilizado para aislar y analizar el ala, haltere, la pierna y discos genitales (Figura 4). La única modificación necesaria del protocolo para el aislamiento de estos discos (en comparación con el disco de ojos antenal) es el método de disección gruesa (sección 2 del protocolo). El primer tramo (T1) par torácica se encuentra en la parte anterior de la larva y se puede recuperar siguiendo el protocolo para el aislamiento del disco de ojos antenal. Sin embargo, los segundos discos de pierna torácica (T2) están asociadas a la cutícula. Para aislar estos discos un par de pinzas se debe utilizar para mantener los ganchos de la boca (como se describió anteriormente), mientras que otro par de pinzas se debe utilizar para estrechar la cutícula ventral del animal (asegúrese de estrechar la larva de un tercio de la ganchos de la boca. La larva pueden ser simplemente filete rasgando la cutícula ventral lejos del resto de la LARVA. Las piernas T2 permanecerá unido a la cutícula. La tercera torácica (T3) de la pierna está unida a los discos del ala y Haltère como parte de un complejo, que a su vez también está unido a la cutícula. Usted puede elegir para separar el complejo de disco y las piernas T2 de la cutícula en esta etapa o mantener el complejo cutícula discos juntos durante los pasos de incubación / fijación de anticuerpos posteriores y aislar los discos durante la parte de la disección fina del procedimiento (artículo 4) . Para recuperar los discos genitales, lo mejor es agarrar las larvas en la sección media con un par de pinzas y luego pelar la cutícula ventral de distancia con el otro par de pinzas a partir de la sección media y terminando en el extremo posterior de la larva. Se recomienda que los fórceps se utilizan para eliminar todo el tejido extraño y luego transferir simplemente el disco genital a la solución de fijación utilizando un Pipetman P-200 y una punta amarilla cuyo final ha sido cortado con una hoja de afeitar.
Este procedimiento es el más adecuado para tissues de espesor limitado, como los discos imaginales y funciona mejor si los anticuerpos que se utilizan son de alto título y especificidad. Sin embargo, puede ser adaptado para trabajar bien con los tejidos más gruesos tales como el ovario adulto, testículo y cerebro, así como con los anticuerpos de bajo título o los que dan más de "fondo" de tinción deseado. Cuando se trabaja con los tejidos más gruesos, se sugiere que los resultados óptimos se pueden obtener aumentando simplemente la concentración de paraformaldehído y / o incubando en el fijador PLP durante períodos más largos de tiempo. Dado que la fijación adecuada de los tejidos disecados es esencial para el éxito con este protocolo también se sugiere que la eficacia de aumentar la concentración de paraformaldehído y / o el aumento de la longitud de fijación se evaluó con faloidina (Figura 1). En particular, se debe prestar mucha atención a la "nitidez" de los contornos celulares y otros puntos de referencia físicos dentro del tejido (es decir, la morphogsurco Enetic). Otra forma de asegurar que su tejido (en particular muestras más gruesas) se fija correctamente es preparar el paraformaldehído 8% y soluciones de PLP frescas antes de cada disección. Y, por último, la calidad general de la disección se puede aumentar si el tejido se diseca por períodos cortos de tiempo y el tejido se transfiere a fijador tan pronto como sea posible. Se sugiere que la disección durante no más de 15-20 minutos. La disección por menos tiempo aumenta la calidad de la conservación de tejidos.
Este protocolo funciona bien con una amplia gama de anticuerpos, pero es cierto que algunos anticuerpos no funcionan bien con el fijador PLP. Un ejemplo notorio es el anticuerpo que reconoce el factor de transcripción en bruto (Ro). Rough se expresa dentro de y es necesario para la especificación de un subconjunto de desarrollo de los fotorreceptores 35. El anticuerpo anti-Ro funciona mejor, no con PLP, sino más bien con un TUBOS - EGTA - MgSO4 (PEM) bUffer 36. Del mismo modo, otros anticuerpos pueden trabajar mejor sobre los tejidos que han sido incubadas en todavía otros fijadores. Se sugiere que, a menos que se indique lo contrario, el fijador PLP debe probarse primero. Si no tiene éxito, entonces el proceso de búsqueda de un fijador alternativo debe comenzar.
Una cuestión común para enfrentar es la concentración de trabajo del anticuerpo en cuestión. Muchas veces usted puede ser el primer investigador en utilizar un anticuerpo particular para detectar las proteínas en el tejido de interés. La concentración de trabajo puede desviarse de lo que se informa por otros tejidos. Se sugiere que la concentración recomendada probarse primero. Aumentar la concentración del anticuerpo si una señal no puede ser visto. Por otro lado, si la concentración recomendada da alta tinción de fondo y luego diluyendo el anticuerpo debe ser juzgado. Concentraciones de trabajo entre los anticuerpos pueden variar. Por ejemplo, el contra-Eyes Ausente (Eya) de anticuerpo se diluye 1: 5, mientras que el anti-Anticuerpo Elav funciona bien incluso a una dilución 1: 500. Algunos anticuerpos incluso pueden diluirse tan abajo como 1: 3000. Además, este procedimiento, como está escrito, funciona mejor con anticuerpos de alta especificidad. Sin embargo, como muchos lo han experimentado, algunos anticuerpos pueden unirse de forma no específica para el tejido y esto puede crear una imagen óptima. Esta situación puede ser corregida a menudo incubando el anticuerpo diluido con embriones fijos o cadáveres de larvas antes de ser añadidos a los discos imaginales fijos. Dependiendo del nivel de tinción de fondo no específica, la longitud requerida de "pre-absorción" puede variar y tendrá que ser elaborado a modo de prueba. También es posible aumentar la relación señal / ruido mediante la reutilización de anticuerpos varias veces o mediante la realización de varias rondas de pre-absorción.
Al decidir sobre qué discos se deben utilizar en publicaciones y / o presentaciones, lo mejor es elegir los discos que han sido orientados con el lado apical orientado a salas. También es mejor usar discos que no se pliegan. Esto es particularmente cierto del disco de ojos antenal. El lado ventral del disco tiende a doblar y por desgracia, hay poco puede hacer para evitar que esto suceda. Una solución es diseccionar discos más pequeños ya que estos tienden a doblar mucho menos. Otra opción es simplemente diseccionar un gran número de discos hasta que consigue uno que es completamente plana. La forma general del disco de ojos antenal puede verse afectada por la velocidad a la que la larva se desgarra. Si uno tira la larva aparte demasiado rápidamente el agujero a través del cual pasa el complejo cerebro-disco es pequeño y el disco de ojos antenal sale doblado y / o estirado. Lo mejor es tirar lentamente hasta que la larva comienza a rasgar ya que el agujero será mayor. A continuación, puede continuar tirando del complejo disco-ojo-cerebro antenal lentamente. Tenga en cuenta que nunca se puede tirar con demasiada lentitud. También tenga en cuenta, que la velocidad a la que se desgarra el tejido no es un factor en el aislamiento de otros tejidos.
ve_content "> El ciclo de vida de Drosophila se compone de tres fases larvarias. eventos de desarrollo importantes tienen lugar durante cada una de estas fases, por lo que puede ser importante para aislar los tejidos no sólo procedentes de terceros estadios larvales (que es el foco principal de este procedimiento) sino también de la primera y segunda larval estadios también. Con una pequeña excepción, este procedimiento se puede utilizar, como está escrito, para aislar los discos de segundo instar. Durante la parte de la disección fina del procedimiento (artículo 4), se recomienda que el tungsteno afilada alambre debe ser utilizado para separar el disco de ojos antenal de tejido extraño como las glándulas ganchos de la boca, el cerebro y salivales. El alambre de tungsteno también se puede utilizar para separar los discos T2 / T3 pierna, alas y Haltère unos de otros y la cutícula suprayacente . Se recomienda que un extremo del alambre de tungsteno (el extremo que se utiliza para separar los tejidos) afilarse por calentamiento en un baño de nitrato de sodio hirviendo El otro extremo puede ser insertado en un tornillo de banco pasador;. ªes le permitirá mantener el alambre de tungsteno con mayor facilidad. Por desgracia, es mucho más difícil de aislar discos intactos primera fase larval, por lo tanto, se recomienda que coloque el CD entero / cerebro / boca complejo gancho ojo antenal en el portaobjetos y colocar un cubreobjetos. La cantidad de tejido diseccionado puede ser minimizado mediante el uso de un alambre de tungsteno afilado para quitar las glándulas salivales y que recubre la cutícula antes de montar el complejo de gancho de disco / cerebro / boca sobre el portaobjetos. Es relativamente fácil para identificar el primer disco de ojos antenal estadio cuando todavía está unido a los ganchos del cerebro y de la boca (véase la Figura 6A, D de Kumar y Moses, 2001) 37. Los otros discos imaginales tendrán que ser separado de la cutícula y se coloca en un portaobjetos para su visualización.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Donald Ready y Kevin Moisés para enseñar JPK el procedimiento de disección disco imaginal originales. También queremos agradecer a Bonnie Weasner para el disco genital en la Figura 1B y el ojo de disco en la Figura 2A, Brandon Weasner para la Figura 3, el Stock Center Bloomington Drosophila para las manchas de moscas y el Banco hibridoma Estudios del Desarrollo de anticuerpos. CMS ha sido apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), el Frank W. Putnam Becas de Investigación, y el Robert Briggs Beca de Investigación. JPK es apoyado por una subvención del Instituto Nacional del Ojo (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
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