Abstract
Ein wesentlicher Teil der Post-embryonalen Entwicklung in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, findet innerhalb einer Reihe von sackartigen Strukturen genannt Imaginalscheiben. Diese Scheiben führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in die erwachsene Fliege zu finden sind. Hier haben wir ein Protokoll, das so optimiert wurde, um diese Scheiben zu erholen und bereiten sie für die Analyse mit Antikörpern, Transkriptions Reporter und Protein-Traps zu beschreiben. Dieses Verfahren ist am besten für dünne Gewebe wie Imaginalscheiben geeignet, kann aber leicht für die Verwendung mit dicker Gewebe modifiziert werden, wie die Larven und erwachsene Gehirn Eierstock. Die schriftliche Protokoll und begleitende Video den Leser / Betrachter durch die Zerlegung des dritten Larvenstadium, Fixierung von Gewebe, und die Behandlung von Imaginalscheiben mit Antikörpern führen. Das Protokoll kann verwendet werden, um Imaginalscheiben von jüngeren ersten und zweiten Larvenstadium sowie sezieren werden. Der Vorteil dieses Protokolls ist, daß sie relativ kurz ist, und es hat seinen für die hohe Qualität Erhaltung der sezierten Gewebe optimiert. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Fixierung Verfahren, das eingesetzt wird, funktioniert gut mit der überwiegenden Anzahl von Antikörpern, die Drosophila-Proteine zu erkennen. Nach unserer Erfahrung gibt es eine sehr kleine Anzahl von empfindlichen Antikörper, die nicht gut mit diesem Verfahren arbeiten. In diesen Situationen wird das Heilmittel zu sein, um eine alternative Fixierung Cocktail nutzen und dabei die Richtlinien, die wir weiter für die Dissektion Schritte und Antikörperinkubationen haben zu folgen.
Introduction
Seit mehr als einem Jahrhundert die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist einer der führenden System-Entwicklung, Verhalten und Physiologie zu studieren. Embryonalen und post-embryonale mit viel der letzteren stattfindet in Mono Epithelien genannt Imaginalscheiben 1-3: Entwicklung in der Fliege können in zwei große Phasen unterteilt werden. Zeichnungen von Imaginalscheiben wurden erstmals im Jahre 1864 von August Weismann als Teil seines breiten Monographie über Insektenentwicklung 1 veröffentlicht. Diese Scheiben ihrer Entwicklung beginnen während der Embryogenese, werden während der Larvenstadien gemustert, überleben die massiven Histolyse der frühen Puppenstadien und schließlich führen zu einem hohen Prozentsatz der erwachsenen Strukturen, die in der Erwachsenen gefunden werden fliegen 1-14. Während Larvenentwicklung jede Scheibe macht mehrere kritische Entscheidungen in Bezug auf das Schicksal, Form und Größe. Innerhalb der ersten und zweiten Larvenstadien werden die Discs mit der Annahme einer primären Schicksal beauftragt, establisHing Fach Grenzen, die Annahme der richtigen Form und die Erzeugung der erforderlichen Anzahl von Zellen 15-16. Während des dritten Larvenstadium und frühen Pre-Puppenstadium, die Imaginalscheiben weiter teilen und strukturiert, wie Zellen ihre Schicksale Terminal 16 erlassen.
Während der frühen Geschichte der Drosophila Entwicklungsbiologie, wurden fast ausschließlich Imaginalscheiben im Rahmen der normalen Entwicklung und in den wenigen Fällen, in denen ein Verlust oder Gewinn-of-function-Mutante lebensfähig war sucht. Die Verwendung von Röntgenstrahlen zu veran mitotische Rekombination zur letalen Mutationen erlaubt, in Zellklone in den Larven und erwachsenen Geweben analysiert werden. Dieses Verfahren wurde durch die Einführung von transgenen Verfahren verbessert worden, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function Mutationen sowohl Larven und adulten Geweben. Die Anzahl der Antikörper, Transkriptions Reporter und Protein-Traps für die Beschreibung der molekularen Landschaft von Wildtyp und Mutante Gewebe ist auch constantly wächst. Mit Hilfe dieser molekularen Marker, um den Verlust zu analysieren und gain-of-function-Mutante Zellklone hat es immer möglich, eine Echtzeit-Verständnis, wie mutierten Zellen während der Entwicklung von ihren Wildtyp abweichen Vettern zu gewinnen. Um richtig nutzen diese Werkzeuge und Reagenzien ist es wichtig, qualitativ hochwertige Präparate von Imaginalscheiben, die angezeigt werden können, fotografiert und analysiert haben. Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Isolierung und Herstellung der augenAntennenScheibe Komplex (Figur 1A) zu liefern. Es kann auch erfolgreich verwendet, um eine Vielzahl von zusätzlichen Scheiben einschließlich derjenigen, die zu den Flügeln halteres, T1-T3 Beine und die Genitalien (1B-E) erhalten wird, zu isolieren. Dieses Verfahren, mit geringfügigen Modifikationen, wurde verwendet, um Imaginalscheiben von Drosophila für fast 80 Jahre zu isolieren.
Wie oben beschrieben, da die meisten Gene während mu exprimiertltiple Entwicklungsstufen und in einer Vielzahl von Geweben, ist es oft nicht möglich, die Effekte zu untersuchen, dass Null-Mutanten wurden auf der gesamten Augen das Tier stirbt, und vor dem dritten Larvenstadium Larvenstadium. Vier Methoden wurden die Untersuchung weiter entwickelten Geweben wie der Retina wesentlich leichter handhabbar gemacht. Die erste ist die Flippase (FLP) / Flippase Rekombination Target (FRT) Verfahren zur Erzeugung von Mutanten-Zellklone in einem ansonsten Wildtyp-Gewebe 17-19. In diesem Fall wird das mutierte Gewebe wird durch das Fehlen einer visuellen Markierung, wie Green Fluorescent Protein (GFP) identifiziert und an die umliegenden Wildtyp-Gewebe, in dem GFP vorhanden ist (2D) verglichen werden. Das zweite ist das "FLP-out"-Methode, in der ein Transgen in einer Population von Zellen 20 ausgedrückt. In diesem Fall sind die Zellklone werden durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und auf die umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Reporter fehlt (Abbildung Vergleich2E). Die dritte ist die Mosaik-Analyse mit einem Reprimierbare Zellmarker (MARCM)-Technik, die Elemente des FLP / FRT-Mutante Klon und FLP-out-Expressionssysteme 21 verbindet. Mit diesem Verfahren wird ein Transgen in einer Population von Zellen, die gleichzeitig für einen einzelnen mutierten genetischen Locus exprimiert werden. Wie FLP-out-Klone sind Klone MARCM durch die Anwesenheit von GFP identifiziert und im Vergleich zu den umliegenden Wildtyp-Gewebe, das die GFP-Markierung (2F) fehlt. Und schließlich können die Gene und RNAi-Konstrukten in imaginal Gewebe unter der Kontrolle spezifischer Promotor GAL4-Konstrukten exprimiert werden. Diese vier Methoden haben das Interesse an einem Studium Imaginalscheiben seit Mutante oder Überexpression Klone oder Muster können direkt miteinander verglichen werden, um benachbarte Wildtyp-Gewebe erhöht. Die in diesem Verfahren beschriebenen Methode wurde so entwickelt, dass Forscher, die die post-embryonale Entwicklung von adulten Geweben in Drosophila zu untersuchen,insbesondere aus dem Blickantennenscheibe stammen, werden in der Lage, qualitativ hochwertige Gewebe für die Analyse zu erhalten. Obwohl einzelne Forscher haben leichte Modifikationen vorgenommen, hat der Kern dieses Verfahrens (die wir hier beschreiben) weitgehend unverändert geblieben. Seit Erlangung hochwertigen Gewebe ist entscheidend, um das Studium der Imaginalscheiben wir hoffen, dass dieses Protokoll geschrieben und dazugehörige Video wird als wertvolles Lehrmittel dienen.
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Protocol
1. Herstellung von Larven
- Füllen Sie eine 35 mm Petrischale mit Dissektion Puffer.
- Zeigen Larven in Petrischale und es ihnen ermöglichen, um für ein paar Minuten (Selbstreinigungsschritt) zu schwimmen.
- Übertragen Larven zu einem Pool von Präparation Puffer auf Silikonbasis Schneideplatte. Dieser Pool ist an einer Kante der Platte ist. Die Schneideplatte aus einer Silikonlösung, die gegossen wurde und in einer Glaspetrischale ausgehärtet.
- Mit einer Pasteurpipette, legen Sie einen größeren Pool von Dissektion Puffer in der Mitte der Platte Dissektion.
- Mit # 5 Zangen, übertragen eine einzelne gereinigt Larve aus dem kleinen Pool in den größeren Pool von Dissektion Puffer.
2. Grob Dissektion der Larven
- Während die Larve noch im großen Pool von Dissektion Puffer umklammern die Larve mit der Zange. Eine Pinzette sollte verwendet werden, um die Mundhaken greifen werden, während das andere Paar der Pinzette wird die anim haltenal noch (greifen die Larve sanft 03.01 Körperlänge).
- Hold Steady die Zange, die die Oberhaut in der Nähe der Mundhaken, während schnell Ziehen der Rest des Körpers weg mit dem zweiten Paar der Pinzette.
- Wenn die Larve beginnt zu zerreißen Sie eine leichte Freisetzung in Spannung zu spüren. Lassen Sie die Larve aus der Zange und damit für die "Innereien" der Larve zu verschütten. Dies ermöglicht die Imaginalscheiben in ihre normale Konformation bleiben und verhindert, dass sie verformt wird.
- Mit einer Pinzette fassen die Mundhaken wieder auf das vordere Ende der Larve in Position zu halten. Mit der anderen Pinzette entfernen Sie die unteren zwei Drittel der Larven einschließlich der inneren Mut. Hinweis: ein Komplex der Mundhaken, die Augenantennenscheiben, Gehirnhälften, ventralen Ganglion, die Speicheldrüsen, einige Discs mit Bein, und die darüber liegende Oberhaut wird bleiben.
- Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen darüberliegenden Oberhaut, der Speicheldrüsen, Beinscheiben undandere Gewebe. Hinweis: nur Gewebe, die bleiben, ist die Mundhaken, Augenantennenscheiben, Gehirnhälften sollte, und ventralen Ganglion (Abbildung 3).
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.5 mit zusätzlichen Larven für 15-20 min. Hinweis: Imaginalscheiben in Präparation Puffer für längere Zeit bleiben neigen zum Abbau und letztendlich als weniger ideal Proben fotografiert werden angezeigt. So, nach maximal 20 min alle seziert Gewebe sollte der PLP Fixiermittel übertragen werden (siehe unten).
3. Fixierung und Färbung von Gewebe mit Antikörper
- Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe auf ein Uhrglas mit kaltem Paraformaldehyd-Lysin-Periodatoxidation (PLP) Fixiermittel. Limit Volumen der übertragenen Dissektion Puffer zu 50 ul der Verdünnung von PLP zu minimieren. Achten Sie darauf, die Spitze mit einer Rasierklinge geschnitten, so dass die Spitze Öffnung groß genug, um die Gewebe seziert aufzunehmen. Verwendung einer Pinzette odereine Wolfram-Nadel sicherzustellen, dass die sezierten Gewebe völlig in Ordnung für die richtige Fixierung auftreten getaucht. Inkubieren seziert Gewebe in kaltem PLP Fixiermittel für 45 min. Diese Inkubation Ort bei RT ohne Rühren erfolgen.
- Mit Hilfe eines P-200 Pipetman, übertragen Sie die sezierten Gewebe Puffer waschen (RT) mit einem anderen geschnitten gelben Spitze für 45 min. Grenze Volumen übertragen PLP zu 50 ul der Verdünnung des Waschpuffers zu minimieren. Hinweis: Alle seziert Gewebe sollte vollständig eingetaucht werden.
- Übertragen 20-30 Sätze von seziert Gewebe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Hinweis: Wenn eine größere Anzahl von Blickantennenscheibe Komplexe werden im Rohr kombiniert werden, gibt es eine Möglichkeit, dass das Gewebe an der Unterseite des Rohres nicht richtig an die Antikörper ausgesetzt werden. Für optimale Ergebnisse sollte nicht mehr als 20-30 Augenantennenscheibe Komplexe in einem einzigen Rohr vorhanden sein. Die sezierten Gewebe werden auf dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu regeln. Daher wird in den nachfolgenden Schritten uSE Pipetman zu entfernen und zu ersetzen Waschpuffer, Blocklösung und Antikörper.
- Waschpuffer zu entfernen und ersetzen mit 100 l Blocking-Lösung: 10% normalem Ziegenserum in Waschpuffer. Inkubation bei RT unter leichtem Drehen auf einer Tischdreheinrichtung für 10 min.
- Blockierlösung entfernen und ersetzen mit 100 ul primären Antikörper, die entsprechend in 10% normalem Ziegenserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 16 Stunden.
- Primären Antikörper zu entfernen und ersetzen mit 750 ul Waschpuffer. Die Röhrchen auf einem Kolbenpendel und lassen bei RT für 10 min nutieren. Hinweis: Der primäre Antikörper kann (Lagerung bei 4 ° C) gespeichert und später wiederverwendet werden. Wiederverwendung von Antikörpern mehrere Male bei der Verringerung der nicht-spezifischen Bindung zu helfen.
- Ermöglichen, sich an die Unterseite des Rohres absetzen, dann entfernen Waschpuffer und 100 l Sekundärantikörper, die entsprechend in 10% Normalserum verdünnt worden. Inkubation bei RT mit sanften Dreh für 2̵1, 4 Stunden.
- Entfernen Sekundärantikörperlösungen aus Gewebe und ersetzen mit 500 ul Waschpuffer. Gewebe ermöglichen, auf den Boden des Röhrchens zu begleichen.
- Mit Hilfe eines P-200 und einen Schnitt gelber Spitze, übertragen alle Gewebe seziert, um einen Pool von Waschpuffer, die auf dem Seziertisch Schale gelegt wurde. Während mit dem nächsten Schritt der Fein Dissektion fortfahren, wird das Gewebe in der Waschpuffer inkubiert. Dies hilft, überschüssige Sekundärantikörper zu entfernen.
4. Fein Dissektion der Eye-Antennallobus Disc-Komplexe und Montage auf Folien
- Verwenden Sie eine Pinzette, um die Nagelhaut von den Mundhaken mit der Bauchseite des Komplexes nach unten falten. Mit einer zweiten Pinzette entfernen Sie die beiden Hirnlappen durch Schließen der zweiten Pinzette in den Raum zwischen dem Gehirn und Auge-Discs (Bild 3, roter Pfeil) und schnell zieht das Gehirn weg von den Mundhaken.
- Während Sie auf die Mundhaken halten, kneifen Siedas Gewebe so nahe wie möglich an der Verbindung zwischen dem Antennenteil des Blickantennenscheibe und den Mund Haken (3, blauer Pfeil). Hinweis: Die Augenantennenscheibe Komplexe sollte frei von allen Geweben (Abbildung 1A) sein. Fortfahren, bis alle gewünschten gewünschte Gewebe, die auf Objektträger platziert werden können wurde seziert. Dieses Protokoll kann angepasst an Flügel, Haltere, Bein-und Genital Imaginalscheiben (Abbildung 1B-E) zu isolieren.
- Fügen Sie zwei kleine Stücke von Tissue-Papier (Größe der Deckgläser) in ca. 3. Auseinander auf dem Seziertisch Gericht. Ein Glasobjektträger, auf dem Teller - die zwei Stücke von Tissue-Papier soll unter den Enden des Schiebers sein. Dies wird die Folie vom Kleben an der Silikonbasis der Seziersaal Gericht zu verhindern.
- Verwendung eines P-20 mit einem ungeschnittenen Spitze hinzuzufügen 9 ul eines Anti-Bleichmittels zu der Mitte der Glasobjektträger. Dies verhindert, dass Bleichen der Gewebe, wenn mit fluoreszierenden angesehenLicht.
- Mit der gleichen uncut Spitze, sammeln alle Augenantennenscheiben und fügen Sie sie der Tropfen Anti-Bleichmittel. Minimieren Sie die Anzahl der Waschpuffer, die über durchgeführt wird. Versuchen, die Menge an Waschpuffer auf 10 ul oder weniger zu begrenzen.
- Verwenden Sie eine Pinzette zu trennen und verteilen Sie die Augenantennenscheiben innerhalb des Tropfens von Anti-Bleichmittel. Lassen Sie Discs in der Anti-Bleichmittel für einige Minuten inkubiert. Hinweis: Scheiben wird sich klar, wie das Gewebe absorbiert die Anti-Bleichmittel.
- Mit einem feinen Pinsel vorsichtig senken einen Deckglas auf die Probe. Dies verhindert die Bildung von Luftblasen.
- Objektträger bei -20 ° C bis bereit, die Auge-anten oder andere Imaginalscheiben mit Hilfe von Licht oder Fluoreszenzmikroskopie zu sehen.
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Representative Results
Die Methode, die oben beschrieben ist zuverlässig produziert hochwertige Material für die Analyse mit In-situ-Sonden, Transkriptions Reportern, Protein-Traps und Antikörper. In Abbildung 1 zeigen wir Augen Antenne, genital, Flügel, Haltere und Beinscheiben, die routinemäßig mit diesem Verfahren gewonnen werden. Diese Scheiben sind mit einer Phalloidin-konjugierten Fluorophor, die F-Aktin bindet und daher beschreibt jede Zelle behandelt. Wenn das Gewebe richtig dann die morphogenetischen Furche des Auges Disc festgelegt worden ist, die Ränder der konzentrischen Falten Gewebe im Genital, anten und Beinscheiben und die Rücken-ventralen Achse der Flügel und Haltere Scheiben werden alle erscheinen als scharfe Kanten . Wenn ein Gewebe richtig dann fixiert Antikörper, fluoreszierenden Proteinen und In-situ-Sonden wird sich auch zeigen scharfe Mustern. Einige Beispiele sind in Abbildung 2 dargestellt. Die oberen drei Platten Anzeigescheiben, die mit verschiedenen Antikörpern, während die gefärbt wurdenunteren drei Tafeln zeigen Scheiben, in denen GFP wird verwendet, um Populationen von Zellen zu markieren.
Eines der auffallendsten Merkmale der Augenantennenscheibe ist die morphogenetischen Furche (1A), das als eine Vertiefung im Gewebe entlang der dorsalen-ventralen Achse 1, 22 laufen zu sehen ist. Vor dem dritten Larvenstadium alle Zellen innerhalb die Entwicklungs Auge ungemusterten, undifferenzierten und morphologisch nicht voneinander. Zu Beginn des dritten Larvenstadium initiiert der morphogenetischen Furche am hinteren Rand der Augenfeld und schreitet nach vorn auf das Auge / anten Grenze 22. Da die Furchen schreitet über den Augenfeld das Meer von ungeordneten Zellen in einer geordneten Anordnung von regelmäßig beabstandeten Einheit Augen oder Ommatidia (1A) 22-23 transformiert. Im Vorfeld der Furche ein Gen regulatorische Netzwerk, das Pax6-Homolog Eyeless (Ey) enthält Kanäle Zellenin Richtung einer Augen Schicksal (2A) 15. Die Initiierung und Progression der Furche selbst ist abhängig von den Aktivitäten der Hedgehog (hh) und Decapentaplegic (DPP)-Signalwege 24-29. In der Tat ein dpp-lacZ Reporter spiegelt den authentischen Ausdruck des dpp-Locus in der Furche (2B) 30-31. Als Zellen verlassen die Furche und beginnen, ihre Schicksale Terminal anzunehmen, drücken sie die zellspezifische Marker wie embryonale tödliche Sehstörungen (elav), die eine pan-neuronalen RNA-bindende Protein (Abbildung 2C) 32-34 kodiert.
Abbildung 1. Die Imaginalscheiben von Drosophila melanogaster. (
Abbildung 2. Geklonte und Expressionsanalyse des Auges Imaginalscheibe (A - F). Konfokale Bilder von Augen Imaginalscheiben. (A) Die Pax6 Protein Eyeless (Ey) ist breit vor der morphogenetischen Furche verteilt. (B) A dpp-lacZ Transkriptions ReporteR antwortet auf das Hh-Signal und wird in der morphogenetischen Furche ausgedrückt. (C) Das pan-neuronalen RNA-bindendes Protein Elav wird in allen Entwicklungsphotorezeptoren hinter der morphogenetischen Furche verteilt. (D) Eine Augen Disc mit Verlust-Funktion Klone durch die FLP / FRT-System erzeugt. Die Klone werden durch das Fehlen von GFP (E) identifiziert. Ein Augen Disc mit Überexpressionsklone mit dem FLP-out-System erzeugt. Klone werden positiv mit GFP markiert. (F) Ein Auge Disc mit MARCM Klonen. Wie die FLP-out-System, können die Klone durch MARCM Gegenwart von GFP identifiziert werden. Alle erkannten Proteine und Genotypen sind in der Abbildung aufgeführt. Vorder ist nach rechts und dorsal liegt.
Abbildung 3. Eye-Antenne-Hirn-Komplex. Ein schEmagic Zeichnung der erste Tag groben Dissektion Produkte. Die Gewebe, die nur festgelegt werden sollten, sind die Mundhaken, Augen-Antenne Scheiben und Gehirn (oft das ventrale Ganglion wird auch verbunden bleiben - nicht gezeigt). Lila = Gehirn, grün = Augenantennenscheiben, braun = Mundhaken. Vorder ist rechts. Wenn Sezieren Bein, Flügel, Haltere und Genitalscheiben, sollte die äußere Schuppenschicht der Larve noch zu dieser Gewebe befestigt werden. Sie die darüber liegende Oberhaut nicht entfernen, wie Sie vielleicht die Imaginalscheiben bei der späteren Überweisungen durch verschiedene Antikörper, Block-und Waschlösungen zu verlieren. Das überschüssige Gewebe kann während der feinen Sezierung Schritte (4.1-4.2) entfernt werden.
Abbildung 4. Position der Imaginalscheiben in der Drosophila-Larve. Ein Schematic Zeichnung der relativen Position der Augen-Antennen-, Bein-, flügel, Haltere und Genitalscheiben innerhalb eines dritten Larvenstadium. Das Auge-Antennenscheibe ist grün gefärbt, sind die Beinscheiben in blau, ist die Scheibe in lila Halfter, ist der Flügelscheibe in braun / orange und der Genitalscheibe ist in hellbraun. Vorder ist rechts.
| Name der Lösung |
| 8% Paraformaldehyd |
| 0,2 M Natriumdihydrogenphosphat |
| 0,2 M Natriumphosphat Disbasic |
| 1 N Natronlauge |
| 10% Triton |
| 0,1 M Natriumphosphat-Puffer (Buffer Dissection) |
| 0,1 M Natriumphosphat-Puffer + 0,1% Triton (Waschpuffer) |
| Lysin Buffer |
| 2% Paraformaldehyd-Lysin-Periodatoxidation Fixativ (PLP) |
| 10% normalem Ziegenserum |
Tabelle 1: Liste der benötigten Lösungen.
| 8% Paraformaldehyd Stammlösung |
| In ein 50-ml-Erlenmeyerkolben den folgenden: |
| 2,0 g Paraformaldehyd |
| 23,0 ml destilliertes Wasser |
| 4.0 Tropfen einer 1 N Natriumhydroxid (aus einer Glaspasteurpipette) |
| Mischen und Hitze auf einer Rührplatte, bis die Lösung einen schwachen Sieden erreicht |
| Lassen Sie sanft kochen, bis Para vollständig gelöst |
| Auf Eis, bis kalt (frisch machen vor jedem Dissektion) |
| 0,1 M Phosphatpuffer (Dissektion (P) Puffer) |
| Zu einem 50 ml konischen Röhrchen fügen Sie den folgenden: |
| 18,0 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat |
| 7,0 ml 0,2 M Natriumdihydrogenphosphat |
| 25,0 ml destilliertem Wasser |
| Lagerung bei 4 ° C (1 Woche Haltbarkeit) |
| 0,1 M Phosphat + Detergenspuffer (Wash (W)-Puffer) |
| Zu einer 50ml konischen Röhrchen fügen Sie den folgenden: |
| 18,0 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat |
| 7,0 ml 0,2 M Natriumdihydrogenphosphat |
| 25,0 ml destilliertem Wasser |
| 0,5 ml 10% Triton |
| Shop bei RT (1 Woche Haltbarkeit) |
| Lysin (L) Puffer |
| Zu einem 50 ml konischen Röhrchen fügen Sie den folgenden: |
| 0,4 g Lysin |
| 1,2 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat |
| 8,0 ml Dissection (P) Puffer |
| 10,0 ml destilliertem Wasser |
| Schütteln Lösung, bis Lysin vollständig gelöst |
| Auf Eis, bis kalt (frisch machen vor jedem Dissektion) |
| 2% Paraformaldehyd - Lysin - Periodatoxidation (PLP) Fixiermittel |
| 0,1 g Natriumperiodat |
| 15,0 ml Lysin (L)-Puffer |
| 5,0 ml 8% Paraformaldehyd |
| Schütteln Lösung gut, bis Natriumperiodat vollständig gelöst |
| Auf Eis, bis kalt (frisch machen vor jedem Dissektion) |
Tabelle 2: Rezepte für Pflicht Solutions.
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Discussion
Obgleich dieses Verfahren weitgehend auf die Isolierung und nachfolgende Behandlung von Augenantennenscheiben konzentriert, ist es zugänglich ist zur Isolierung und Analyse des Flügels Haltere, Bein-und Genitalscheiben (4). Die einzige erforderliche Änderung des Protokolls zur Isolierung dieser Scheiben (im Gegensatz zum Auge-Antennenscheibe) ist die Methode der Grob Dissektion (Abschnitt 2 des Protokolls). Die ersten Brustbein (T1) Paar wird an der vorderen der Larve gefunden und kann durch das Protokoll für die folgenden Augenantennenscheibe Isolation zurückgewonnen werden. Doch die zweite Brustbein (T2)-Discs sind mit der Nagelhaut befestigt. Um diese Scheiben einer Pinzette sollte verwendet werden, um die Mundhaken halten isolieren (wie oben beschrieben), während ein anderer Pinzette sollte verwendet werden, um die ventrale Kutikula des Tieres umklammern werden (stellen Sie sicher, dass die Larve etwa ein Drittel von der Spange Mundhaken. Die Larve kann einfach durch Aufreißen der ventralen Kutikula weg vom Rest der LAR werden filetierenva. Die T2 Beine werden in die Nagelhaut befestigt bleiben. Der dritte Brust (T3) Schenkel mit dem Flügel und Haltere Scheiben als Teil eines Komplexes, der sich auch auf der Oberhaut befestigt angebracht ist. Sie können wählen, um die Disc-Komplex und die T2-Beine von der Nagelhaut zu diesem Zeitpunkt bei der Fein Dissektion Teil des Verfahrens zu trennen oder halten Sie die Nagelhaut-Disc-Komplex zusammen während der anschließenden Fixierung / Antikörper-Inkubation Schritte und die Scheiben isolieren (Abschnitt 4) . Zur Rückgewinnung von Genitalscheiben, ist es am besten, um die Larven zu Mittelteil mit einer Pinzette fassen und dann schälen die ventrale Kutikula mit der anderen Zange ab dem Mittelteil und endet am hinteren Ende der Larve. Es wird empfohlen, Zangen verwendet werden, um wegzuräumen alle Fremdgewebe und übertragen nur die Genital Scheibe an der Fixierungslösung unter Verwendung eines P-200 Pipetman und eine gelbe Spitze, dessen Ende mit einer Rasierklinge geschnitten werden.
Dieses Verfahren ist am besten für TISSUES geringer Dicke wie Imaginalscheiben und funktioniert am besten, wenn die Antikörper, die verwendet werden, sind von hohem Titer und Spezifität. Es kann jedoch angepasst, um auch mit dickeren Geweben wie der erwachsenen Eierstock, Hoden und Gehirn als auch mit niedrigem Titer von Antikörpern oder die, die höher als gewünscht "Hintergrund"-Färbung geben zu arbeiten. Bei der Arbeit mit dickeren Gewebe, wird vorgeschlagen, daß optimale Ergebnisse durch einfache Erhöhung der Konzentration von Paraformaldehyd und / oder Inkubieren der PLP Fixiermittel für längere Zeiträume erhalten werden. Da die richtige Fixierung seziert Gewebe ist wesentlich für den Erfolg mit diesem Protokoll wird auch vorgeschlagen, dass der Wirkungsgrad der Steigerung der Konzentration von Paraformaldehyd und / oder die Erhöhung der Befestigungslänge mit Phalloidin (1) bewertet werden. Insbesondere sollten Sie genau auf die "Schärfe" der Zelle Konturen und andere physikalische Sehenswürdigkeiten innerhalb des Gewebes bezahlt werden (dh die morphogenetic Furche). Ein weiterer Weg, um sicherzustellen, dass Ihr Gewebe (besonders dicker Proben) ist richtig befestigt ist, die 8% Paraformaldehyd und PLP-Lösungen frisch vor jeder Präparation vorzubereiten. Und schließlich die Gesamtqualität der Dissektion kann erhöht werden, wenn Gewebe für kurze Zeitabschnitte zerlegt und das Gewebe wird in Fixiermittel so schnell wie möglich übertragen werden. Es wird vorgeschlagen, dass Sezieren nicht länger als 15-20 min. Sezieren für kürzere Laufzeiten erhöht die Qualität der Gewebeerhaltung.
Dieses Protokoll arbeitet gut mit einer Vielzahl von Antikörpern, aber es ist wahr, dass einige Antikörper nicht gut mit der PLP Fixiermittel zu arbeiten. Ein berüchtigtes Beispiel ist der Antikörper, die das Grobe (Ro) Transkriptionsfaktor erkennt. Grob innerhalb ausgedrückt und ist für die Festlegung einer Untergruppe von Photorezeptoren entwickelt 35 erforderlich. Die Anti-Ro-Antikörper am besten funktioniert, nicht mit PLP, sondern mit einem PIPES - EGTA - MgSO 4 (PEM) bUffer 36. Ebenso können andere Antikörper am besten auf Gewebe, die in noch anderen Fixierungs inkubiert wurden zu arbeiten. Es wird vorgeschlagen, dass, wenn nicht anders angegeben, sollten die PLP Fixierungs zuerst versucht werden. Wenn nicht erfolgreich, dann der Prozess der Suche nach einer alternativen Fixiermittel beginnen soll.
Ein häufiges Problem zu konfrontieren, ist die Arbeiter Konzentration des Antikörpers in Frage. Oft können Sie der erste Forscher, um einen bestimmten Antikörper zu verwenden, um Proteine in Ihrem Gewebe von Interesse zu erkennen. Die Arbeitskonzentration kann von dem, was für andere Gewebe berichtet abweichen. Es wird vorgeschlagen, dass die empfohlene Konzentration zuerst versucht werden. Erhöhung der Konzentration des Antikörpers, wenn ein Signal nicht gesehen werden kann. Auf der anderen Seite, wenn die empfohlene Konzentration ergibt eine hohe Hintergrundfärbung dann Verdünnen der Antikörper sollte versucht werden. Arbeitskonzentrationen unter Antikörper können variieren. Beispielsweise wird das Anti Augen fehlt (Eya) Antikörper 1: 5 verdünnt, während die AntiElav Antikörper funktioniert gut, selbst bei einer 1: 500 Verdünnung. 3000: Einige Antikörper können auch so weit unten wie 1 verdünnt werden. Außerdem ist diese Vorgehensweise, wie geschrieben, funktioniert am besten mit hoher Spezifität Antikörper. Da viele erfahrene Einige Antikörper können nicht-spezifisch an das Gewebe zu binden, und dies kann eine suboptimale Bild zu erstellen. Dies kann oft durch Inkubation des verdünnten Antikörpers mit festen Embryonen oder Larven Karkassen, bevor sie an den festen Imaginalscheiben hinzugefügt korrigiert werden. Abhängig von der Höhe der nicht-spezifischen Hintergrundfärbung, kann die erforderliche Länge der "pre-Absorption" variieren und muss auf einer Versuchsbasis gearbeitet werden. Es ist auch möglich, das Signal / Rausch-Verhältnis durch die Wiederverwendung von Antikörpern mehrere Male oder durch Durchführung mehrerer Runden der vorge Absorption zu erhöhen.
Bei der Entscheidung, auf die Scheiben sollte in Publikationen und / oder Präsentationen genutzt werden kann, ist es am besten, Discs, die mit der apikalen Seite bis orientiert wurden, wählen Stationen. Es ist auch am besten, Discs, die nicht gefaltet werden, zu verwenden. Dies gilt vor allem für das Auge-Antennenscheibe. Die ventrale Seite der Platte dazu neigt, zu falten und leider wenig man tun kann, um dies zu verhindern. Eine Lösung ist die jüngere Scheiben zu zerlegen, da diese dazu neigen, sich zu falten weit weniger. Eine andere Möglichkeit ist, einfach zu zerlegen große Anzahl von Scheiben, bis Sie einen völlig flach ist zu bekommen. Die Gesamtform des Auges-Antennenscheibe kann durch die Geschwindigkeit, mit der die Larve zerrissen berührt. Wenn man die Öffnung, durch die das Gehirn-Komplex spielt Scheibe zieht die Larve auseinander zu schnell klein, und die Augenantennenscheibe kommt aus gefalteten und / oder gestreckt wird. Es ist am besten, langsam ziehen, bis die Larve beginnt zu reißen, da das Loch größer. Dann können Sie weiterhin das Gehirn-Augen-Antennenscheibe komplexen langsam ziehen. Denken Sie daran, dass man nie zu langsam ziehen. Beachten Sie auch, dass die Rate, mit der Sie das Gewebe reißen ist kein Faktor bei der Isolierung von anderen Geweben.
ve_content "> Der Lebenszyklus von Drosophila besteht aus drei Larvenphasen. Wichtige Entwicklungs Ereignisse während jeder dieser Phasen stattfinden, so kann es wichtig sein, um Gewebe nicht nur aus Drittlarvenstadien zu isolieren (das ist der Schwerpunkt dieses Verfahrens ist) sondern auch von beiden ersten und zweiten Larvenstadien als auch. Mit einer kleinen Ausnahme, kann dieses Verfahren verwendet werden, wie geschrieben, auf den zweiten Larvenstadium Scheiben isolieren. Während der feinen Sezierung Teil des Verfahrens (Abschnitt 4), wird empfohlen, scharfen Wolfram Draht verwendet, um den Augenantennenscheibe von Fremdgewebe, wie die Mundhaken, Gehirn und Speicheldrüsen zu trennen. Der Wolframdraht kann auch verwendet werden, um die T2 / T3 Schenkel, Flügel und Haltere Scheiben voneinander und dem darüberliegenden Oberhaut zu trennen . Es ist zu empfehlen, dass ein Ende der Wolframdraht (das Ende, das verwendet wird, um Gewebe zu trennen wird) durch Erhitzen in einem kochenden Natriumnitrat Bad geschärft werden Das andere Ende in eine Schraubstock eingelegt werden;. thist können Sie die Wolframdraht leichter zu halten. Leider ist es erheblich schwieriger, intakt ersten Larvenstadium Scheiben isolieren, daher ist es empfehlenswert, dass Sie die gesamte Augen-anten Disc / Gehirn / Mund Haken komplexer Ort auf der Folie abdecken und mit einem Deckglas. Die Höhe der sezierten Gewebes kann mit einem scharfen Wolframdraht, um die Speicheldrüsen zu entfernen und die darüber liegenden Nagelhaut vor der Montage der Disc / Gehirn / Mund Haken Komplex auf den Objektträger minimiert werden. Es ist relativ einfach, die ersten Larvenstadium Augenantennenscheibe zu identifizieren, wenn es noch mit den Gehirn und Mund Haken befestigt (siehe Abbildung 6A, D von Kumar und Moses, 2001) 37. Die anderen Imaginalscheiben müssen von der Kutikula getrennt und auf einem Objektträger für die Anzeige gespeichert.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wir möchten Donald Ready und Kevin Moses für den Unterricht JPK die ursprüngliche Imaginalscheibe Dissektion Verfahren danken. Wir danken auch Bonnie Weasner für die Genitalscheibe in 1B und dem Auge Scheibe in 2A, Brandon Weasner für Abbildung 3 ist die Bloomington Drosophila Stock Center für Fliegen Flecken und die Entwicklungsstudien Hybridoma Bank für Antikörper. CMS wurde von einem Stipendium der National Institutes of Health (NIH) GCMS Trainings Grant (T32-GM007757), die Frank W. Putnam-Forschungsstipendium, und der Robert Briggs-Forschungsstipendium unterstützt. JPK wird durch einen Zuschuss aus dem National Eye Institute unterstützt (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
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