Introduction
लिम्फ नोड्स विदेशी और आत्म एंटीजन के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू की और समन्वय कर रहे हैं, जहां विशेष डिब्बों हैं. यहाँ प्रस्तुत प्रक्रिया लिम्फ नोड एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने और कई अणुओं की सतह अभिव्यक्ति का कहना है कि व्यवहार्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के लिए पहुँच प्राप्त करने के लिए स्वचालित यांत्रिक pipetting के साथ संयुक्त एक छोटी enzymatic पाचन वर्णन करता है.
लिम्फ नोड stromal सेल के तीन प्रमुख कार्यों लिम्फ नोड के पाड़ फार्म और पूरा: पहले वे शरीर के तरल पदार्थ एंटीजन, रोगजनकों और उनके रोगज़नक़ जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs), साथ ही साइटोकिन्स और खतरे जुड़े आणविक पैटर्न नमूने को फिल्टर (damps) वर्तमान शरीर में. दूसरा, वे बातचीत और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए प्रतिजन पेश कोशिकाओं (एपीसी) और लिम्फोसाइटों को आकर्षित करने और हिदायत; और तीसरा, वे लिम्फोसाइटों 1 की homeostasis और भेदभाव के लिए एक संरचनात्मक वातावरण प्रदान-3. सूजन लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स और chemokines उत्पादन के दौरान, वृक्ष के समान कोशिकाओं (DCs) के बीच बातचीत का आयोजन जिससे, टी, और बी कोशिकाओं में सूजन के लिए अनुकूल है. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के आर्केस्ट्रा के कारण अलग stromal सेल आबादी द्वारा गठित जटिल संरचनात्मक वास्तुकला के लिए ही संभव है.
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं CD45 नकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं और तंतुप्रसू और endothelial कोशिकाओं 1 -6 में CD31 की अभिव्यक्ति या gp38 द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता. CD31 + रक्त endothelial कोशिकाओं को परिभाषित करता है (सी) - gp38 + CD31 + लसीका endothelial कोशिकाओं (LEC), gp38 परिभाषित करता है: - Gp38 + CD31 (तंतुप्रसू जालीदार कोशिकाओं को भी एफआरसी के रूप में जाना टीआरसी) टी क्षेत्र जालीदार कोशिकाओं को परिभाषित करता है. इसके अलावा, subpopulations के लक्षण वर्णन अन्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के अस्तित्व का पता चला. दरअसल, एक छोटे pericyte की तरह सेल की आबादी के भीतर विशेषता थीgp38 - CD31 - जनसंख्या 7. इसलिए, अलगाव की प्रक्रिया का अनुकूलन अलग लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के कार्यात्मक संपत्तियों की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए फायदेमंद है.
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं पाचन के विकास से पहले लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं का अध्ययन ऊतक अनुभाग और माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीटू टिप्पणियों में सीमित था प्रोटोकॉल. फिर भी, संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की महत्वपूर्ण विशेषताओं दिखाया. लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं उच्च endothelial को लिम्फ नोड के subcapsular साइनस से लसीका और जुड़े कम आणविक जन प्रोटीन transports जो नाली प्रणाली नामक एक जटिल 3 आयामी संरचना, के लिए फार्म podoplanin, कोलेजन और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ जुड़े रहे हैं टी कोशिकाओं जोन 8 में venules. DCs स्ट्रोमा कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क में हैं और ट्यूबलर चुनाव में फैला हुआ देखा जा सकता हैDuit संरचना तरल पदार्थ का नमूना और एंटीजन 8 पता लगाने के लिए. DCs साथ लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं (TRCs और LECs) की बातचीत chemokines CCL21 और CCL19 9,10 की रिहाई और प्रस्तुति द्वारा मध्यस्थता है. CCL19 और CCL21 लिम्फ नोड टी सेल क्षेत्र 4,11 को विस्थापित करने DCs और टी कोशिकाओं की सुविधा CCR7 रिसेप्टर द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. इसी तरह chemokines का उपयोग कर के बावजूद, DCS और टी कोशिकाओं लिम्फ नोड्स 12 में विभिन्न प्रवास मार्गों है. बाद में, लिम्फ नोड और शुद्ध लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के अलगाव के enzymatic पाचन का उपयोग, कार्यात्मक पढ़ाई अलग लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की भूमिका और DCS और टी / बी कोशिकाओं 6,13 के साथ बातचीत करने की क्षमता पर प्रदर्शन किया गया. सबसे पहले, IFN-γ उत्पादन प्रेरक टी कोशिकाओं और लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के बीच crosstalk माध्यमिक lymphoid अंगों 14-16 में टी सेल प्रतिक्रिया और प्रसार गीला हो जाना दिखाया metabolite नाइट्रिक ऑक्साइड के उत्पादन को प्रेरित करता है. दूसरा, लसीका nस्तोत्र stromal कोशिकाओं आईएल 10 से 17 के उत्पादन के माध्यम से नियामक डीसी सबसेट के भेदभाव का समर्थन करने के लिए, और आईएल -7 6,18 के उत्पादन के माध्यम से भोले टी सेल homeostasis मिलाना सूचित किया गया है. तीसरा, लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं में TLR अभिव्यक्ति stromal कोशिकाओं ऊतक चोट के दौरान जारी एक संक्रमण या स्वयं अणुओं से व्युत्पन्न संकेत करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि पता चलता है. दरअसल, TLR3 पाली की ligand साथ लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के इलाज (मैं: सी) में जिसके परिणामस्वरूप, प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल वर्ग मैं अभिव्यक्ति और सह निरोधात्मक अणु पीडी-एल 1 के upregulation के एक मामूली upregulation लाती है, लेकिन नहीं costimulatory अणुओं की परिधीय ऊतक में नाटकीय परिवर्तन अभिव्यक्ति 19 प्रतिजनों. कई समूहों लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं परिधीय ऊतक एंटीजन एक्सप्रेस और स्वयं प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं 19,21-27 की सहिष्णुता प्रेरित दिखाया गया है. इसलिए, लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं और अन्य प्रवासी और पुनः के बीच बातचीत को समझनेsident लिम्फ नोड कोशिकाओं में सूजन के दौरान सक्रियण या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन अनुमति देने के लिए नए लक्ष्य अणु खोजने में मदद मिलेगी. इसलिए, लिम्फ नोड के प्रकाशित एंजाइमी जुदाई के क्रियान्वयन की जरूरत है.
इससे पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल कम यांत्रिक तनाव 6,19,20 साथ collagenase आधारित enzymatic पाचन के विभिन्न संयोजनों का उपयोग करें. हालांकि, पाचन एंजाइमों या पाचन एंजाइम के विभिन्न संयोजन के साथ लंबे समय incubations सक्रियण स्थिति का विश्लेषण करने के लिए और नए लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की पहचान करने के लिए आवश्यक विभिन्न सतह अणुओं नीचा हो सकता है. Stromal सेल विश्लेषण के प्रकार पर निर्भर करता है, लिंक प्रोटोकॉल या फ्लेचर प्रोटोकॉल अधिक उपयुक्त हो सकता है. वर्णित प्रक्रिया में, एक से थोड़ा कम enzymatic पाचन व्यवहार्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की सतह मार्कर गिरावट को कम करने के लिए स्वचालित यांत्रिक disaggregation के साथ संयुक्त है. यह प्रक्रिया अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव में सक्षम बनाता है औरकम परिवर्तनशीलता और 95% से अधिक व्यवहार्यता के साथ लिम्फ नोड stromal सेल आबादी का गौरव. हौसले से अलग लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं सीधे विट्रो में कार्यात्मक assays के प्रदर्शन करने के लिए stromal कोशिकाओं लाइनों की सतह मार्कर अभिव्यक्ति, प्रोटीन विश्लेषण, और ट्रांसक्रिप्शनल पढ़ाई, साथ ही स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
इस वीडियो प्रकाशन और प्रोटोकॉल में सभी पशु प्रक्रियाओं केंटन प्राधिकरण बेसल स्टैड, स्विट्जरलैंड द्वारा अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल के अनुसार आयोजित किया गया.
1 लिम्फ नोड्स तैयारी और पाचन
- हीटिंग थाली के साथ एक चुंबकीय दोषी पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक बीकर में पूर्व गर्मी पानी.
- निम्नलिखित के रूप में मूल मध्यम तैयार: DMEM मध्यम (पाइरूवेट के बिना) 2% FCS साथ पूरक, 1.2 मिमी 2 CaCl और पेन / Strep (पेनिसिलिन की 100 इकाइयों, स्ट्रेप्टोमाइसिन की 100 ग्राम).
- उपयोग करने से पहले सभी विच्छेदन उपकरणों जीवाणुरहित.
- सीओ 2 asphyxiation प्रति लिम्फ नोड दाता चूहों Euthanize और aseptically लिम्फ नोड्स काटना. आसपास के वसा काटना मत करो. नोट: इस प्रोटोकॉल परिधीय त्वचा draining लिम्फ नोड (वंक्षण, बाहु, कक्षा) के लिए अनुकूलित है.
- 2 मिलीलीटर बर्फ ठंड बुनियादी मध्यम युक्त एक बाँझ पेट्री डिश में लिम्फ नोड्स रखें.
- लिम्फ नोड सीए बाधित1 मिलीलीटर सिरिंज पर तय की दो 25 जी सुइयों का उपयोग psule.
- 1 मिलीग्राम / Collagenase चतुर्थ और एमएल 40 माइक्रोग्राम / एमएल DNase मैं के साथ पूरक 750 μl बुनियादी मध्यम युक्त एक 5 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब में बाधित लिम्फ नोड ऊतक स्थानांतरण
- प्रत्येक ट्यूब में एक बाँझ चुंबकीय दोषी जोड़ें.
- 37 डिग्री सेल्सियस के साथ बीकर में जगह ट्यूब पानी छोड़ देते हैं और 30 मिनट के लिए एक धीमी दर (1 दौर / सेक) में ट्यूबों हलचल.
- हीटिंग थाली के साथ चुंबकीय दोषी से ट्यूब निकालें और लिम्फ नोड टुकड़े व्यवस्थित करते हैं.
- ध्यान से "गैर stromal सेल" में समृद्ध सतह पर तैरनेवाला हटायें. नोट: टी, बी, वृक्ष के समान कोशिकाओं और CD45 का विश्लेषण - अगर gp38 - CD31 - सोच है, "गैर stromal कोशिकाओं" अंश बचा.
- धो 750 μl बुनियादी माध्यम के साथ एक बार लिम्फ नोड ऊतक शेष. नोट: इस कदम प्रतिरक्षा सक्षम चूहों के साथ काम कर ही यदि आवश्यक है.
- लिम्फ नोड टुकड़े व्यवस्थित करते हैं.
- निकालेंगैर stromal सेल चल अंश.
- 750 μl बुनियादी मध्यम 3.5 मिलीग्राम के साथ पूरक लिम्फ नोड टुकड़े में जोड़ें / एमएल Collagenase डी और 40 माइक्रोग्राम / एमएल DNase मैं
- वापस 37 डिग्री सेल्सियस से युक्त बीकर में जगह ट्यूब पानी छोड़ देते हैं.
- धीरे धीरे क्रियाशीलता जबकि 5 मिनट के लिए लिम्फ नोड ऊतक डाइजेस्ट.
- Pipetting और एक स्वचालित multichannel विंदुक का उपयोग कर अधिक से अधिक गति से 10 चक्र के लिए 700 μl मिश्रण से disaggregate लिम्फ नोड ऊतक टुकड़े. नोट: यह पाचन में सुधार करने के लिए लिम्फ नोड ऊतक बाधित.
- 37 डिग्री सेल्सियस preheated पानी के साथ वापस बीकर में ट्यूब रखें.
- धीरे धीरे क्रियाशीलता जबकि एक और 10 मिनट के लिए डाइजेस्ट लिम्फ नोड ऊतक टुकड़े.
- Pipetting द्वारा लिम्फ नोड ऊतक टुकड़े disaggregate और एक स्वचालित multichannel विंदुक का उपयोग कर अधिक से अधिक गति से 99 चक्र के लिए मिश्रण.
- एकल कक्ष निलंबन के रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए 0.5 एम EDTA के 7.5 μl जोड़ें.
- पाइप द्वारा disaggregate लिम्फ नोड ऊतक टुकड़ेtting और एक स्वचालित multichannel विंदुक का उपयोग कर अधिक से अधिक गति से 99 चक्र के लिए मिश्रण.
- 750 μl बुनियादी मध्यम जोड़ें और एक 70 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं.
- अपकेंद्रित्र सेल निलंबन 1500 XG पर 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस.
- Stromal कोशिकाओं अब आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के 2 धुंधला
- सफलतापूर्वक टीआरसी, LEC, BEC और डी.एन. कोशिकाओं को पहचान करने के लिए विरोधी CD45, विरोधी podoplanin (gp38), विरोधी CD31 एंटीबॉडी का एक संयोजन का उपयोग करें.
- , विरोधी gp38 पीई (1: 200), विरोधी CD31-एपीसी (1: 200) 100 μl HBSS में 2 युक्त: लाइव / मृत ट्रैकर, विरोधी CD45-FITC (200 1) के साथ पचा लिम्फ नोड ऊतक सेते अंधेरे में कम से कम 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस, के लिए% एफसीएस.
- 2% एफसीएस युक्त HBSS के 500 एल जोड़ने कोशिकाओं को धो लें
- अपकेंद्रित्र सेल निलंबन 1500 XG पर 3 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस.
- 2% एफसीएस युक्त HBSS के 100 μl में फिर से निलंबित.
- Equipp कोशिकामापी एक प्रवाह में दाग कोशिकाओं भागोनिम्नलिखित प्रकाशिकी के साथ एड: उत्तेजना तीन लेज़रों के साथ स्रोत: नीला (488 एनएम, एयर कूल्ड, 20 मेगावाट ठोस राज्य), लाल (633 एनएम, 17 मेगावाट HeNe), और बैंगनी (405 एनएम, 30 मेगावाट ठोस राज्य) .
- गेट CD45 - कोशिकाओं hematopoietic कोशिकाओं को बाहर करने के लिए.
- गेट singlets (FSC डब्ल्यू) और जीवित कोशिकाओं (LIVE / मृत ट्रैकर) दोहरी और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए.
- , LEC (gp38 + CD31 +), सी (gp38 - CD31 +) और डी.एन. (gp38 - CD31 -) कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) - CD31 बनाम प्लॉट gp38 टीआरसी (gp38 + CD31) कल्पना करने के लिए.
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Representative Results
वर्तमान प्रोटोकॉल की वजह से एक स्वचालित multichannel विंदुक के साथ यांत्रिक disaggregation के लिए एक छोटा पाचन समय (45 मिनट अधिकतम) के साथ लिंक एट अल., 2007 6 से प्रकाशित एक संशोधित पाचन प्रोटोकॉल है. इसके अलावा, प्रक्रिया, अधिक मानकीकृत है अलग लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं पर सतह मार्कर की गिरावट को कम करता है और एक ही समय में एक से अधिक नमूने की हैंडलिंग की अनुमति देता है.
में Collagenase चतुर्थ और Collagenase डी Fletchers प्रोटोकॉल 13 में लिंक प्रोटोकॉल 6 और मौजूदा प्रोटोकॉल या Collagenase पी और Dispase लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं व्यवहार्यता बनाए रखने और CD45, gp38 और CD31 सहित कई सतह मार्कर की पाचन छोड़ेगी. परीक्षण करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल, कक्षा, बाहु और वंक्षण लिम्फ नोड्स हटा दिया है और उनकी stromal कोशिकाओं को अलग करने के लिए पचा गया. CD45, gp38 और CD31 अभिव्यक्ति का विश्लेषण C57BL / 6 मीटर से अलग टीआरसी, LEC, BEC और डी.एन. कोशिकाओं की उपस्थिति का प्रदर्शनबर्फ (चित्रा 1, gating रणनीति).
यांत्रिक तनाव पाचन के दौरान लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की व्यवहार्यता को कम कर सकता है. तीन अलग अलग प्रोटोकॉल का उपयोग stromal कोशिकाओं के अलग subpopulations की व्यवहार्यता तुलना, यह व्यवहार्यता, फ्लेचर प्रोटोकॉल में अधिक से अधिक 95% थी, लेकिन मौजूदा प्रोटोकॉल और लिंक प्रोटोकॉल (2A चित्रा) दोनों के लिए कम पाया गया कि वर्तमान प्रोटोकॉल शो बेहतर हालांकि बीईसी subpopulation में अस्तित्व तो प्रोटोकॉल लिंक. कुल कोशिकाओं संख्या लिम्फ नोड stromal सेल सबसेट के पद पाचन बरामद लिंक प्रोटोकॉल और फ्लेचर प्रोटोकॉल (2A चित्रा) की तुलना में वर्तमान प्रोटोकॉल में थोड़ा अधिक था. इन परिणामों के वर्तमान प्रोटोकॉल प्रकाशित प्रोटोकॉल के समान लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की व्यवहार्यता का कहना है कि प्रदर्शित करता है. तीन प्रोटोकॉल के बीच बड़े मतभेद 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं.
सतह मार्कर एक प्रवाह cytometry द्वारा लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए और सेल छँटाई द्वारा उन्हें अलग करने के लिए आवश्यक पुन. TRCs और LECs, लिंक और फ्लेचर प्रोटोकॉल आइए बी, CD140a, CD80, पीडी-एल 1 और CD40 अभिव्यक्ति के लिए वर्तमान की तुलना में थे जरिए अलग किया. सभी तीन प्रोटोकॉल से stromal कोशिकाओं को अलग करने के बाद, हम आइए बी, CD80, CD140a, पीडी-एल 1 की अभिव्यक्ति मिली, और CD40 TRCs और LECs (चित्रा 2 बी) दोनों में सीपी और एल.पी. साथ पाचन पर अधिक था. इन परिणामों Collagenase चतुर्थ और डी के साथ कुछ सतह अणुओं की गिरावट Collagenase पी और Dispase के साथ तुलना में कम मजबूत कर रहे हैं कि सुझाव.
साथ में ले ली, मौजूदा प्रोटोकॉल व्यवहार्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की सतह मार्कर गिरावट को कम करने के लिए स्वचालित यांत्रिक disaggregation के साथ संयुक्त एक छोटी पाचन शामिल है.
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C57BL / 6 चूहों से चित्रा 1 टीआरसी, LEC, बीईसी, और डी.एन. कोशिकाओं धुंधला हो जाना, gating, और मात्रा का ठहराव. लिम्फ नोड्स, मौजूदा प्रोटोकॉल के बाद से पचता है और टीआरसी, LEC परिभाषित करने के लिए CD45, gp38 और CD31, / लाइव मृत साथ दाग रहे थे फ्लो ने बीईसी, और डी.एन. कोशिकाओं. डाटा धुंधला के प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के चित्रा 2 व्यवहार्यता और सतह मार्कर अभिव्यक्ति. C57BL / 6 चूहों से लिम्फ नोड्स, लिंक (एलपी) और फ्लेचर प्रोटोकॉल (एफ पी) और CD45, gp38 और CD31 के साथ दाग को परिभाषित करने के लिए वर्तमान (सीपी) निम्नलिखित पचा गया फ्लो. ए) Viabil द्वारा टीआरसी, LEC, BEC और डी.एन. कोशिकाओंअल्पसंख्यक और लाइव / मृत धुंधला के बाद सभी लिम्फ नोड stromal सेल subpopulations की कुल सेल नंबर. बी) आइए बी की सतह अभिव्यक्ति का विश्लेषण (एपीसी-Cy7), CD140a (एन ≥ 5, 2 स्वतंत्र प्रयोगों की जमा डेटा, सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं) (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), पीडी-एल 1 (पीई Cy7) और TRCs पर CD40 (पीई Cy7) और LECs (एन = 6 एल.पी. और वाणिज्यिक पत्र के लिए एफ पी और एन = 11 के लिए , 2 स्वतंत्र प्रयोगों की जमा डेटा, सलाखों) SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं. LEC-APC-Cy7 के लिए ज्यामितीय एमएफआई ऑटो प्रतिदीप्ति मूल्यों: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82.5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, टीआरसी-APC-Cy7: 349 ± 152, टीआरसी PECy7: 117 . 121 ± 45:, टीआरसी PerCP-Cy5.5 54 ± बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
| वर्तमान प्रोटोकॉल एंजाइमों | वर्तमान प्रोटोकॉल | लिंक प्रोटोकॉल-एंजाइमों | लिंक प्रोटोकॉल | एफLetcher प्रोटोकॉल एंजाइमों | फ्लेचर प्रोटोकॉल |
| Collagenase चतुर्थ, DNase मैं | 30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, सरगर्मी | Collagenase चतुर्थ, DNase मैं | 30 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस | Collagenase पी, Dispase, DNase मैं | 20 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, हर 5 मिनट पलटना |
| Collagenase डी, DNase मैं | 5 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, क्रियाशीलता, resuspend | Collagenase डी, DNase मैं | 20 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस | Collagenase पी, Dispase, DNase मैं | 10 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड resuspend |
| 10 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, सरगर्मी | Collagenase डी, DNase मैं | 37 डिग्री सेल्सियस, पूरा पाचन जब तक हर 10 मिनट resuspend | Collagenase पी, Dispase, DNase मैं | 37 डिग्री सेल्सियस, पूरा पाचन जब तक हर 5 मिनट resuspend | |
| स्वचालित यांत्रिक मेजबान |
सीपी की तालिका 1 लघु सारांश, एल.पी., एफपी एंजाइमों का इस्तेमाल किया और प्रोटोकॉल.
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Discussion
लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं का अध्ययन हाल ही में कारण दो प्रकाशित पाचन प्रोटोकॉल 6,13 के विकास के लिए एक अनुसंधान ध्यान केंद्रित हो गया. दोनों प्रोटोकॉल एकल लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं हासिल करने के लिए पर्याप्त हैं लेकिन पाचन एंजाइमों का उपयोग और पाचन के समय में भिन्न होते हैं. Stromal कोशिकाओं और उनकी सतह मार्कर enzymatic पाचन और यांत्रिक तनाव के प्रति संवेदनशील हैं, एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है.
हौसले से विच्छेदित लिम्फ नोड से व्यवहार्य लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं का अलगाव प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण करने के क्रम में पहला कदम है. इसलिए, यह ध्यान से एक स्थिर तापमान में और संकेत समय के लिए, एंजाइमों के परिभाषित एकाग्रता के साथ पचाने के लिए महत्वपूर्ण है. दो पाचन प्रोटोकॉल हालांकि बल्कि लंबे पाचन कदम के साथ, 6,13 वर्णित किया गया है. पाचन के समय को कम करने के लिए, यांत्रिक disaggregation शामिल है और एक multichannel विंदुक का उपयोग मानकीकरण किया गया था. में मौजूदा प्रोटोकॉल के फायदे के ई इसलिए यह पाचन एंजाइमों के साथ उनके ऊष्मायन समय कम से कम, केवल 45 मिनट में stromal कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है. इसके अलावा, पाचन के दौरान निरंतर सरगर्मी लिम्फ नोड संरचना करने के लिए पाचन एंजाइमों के इष्टतम उपयोग की अनुमति देता. इसके अलावा, पाचन मात्रा में प्रयोग किया जाता एंजाइम की मात्रा कम μl 750 तक कम हो गया था.
अत्यधिक यांत्रिक बल तंग जंक्शनों बाधित लेकिन एक ही समय में कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है. इस कारण से हम फिर से निलंबन चक्र और विभिन्न हदबंदी उपकरणों के कई संयोजनों का परीक्षण किया. हम एक स्वचालित multichannel विंदुक का उपयोग 99 चक्र के 2 आवेदन के भीतर हदबंदी की अनुमति देता है कि पाया; कोशिकाओं को एक निरंतर दबाव लागू करते हैं और इस इष्टतम व्यवहार्यता के साथ एकल कक्ष निलंबन में परिणाम होगा. चार से छह नमूने मिश्रित और लिम्फ नोड stromal सेल अलगाव के समय को कम करने के एक ही समय में pipetted किया जा सकता है.
ontent "> पाचन प्रोटोकॉल लगभग सभी अणुओं की सतह अभिव्यक्ति बनाए रखने के लिए है,. आबादी के सजातीय या विषम है तो केवल इस तरह से कई मार्कर के साथ सहवर्ती धुंधला प्रकट कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, में बी पी -3 और CD35 का उपयोग टीआरसी gp38 + CD31 -. दिमाग़ी टीआरसी (संजीव लूथर, व्यक्तिगत संचार) के दृश्य और अलगाव के लिए अनुमति देता है इसके अलावा, खराब विशेषता डी.एन. अंश आगे α7 Integrin के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की तरह अरे + कोशिकाओं और pericyte युक्त विशेषता के रूप में किया गया था (7 में समीक्षा 13). इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल प्रकाशित वालों की तुलना में किया गया था. प्रकाशित वालों की तुलना में मौजूदा प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया गया परिणाम, इसी तरह की आवृत्तियों और लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं की संख्या में दिखाया गया है. अलग टीआरसी का दिलचस्प है, आवृत्ति और संख्या उच्चतम वर्तमान प्रोटोकॉल में से टीआरसी संरचनाओं की एक बेहतर हदबंदी सुझाव फ्लेचर प्रोटोकॉल इस्तेमाल कर रहे थे औरलिंक प्रोटोकॉल. इसके अलावा, विभिन्न सतह अणुओं की अभिव्यक्ति फ्लेचर प्रोटोकॉल की तुलना में वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ बढ़ाया गया था. पाचन विधि में इन मतभेदों लिम्फ नोड stromal सेल पढ़ाई 6,19,21 में थोड़ा अलग अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए कारण हो सकता है. यह क्योंकि प्रत्येक प्रोटोकॉल के फायदे के विभिन्न पाचन प्रोटोकॉल का परीक्षण करने के लिए उपयोगी हो सकता है. फ्लेचर प्रोटोकॉल प्रतिलेखन के विश्लेषण के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की उच्च संख्या के अलगाव के लिए उपयोगी हो सकता है, जबकि (मल्होत्रा एट अल. 7 में प्रकाशित) वर्तमान प्रोटोकॉल, सतह अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए बेहतर हो सकता है. इसलिए सभी तीन पाचन प्रोटोकॉल की तुलना लिम्फ नोड stromal कोशिकाओं के अलगाव के बाद इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और पूरक के रूप में देखा जाना चाहिए.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | Final concentration 2% | ||
| CaCl2 | Sigma | 499609 | Final concentration 1.2 mM |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml | |
| Collagenase D | Roche | 11088882001 | use at 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche | 11284932001 | use at 40 µg/ml |
| Stiring magnets | FAUST | 5 mm long-2 mm ø | |
| Polystyrene round bottom tubes 5 ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-RCT-standard | 9720250 | |
| Petri dishes 100 mm, sterile | TPP | 6223201 | |
| 25 G needles | Terumo | ||
| anti mouse CD45 Ab | Biolegend | Clone 30-F11 | |
| anti mouse CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| anti mouse Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| anti mouse CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel |
Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µl max. volume |
| anti mouse CD140a | Biolegend | Clone APA5 | |
| anti mouse CD80 | Biolegend | Clone 16-10A1 | |
| anti mouse CD40 | Biolegend | Clone 1C10 | |
| anti mouse I-Ab | Biolegend | Clone AF6-120.1 | |
| anti mouse CD274 (PD-L1) | Biolegend | Clone 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit | Invitrogen | L10119 |
References
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).
- Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).
- Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).
- Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).
- Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).
- Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).
- Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).
- Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).
- MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).
- Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).
- Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).
- Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
- Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).
- Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6 (11), e27618 (2011).
- Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6 (11), e26138 (2011).
- Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).
- Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).
- Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).
- Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
- Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
- Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
- Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
- Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
