Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering af murine lymfeknuder stromacellers

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lymfeknuder er specialiserede segmenter, hvor adaptive immunrespons mod fremmede og selvantigener indledes og koordineres. Fremgangsmåden præsenteres her beskriver en kort enzymatisk nedbrydning kombineret med automatiseret mekanisk pipettering at opnå lymfeknude enkelt cellesuspension og få adgang til brugbare lymfeknude stromaceller der opretholder overfladeekspression af en række forskellige molekyler.

Lymfeknude stromacelle danner stillads af lymfeknude og opfylde tre hovedfunktioner: først de filtrerer kropsvæsker at prøve antigener, patogener og deres patogen forbundet molekylære mønster (PAMPs), samt cytokiner og fare forbundet molekylær mønster (dæmper) til stede i kroppen. For det andet, de tiltrækker og instruere antigenpræsenterende celler (APC) og lymfocytter til at interagere og iværksætte adaptive immunrespons; og tredje, giver de en strukturel miljø for homeostase og differentieringen af lymfocytter en-3. Under inflammation lymfeknude stromale celler producerer vækstfaktorer, cytokiner og chemokiner, tilpasse sig hævelse derved organisere samspillet mellem dendritiske celler (DCS), T og B-celler. Orkestrering af immunreaktioner er kun mulig på grund af den komplekse strukturelle arkitektur udgøres af forskellige stromale celle populationer.

Lymfeknude Stromaceller CD45 negative celler og kan skelnes ved ekspression af CD31 eller gp38 i fibroblastiske og endotelceller 1 -6. Gp38 + CD31 - definerer T-zone retikulære celler (TRC, også kendt som FRC: fibroblastiske retikulære celler) gp38 + CD31 + definerer lymfeendotelceller (LEC), gp38 - CD31 + definerer blod endotelceller (BEC). Yderligere karakterisering af subpopulationer afslørede eksistensen af ​​andre lymfeknude stromale celler. Faktisk blev en lille pericyt-lignende celle befolkning karakteriseret inden forgp38 - CD31 - befolkning 7. Derfor tilpasning af isolation procedure er fordelagtig til identifikation og karakterisering af de funktionelle egenskaber af forskellige lymfeknude stromaceller.

Før udviklingen af lymfeknude stromaceller fordøjelse protokoller studiet af lymfeknude stromaceller blev begrænset til in situ observationer ved hjælp af vævssnit og mikroskopi. Ikke desto mindre strukturelle og funktionelle undersøgelser viste vigtigste egenskaber lymfeknude stromale celler. Lymfeknude stromaceller forbundet med podoplanin, kollagen og ekstracellulær matrix (ECM) proteiner til dannelse af et kompleks 3-dimensionel struktur kaldet rørsystem, der transporterer lymfeknuder og tilhørende lav molekylmasse proteiner fra subkapsulære hule lymfeknudesygdom til den høje endotel venuler i T-celler zone 8. DC'er er i tæt kontakt med stroma-celler og kan observeres rager ind i den rørformede conduit struktur prøve væske og detektere antigener 8. Interaktionen af lymfeknude stromale celler (TRCs og LEC) med udviklingslandene medieres af frigivelsen og præsentation af chemokiner CCL21 og CCL19 9,10. CCL19 og CCL21 er anerkendt af CCR7 receptoren letter DCer og T-celler til at migrere til lymfeknuderne T-celle zone 4,11. Trods anvendelse af lignende kemokiner, DCS og T-celler har forskellige trækruter i lymfeknuderne 12. Senere, ved hjælp af enzymatisk fordøjelse af lymfeknude og isolation af rene lymfeknude stromaceller blev funktionelle undersøgelser udført på den rolle, som forskellige lymfeknude stromale celler og deres evne til at interagere med DC'er og T / B-celler 6,13. Først krydstale mellem IFN-γ producerende effektor T-celler og lymfeknude stromale celler inducerer produktionen af metabolitten nitrogenoxid vist sig at dæmpe T-celle responser og proliferation i de sekundære lymfoide organer 14-16. For det andet, lymfe node stromale celler er blevet rapporteret at understøtte differentieringen af regulerende DC delmængder via produktionen af IL-10 17, og at modulere naiv T-celle-homeostase via produktionen af IL-7 6,18. For det tredje, TLR ekspression i lymfeknude stromaceller tyder på, at stromacellerne er modtagelige for at signalere afledt af en infektion eller en selvstændig molekyler frigives under vævsskade. Faktisk behandling af lymfeknude stromaceller med liganden TLR3 poly (I: C) inducerer en beskeden opregulering af dominerende histokompatibilitetskompleks-klasse I-ekspression og opregulering af co-inhiberende molekyle PD-L1, men ikke af costimulerende molekyler, hvilket resulterer i dramatiske ændringer i perifere væv antigener udtryk 19. Flere grupper har vist lymfeknude stromaceller udtrykker perifere vaevsantigener og inducere tolerance over for selvnedbrydende T-celler 19,21-27. Derfor forstå samspillet mellem lymfeknude stromale celler og andre vandrende og resident lymfeknudeceller vil hjælpe med at finde nye målmolekyler at tillade aktivering eller undertrykkelse af immunreaktioner under inflammation. Derfor er der behov for gennemførelsen af ​​den offentliggjorte enzymatisk adskillelse af lymfeknude.

Tidligere publicerede protokoller anvender forskellige kombinationer af collagenase-baserede enzymatisk fordøjelse med lav mekanisk belastning 6,19,20. Lange inkubationer med fordøjelse enzymer eller den anden kombination af fordøjelsen enzym kan dog nedbryde forskellige overflademolekyler kræves for at analysere status aktivering og til at identificere nye lymfeknude stromale celler. Afhængig af analysen stromacellen kan Link protokollen eller Fletcher protokol være mere velegnet. I den beskrevne procedure, er en lidt kortere enzymatisk nedbrydning kombineret med automatiseret mekanisk opdeling for at minimere overflade markør nedbrydning af levedygtige lymfeknude stromaceller. Denne procedure gør det muligt for meget reproducerbar isolation ogskelnen af ​​lymfeknude stromale celle populationer med lav variation og mere end 95% levedygtighed. De frisk isolerede lymfeknudeceller stromale celler kan anvendes direkte til overfladen markør ekspression proteinanalyse og transkriptionelle undersøgelser samt etablering af stromale cellelinier til at udføre funktionelle assays in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne video offentliggørelse og protokol blev alle dyreforsøg gennemføres i overensstemmelse til dyret protokol godkendt af Cantonal Authority Basel-Stadt, Schweiz.

1. lymfeknuder Forberedelse og fordøjelse

  1. Pre-varme vand i et bægerglas til 37 ° C på en magnetomrører med varmeplade.
  2. Forbered basisk medium som følgende: DMEM-medium (uden pyruvat) suppleret med 2% FCS, 1,2 mM CaCl2 og Pen / Strep (100 enheder penicillin, 100 ug streptomycin).
  3. Sterilisere alle dissektion instrumenter før brug.
  4. Aflive lymfeknude donormus pr CO 2 kvælning og aseptisk dissekere lymfeknuderne. Ikke dissekere det omgivende fedt. BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til perifer hud drænende lymfeknude (lyske, brachialis, aksil).
  5. Placer lymfeknuder i en steril petriskål indeholdende 2 ml iskold basisk medium.
  6. Forstyrre lymfeknude CApsule hjælp af to 25 G kanyler fastsat den 1. ml sprøjte.
  7. Overfør forstyrret lymfeknude væv i et 5 ml polypropylen rundbundet rør indeholdende 750 pi basisk medium suppleret med 1 mg / ml collagenase IV og 40 ug / ml DNAse I.
  8. Tilsæt en steril magnetomrører i hvert rør.
  9. Placer røret i bægerglasset med 37 ° C forvarmet vand og rør rørene med langsom hastighed (1 runde / sek) i 30 min.
  10. Glasset fjernes fra magnetomrøreren med varmeplade og lad lymfeknude fragmenter bundfælde sig.
  11. Fjern forsigtigt supernatanten beriget med "ikke-stromacelle-". BEMÆRK: Hvis analysen af T, B, dendritiske celler og CD45 - gp38 - CD31 - er planlagt, skal du gemme "ikke-stromaceller" fraktion.
  12. Vask resterende lymfeknudevæv gang med 750 pi basisk medium. BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendig, hvis du arbejder med immun-kompetente mus.
  13. Lad lymfeknude fragmenter bundfælde sig.
  14. Fjernikke-stromacelle flydende fraktion.
  15. Tilføj til lymfeknude fragmenter 750 ul grundlæggende medium suppleret med 3,5 mg / ml Collagenase D og 40 ug / ml DNase I.
  16. Placer røret tilbage i bægerglasset indeholdende 37 ° C forvarmet vand.
  17. Fordøje lymfeknude væv i 5 min, mens langsomt omrøring.
  18. Disaggregere lymfeknudevæv fragmenter ved pipettering og blanding 700 ul i 10 cykler ved maksimal hastighed ved hjælp af en automatiseret multikanalpipette. BEMÆRK: Dette forstyrrer lymfeknudevæv at forbedre fordøjelsen.
  19. Placer røret tilbage i bægerglasset med 37 ° C forvarmet vand.
  20. Digest lymfeknude vævsfragmenter i yderligere 10 minutter, mens langsomt omrøring.
  21. Opdele lymfeknudevæv fragmenter ved pipettering og blanding i 99 cyklusser ved maksimal hastighed ved hjælp af en automatiseret multikanalpipette.
  22. Tilføj 7.5 pi 0,5 M EDTA, for at sikre vedligeholdelse af en enkelt cellesuspension.
  23. Disaggregerede lymfeknude vævsfragmenter efter rørKom godt og blanding i 99 cyklusser ved maksimal hastighed ved hjælp af en automatiseret multikanalpipette.
  24. Tilføj 750 pi basisk medium og passere celler gennem en 70 um nylonnet.
  25. Centrifuger cellesuspension 5 min ved 1.500 x g, 4 ° C.
  26. Stromaceller kan nu anvendes til yderligere analyse.

2. Farvning af lymfeknuder stromacellers

  1. Brug en kombination af anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31 antistoffer mod succes genkende TRC, LEC, BEC og DN-celler.
  2. Inkubér fordøjet lymfeknudevæv hos Live / Dead tracker, anti-CD45-FITC (1: 200), anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200) i 100 pi HBSS indeholdende 2 % FCS i mindst 20 minutter, 4 ° C i mørke.
  3. Vask cellerne tilføje 500 liter HBSS indeholdende 2% FCS
  4. Centrifuger cellesuspension 3 min ved 1500 xg, 4 ° C.
  5. Resuspender i 100 ul HBSS indeholdende 2% FCS.
  6. Kør de farvede celler i et flowcytometer equipped med følgende optik: excitationskilde med op til tre lasere: blå (488 nm, luftkølet, 20 mW solid state), rød (633 nm, 17 mW HeNe) og violet (405 nm, 30 mW solid state) .
  7. Gate CD45 - celler til at udelukke hæmatopoietiske celler.
  8. Gate herreundertrøjer (FSC-W) og levende celler (LIVE / DEAD tracker) for at udelukke dubletter og døde celler.
  9. Plot gp38 versus CD31 at visualisere TRC (gp38 + CD31 -), LEC (gp38 + CD31 +) BEC (gp38 - CD31 +) og DN (gp38 - CD31 - celler) (se figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den foreliggende protokol er en modificeret fordøjelse protokol offentliggjort af Link et al., 2007 6 med en kortere fordøjelse tid (45 min max) på grund af mekanisk opdeling med en automatiseret multikanalpipette. Desuden er fremgangsmåden mere standardiseret, minimerer nedbrydning af overflademarkører på forskellige lymfeknude stromaceller og tillader håndtering af mere end én prøve på samme tid.

Collagenase IV og Collagenase D Links Protokol 6 og nuværende protokol eller Collagenase P og Dispase i Fletchers protokol 13 opretholder lymfeknude stromale celler levedygtighed og skåne fordøjelsen af flere overflademarkører herunder CD45, gp38 og CD31. For at teste den nuværende protokol, aksil, brachialis og lyske lymfeknuder blev fjernet og fordøjet at isolere deres stromaceller. Analyse af CD45, gp38 og CD31-ekspression viste tilstedeværelsen af ​​TRC, LEC, BEC og DN celler isoleret fra C57BL / 6 mis (figur 1, gating-strategien).

Mekanisk stress kan reducere levedygtigheden af ​​lymfeknude stromaceller under fordøjelsen. Sammenligning levedygtigheden af isolerede subpopulationer af stromale celler ved hjælp af de tre forskellige protokoller, blev det konstateret, at rentabiliteten var højere end 95% i Fletcher-protokollen, men lavere for både nuværende protokol og Link protokol (figur 2A), selvom nuværende protokol viser bedre overlevelse i BEC delpopulation dengang Link protokol. Den totale celler nummer genvundet posten fordøjelse af lymfeknude stromale celleundergrupper var lidt højere i nuværende protokol i forhold til Link protokol og Fletcher protokol (figur 2A). Disse resultater viser, at den nugældende protokol bevarer levedygtighed lymfeknude stromalceller ligner offentliggjorte protokoller. De store forskelle mellem de tre protokoller er anført i tabel 1.

Overflademarkører en re nødvendigt at karakterisere lymfeknude stromaceller ved flowcytometri og at isolere dem ved cellesortering. TRCs og LEC isoleret via Strøm, blev Link og Fletcher protokoller i forhold til IA b CD140a, CD80, PD-L1 og CD40 udtryk. Efter isolering af stromale celler ved alle tre protokoller, fandt vi et udtryk for IA B, CD80, CD140a, PD-L1, og CD40 var højere ved fordøjelse med CP og LP i både TRCs og LEC (figur 2B). Disse resultater antyder, at nedbrydning af nogle overflademolekyler med collagenase IV og D er mindre stærk end med collagenase P og Dispase.

Tilsammen den nuværende protokol indeholder en kort fordøjelse kombineret med automatiseret mekanisk opdeling for at minimere overflade markør nedbrydning af levedygtige lymfeknude stromale celler.

"/>
Figur 1. TRC, LEC, BEC, og DN-celler farvning, gating og kvantificering. Lymfeknuder fra C57BL / 6 mus blev fordøjet efter den nuværende protokol og farvet med CD45, gp38 og CD31, Levende / Dead at definere TRC, LEC, BEC og DN celler ved flowcytometri. Data viser repræsentative resultater af farvning. Klik her for at se et større billede.

Figur 2
Figur 2. levedygtighed og overflade markør udtryk for lymfeknude stromaceller. Lymfeknuder fra C57BL / 6 mus blev fordøjet efter det aktuelle (KP), Links (LP) og Fletchers protokol (FP) og farvet med CD45, gp38 og CD31 til at definere TRC, LEC, BEC og DN celler ved flowcytometri. A) Viabiltet og det samlede celle antallet af alle lymfeknude stromale cellesubpopulationer efter Levende / Dead farvning (n ≥ 5 poolede data fra 2 uafhængige forsøg, repræsenterer barer SEM). B) Analyse af overflade udtryk for IA b (APC-Cy7), CD140a (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) og CD40 (PE-Cy7) på TRCs og LEC (n = 6 for FP og n = 11 til LP-og CP , poolede data fra 2 uafhængige forsøg, repræsenterer barer SEM). Geometri MFI auto-fluorescens værdier for LEC-APC-Cy7: 324 ± 97, LEC-PECy7: 163 ± 82,5, LEC-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 ± 54, TRC-PerCP-Cy5.5: 121 ± 45. Klik her for at se et større billede.

Gældende protokol-enzymer Strøm-protokol Linkprotokol-enzymer Link-protokol FLetcher protokol-enzymer Fletcher-protokol
Collagenase IV DNase I 30 minutter, 37 ° C, omrøring Collagenase IV DNAse I 30 minutter, 37 ° C Collagenase P Dispase, DNAse I 20 minutter, 37 ° C, bland hver 5 min
Collagenase D, DNase I 5 min, 37 ° C under omrøring, resuspender Collagenase D, DNAse I 20 minutter, 37 ° C Collagenase P Dispase, DNAse I 10 minutter, 37 ° C, resuspenderes 30 sek
10 minutter, 37 ° C, omrøring Collagenase D, DNAse I 37 ° C, resuspender hver 10 min indtil fuldstændig fordøjelse Collagenase P Dispase, DNAse I 37 ° C, opblande hver 5 min indtil fuldstændig fordøjelse
automatiseret mekanisk resuspension

Tabel 1. Korte resuméer af CP, LP, brugt FP-enzymer og protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Studiet af lymfeknude stromalceller nylig blev et forskningsfokus på grund af udviklingen af to offentliggjorte fordøjelse protokoller 6,13. Begge protokoller er tilstrækkelige til at opnå en enkelt lymfeknude stromale celler, men adskiller sig i brugen af ​​fordøjelsesenzymer og tidspunktet for fordøjelsen. Da stromaceller og deres overflademarkører er følsomme over for enzymatisk fordøjelse og mekanisk belastning, er en optimeret protokol kræves.

Isoleringen af ​​levedygtige lymfeknude stromaceller fra frisk dissekeret lymfeknude er det første skridt for at udføre fænotypiske og funktionel analyse. Derfor er det vigtigt nøje at fordøje med defineret koncentration af enzymer, ved en stabil temperatur og for den angivne tid. To fordøjelse protokoller er blevet beskrevet 6,13, dog med temmelig lange fordøjelse trin. For at reducere den tid af fordøjelsen blev mekanisk opdeling inkluderet og standardiseret ved hjælp af en multikanalpipette. På e af fordelene ved den nuværende protokol er, at det giver mulighed for isolering af stromale celler i kun 45 min, derfor minimere deres inkubationstid med fordøjelsesenzymer. Desuden konstant omrøring under omsætningen giver optimal adgang for fordøjelsesenzymer til lymfeknude struktur. Desuden blev fordøjelsen volumen reduceret til 750 pi minimere mængden af ​​enzym, der anvendes.

Overdreven mekanisk kraft forstyrrer tight junctions, men kan forårsage celledød på samme tid. Derfor testede vi flere kombinationer af resuspension cykler og forskellige dissociation enheder. Vi fandt, at anvendelse af en automatiseret multikanalpipette tillader dissociation inden for 2 anvendelser af 99 cyklusser; anvende et konstant tryk til cellerne, og dette vil resultere i enkelt cellesuspension med optimal levedygtighed. Fire til seks prøver kan blandes og pipetteret samtidig reducere den tid af lymfeknude stromacelle- isolation.

Indholdsproduktion "> Fordøjelsen protokol skal opretholde overfladen ekspressionen af ​​næsten alle molekyler,. kun på denne måde samtidig farvning med flere markører kan afsløre, om en population er homogen eller heterogen For eksempel brugen af ​​BP-3 og CD35 i TRC gp38 + CD31 -. giver mulighed for visualisering og isolering af medullær TRC (Sanjiv Luther, personlig kommunikation) Endvidere dårligt karakteriseret DN fraktion blev yderligere karakteriseret som indeholdende Aire + celler og pericyt lignende celler er positive for integrin α7 (revideret i 7 13). Derfor blev denne protokol i forhold til de offentliggjorte dem. Som vist i resultaterne lignende frekvenser og numre af lymfeknude stromaceller blev opnået med den nuværende protokol i forhold til de offentliggjorte dem. Interessant, hyppigheden og antallet af isolerede TRC var størst hjælp Fletcher protokollen foreslår en bedre dissociation af TRC strukturerne end i den nuværende protokol ogLink protokol. Desuden blev ekspressionen af ​​forskellige overflademolekyler forbedret med den nuværende protokol i forhold til Fletcher protokol. Disse forskelle i fordøjelsen metode kunne være årsagen til lidt forskellige ekspressionsmønstre i lymfeknude stromacellelinier undersøgelser 6,19,21. Det kunne være nyttigt at afprøve forskellige fordøjelse protokoller på grund af fordelene ved hver protokol. Den nuværende protokol kunne være bedre for overflade-ekspression analyse, mens Fletcher protokol kan være nyttigt til isolering af høje antal levedygtige celler til transkription analyse (som offentliggjort i Malhotra et al. 7). Derfor sammenligner alle tre fordøjelse protokoller kan være vigtigt at opnå optimale resultater efter isolering af lymfeknude stromale celler, og skal ses som komplementære.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29, (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10, (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200, (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8, (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13, (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192, (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198, (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12, (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12, (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6, (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6, (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21, (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210, (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207, (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32, (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207, (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120, (24), 4772-4782 (2012).
Isolering af murine lymfeknuder stromacellers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter