Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

림프절은 외국과 자기 항원에 대한 적응 면역 반응이 시작되고 조정되는 전문 구획입니다. 여기에 제시된 절차 림프절 단일 세포 현탁액을 수득하고 여러 분자의 표면 발현을 유지 가능한 림프절 기질 세포에 접근하기 위해 자동화 된 기계적인 피펫 결합 단편의 효소 소화를 설명한다.

림프절 기질 세포가 세 가지 주요 기능을 림프 노드의 골격을 형성하고 이행 : 첫째가 체액 항원, 병원균과 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)뿐만 아니라, 사이토 카인 및 위험 관련 분자 패턴을 샘플링 필터 (감쇠) 본 몸에. 둘째, 상호 작용 및 적응 면역 반응을 시작하는 항원 제시 세포 (APC)와 림프구를 유치하고 지시; 셋째, 이들은 하나의 림프구 항상성 및 분화 구조 환경을 제공-3입니다. 염증 림프절 기질 세포는 성장 인자, 사이토 카인 및 케모카인을 생산하는 동안, 수지상 세포 간의 상호 작용을 편성함으로써, T- 및 B- 세포 종기에 적응. 면역 반응의 오케스트레이션으로 인해 서로 다른 기질 세포 집단에 의해 형성되는 복잡한 구조 아키텍처에만 가능합니다.

림프절 간질 세포가 CD45 음성 세포와 섬유 모세포하며 내피 세포 1-6에서 CD31의 발현 또는 gp38에 의해 구별 될 수있다. CD31 + 혈액 내피 세포를 정의 (BEC)를 - gp38 + CD31 + 림프 내피 세포 (LEC), gp38를 정의 - Gp38 + CD31는 (섬유 모세포 망상 세포 또한 FRC로 알려진 TRC) T 존 망상 세포를 정의합니다. 또한, 특정 집단의 특성은 다른 림프절 기질 세포의 존재를 한 것으로 밝혀졌습니다. 실제로 작은 주연 세포와 같은 세포 집단은 내에 특성화시켰다gp38 - CD31 - 인구 7. 따라서, 분리 절차의 적응은 다른 림프절 기질 세포의 기능적 특성의 확인 및 특성화를 위해 유리하다.

림프절 기질 세포 소화 개발 전에 림프절 기질 세포의 연구는 조직 절편 및 현미경을 이용한 관찰에 시츄로 제한 프로토콜. 그럼에도 불구하고, 구조적 및 기능적 연구는 림프절 기질 세포의 중요한 특성을 보였다. 림프절 기질 세포는 높은 내피로 림프절의 낭하 부비동에서 림프와 연관된 낮은 분자량 단백질을 수송 도관 시스템이라고 복잡한 3 차원 구조를 형성하기 위해 podoplanin, 콜라겐과 세포 외 기질 (ECM) 단백질과 연결된 T 세포 영역에서 8 세정맥. 수지상 세포는 간질에 밀착되고 관형 콘으로 돌출 관찰 될 수있다duit 구조는 유체 샘플 8항원을 검출한다. 수지상 세포와 림프절 기질 세포 (TRC를 사용해 및 수정체 상피)의 상호 작용은 케모카인의 CCL21와 CCL19 9, 10의 출시와 프리젠 테이션에 의해 매개된다. CCL19와 CCL21은 림프절의 T 세포 영역 4,11로 이전 수지상 및 T 세포를 촉진 CCR7 수용체에 의해 인식됩니다. 비슷한 케모카인을 사용에도 불구하고, 수지상와 T 세포는 림프절 (12)에 서로 다른 이동 경로를 가지고있다. 나중에, 림프절 및 순수한 림프절 기질 세포의 분리의 소화 효소를 사용하여 기능적 연구는 상이한 림프절 간질 세포의 역할과 수지상 세포와 T / B 세포 6,13와 상호 작용하는 그들의 능력에 대해 수행 하였다. 우선, IFN-γ 생산 효과기 T 세포 및 림프절 기질 세포 사이의 크로스 토크는 보조 림프 기관 14-16에서 T 세포 반응과 확산을 저해하는 것으로 대사 산화 질소의 생산을 유도한다. 둘째, 림프 N송시 기질 세포는 IL-10 (17)의 생산을 통해 규제 DC 서브 세트들의 분화를 지원하기 위해, 및 IL-7의 제조 6,18 통해 나이브 T 세포의 항상성을 조절하는 것으로보고되었다. 셋째, 림프절 기질 세포의 TLR 발현은 간질 세포가 조직 손상 중에 방출 감염 또는자가 유래의 분자 신호에 민감한 것을 시사한다. 실제로, TLR3 폴리 리간드와 림프절 기질 세포의 치료 (I는 : C)의 결과, 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I 발현 및 공동 억제 분자 PD-L1의 상향 조절의 완만 한 상향 조절을 유도하고 있지만 보조 자극 분자 주변 조직의 극적인 변화는 식 (19) 항원. 몇몇 그룹은 림프절 기질 세포가 말초 조직 항원을 발현하고 자기 반응성 T 세포의 19,21-27 내성을 유도 보였다. 따라서, 림프절 기질 세포 및 다른 이동성 재 사이의 상호 작용을 이해sident 림프절 세포는 염증 동안에 활성 또는 면역 반응의 억제를 허용하는 새로운 표적 분자를 찾는 데 도움이 될 것이다. 따라서, 림프절의 발행 효소 분리의 구현이 필요하다.

이전에 게시 된 프로토콜은 낮은 기계적 스트레스 6,19,20와 콜라겐 기반의 효소 소화의 다른 조합을 사용합니다. 그러나 소화 효소 나 소화 효소의 상이한 조합을 가진 긴 인큐베이션 활성화 상태를 분석하고 새로운 림프절 기질 세포를 식별하기 위해 필요한 다양한 표면 분자를 저하 될. 간질 세포 분석의 유형에 따라, 링크 프로토콜 또는 프로토콜 플레쳐 더 적합 할 수도있다. 설명 된 절차에서 다소 짧은 효소 소화가 가능한 림프절 기질 세포 표면 마커의 열화를 최소화하기 위해 자동화 된 기계식 세분화와 결합된다. 이 절차는 재현성이 높은 절연을 가능하게하고낮은 변동성과 95 % 이상의 생존으로 림프절 간질 세포 집단의 차이. 갓 절연 림프절 기질 세포는 시험 관내에서 직접 작용 분석을 수행하는 기질 세포 라인의 표면 마커의 발현, 단백질 분석, 전사 연구뿐만 아니라 설정에 사용될 수있다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 비디오를 게시 및 프로토콜에서 모든 동물의 절차는 분할 한 기관 바젤 슈타 트, 스위스의 승인을 동물의 프로토콜에 따라 실시 하였다.

1 림프절 준비 및 소화

  1. 가열 플레이트 자석 교반기 37 ° C에 비커 초기 가열 물.
  2. 다음과 같은 기본 미디어를 준비 : DMEM 배지 (피루 베이트 제외) 2 % FCS로 보충, 1.2 mM의 염화칼슘 및 펜 / 연쇄상 구균 (페니실린의 100 단위, 스트렙토 마이신 100 μg).
  3. 사용하기 전에 모든 해부 도구를 소독.
  4. CO 2 질식 당 림프절 공여 쥐를 안락사 및 무균 적으로 림프절을 해부하다. 주위의 지방을 해부하지 마십시오. 참고 :이 프로토콜은 주변 피부 배수 림프절 (사타구니, 상완, 겨드랑이)에 최적화되어 있습니다.
  5. 2 ㎖의 차가운 얼음 기본적인 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 림프절을 놓습니다.
  6. 림프절 캘리포니아를 중단1 ML의 주사기에 고정이 25 G 바늘을 사용하여 psule.
  7. 1 밀리그램 / ㎖의 콜라게나 제 IV 및 40 μg / ml의 DNase의 I. 보충 된 750 ㎕의 배지를 함유 염기성 5 ㎖ 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브에 방해 림프절 조직을 이동시켜
  8. 각 튜브에서 하나의 멸균 자석 교반기를 추가합니다.
  9. 37 ° C로 비커에 넣어 튜브는 물을 예열하고 30 분 동안 느린 속도 (1 라운드 / 초)에서 튜브를 저어.
  10. 가열 플레이트 자석 교반기에서 튜브를 제거하고 림프절 조각이 정착 할 수 있습니다.
  11. 조심스럽게 "비 기질 세포"풍부한 뜨는을 제거합니다. 참고 : T, B, 수지상 세포와 CD45의 분석 경우 - gp38 - CD31가 - 예상된다 "비 기질 세포"부분을 저장합니다.
  12. 워시는 750 ㎕를 기본 매체로 한번 림프절 조직을 나머지. 참고 :이 단계는 면역 능력 마우스로 작업하는 경우에만 필요합니다.
  13. 림프절 조각이 정착하자.
  14. 제거비 기질 세포 부동 분수.
  15. 750 ㎕의 기본 매체가 3.5 mg을 보충 림프절 조각에 추가 / ㎖ 콜라게나 D 40 μg / ml의 DNase의 I.
  16. 다시 37 ° C가 들어있는 비커에 넣어 튜브는 물을 예열.
  17. 천천히 교반하면서 5 분 동안 림프절 조직 다이제스트.
  18. 피펫 및 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 10 회 700 μl를 혼합하여 해리하는 림프절 조직 조각. NOTE :이 소화를 향상시키기 림프절 조직을 방해.
  19. 37 ° C 예열 된 물을 다시 비커에 튜브를 놓습니다.
  20. 천천히 교반하면서 또 10 분간 다이제스트 림프절 조직 단편.
  21. 피펫에 의해 림프절 조직 조각을 해리하는 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 99 사이클 혼합.
  22. 단일 세포 현탁액의 유지 보수를 보장하기 위해 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 7.5 μl를 추가합니다.
  23. 파이프에 의해 해리하는 림프절 조직 절편tting 및 자동화 된 멀티 채널 피펫을 사용하여 최대한의 속도로 99 사이클 혼합.
  24. 750 ㎕의 기본 매체를 추가하고 70 μm의 나일론 메쉬를 통해 세포를 전달합니다.
  25. 원심 분리기 세포 현탁액 1500 XG에 5 분, 4 ° C에서.
  26. 간질 세포를 추가 분석을 위해 이제 사용될 수있다.

림프절 기질 세포의 2 염색

  1. 성공적 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포를 인식하는 항-CD45, 항 podoplanin (gp38), 항-CD31 항체의 조합을 사용한다.
  2. , 안티 gp38-PE (1 : 200), 항 CD31-APC (1 : 200) 100 ㎕를 HBSS의 2를 포함 : 라이브 / 죽은 추적기, 항 CD45-FITC (200 일)로 소화 림프절 조직을 품어 어둠 속에서 20 분 이상, 4 ° C에 대한 % FCS.
  3. 2 % FCS를 포함 HBSS의 5백리터를 추가 세포를 씻으
  4. 원심 분리기 세포 현탁액 1500 XG에 3 분, 4 ° C에서.
  5. 2 % FCS를 포함 HBSS 100 ㎕에 다시 일시 중지합니다.
  6. equipp 플로우 사이토에 염색 된 세포를 실행다음 광학 에드 : 여기까지 세 레이저를 소스 : 청색 (488 nm의, 공기 냉각, 20 mW의 고체 상태), 적색 (파장 633 nm, 17 mW의 헬륨 네온), 바이올렛 (405 나노 미터, 30 mW의 고체 상태) .
  7. 게이트 CD45 - 세포는 조혈 세포를 제외합니다.
  8. 게이트 단봉 (FSC-W) 및 살아있는 세포 (LIVE / DEAD 추적기) 이중선과 죽은 세포를 제외합니다.
  9. , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) 및 DN (gp38 - CD31 -) 세포 (그림 1 참조) - CD31 플롯 gp38는 TRC (gp38 + CD31)를 시각화합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

본 프로토콜로 인해 자동화 된 멀티 채널 피펫 기계 세분화에 짧은 소화 시간 (45 분 최대)로 링크 등., 2007 (6)에 의해 발표 된 수정 소화 프로토콜입니다. 또한, 상기 절차는, 더 표준화 상이한 림프절 기질 세포에 표면 마커의 열화를 최소화하고 동시에 하나 이상의 샘플의 처리를 허용한다.

의 콜라겐 IV와 콜라게나 D는 플레처 프로토콜 13에서 링크 프로토콜 6 현재 프로토콜 또는 콜라게나 P와 디스 파제는 림프절 기질 세포의 생존 능력을 유지하고, CD45, gp38 및 CD31 등 여러 가지 표면 마커의 소화를 아끼지. 테스트하려면 현재 프로토콜, 겨드랑이, 서혜부와 위팔 림프절을 제거하고, 자신들의 간질 세포를 분리하기 위해 절단되었다. CD45, gp38 및 CD31 발현의 분석은 C57BL / 6m에서 격리 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포의 존재를 입증얼음 (그림 1, 게이트 전략).

기계 스트레스는 소화하는 동안 림프절 기질 세포의 생존을 줄일 수 있습니다. 세 개의 서로 다른 프로토콜을 사용하는 간질 세포의 격리 부분 집단의 생존 능력을 비교하면, 이것은 생존율, 플레쳐 프로토콜의 상위 95 % 이상 이었지만, 현재 프로토콜 및 링크 프로토콜 (도 2a) 모두 낮은 것으로 보여 현재 프로토콜 쇼 나은 비록 BEC의 하위 집단에서 생존 한 다음 프로토콜을 연결합니다. 전체 세포의 수가 림프절 간질 세포 서브 세트들의 포스트 소화 회수하는 링크 프로토콜 및 플레쳐 프로토콜 (도 2a)와 현재 프로토콜에서 약간 더 높았다. 이러한 결과는 현​​재 프로토콜 발행 프로토콜 유사한 림프절 기질 세포의 생존 능력을 유지함을 보여준다. 세 프로토콜 사이의 주요 차이점은 표 1에 나열되어 있습니다.

표면 마커 유동 세포 계측법에 의해 림프절 기질 세포의 특성을 셀 소팅에 의해 그들을 분리하는 데 필요한 재. TRC를 사용해와 수정체 상피는 링크와 플레처 프로토콜 IA의 B, CD140a, CD80, PD-L1 및 CD40 발현을 위해 현재를 비교 하였다 통해입니다. 세 가지 프로토콜에 의해 기질 세포를 분리 한 후, 우리는 IA의 B, CD80, CD140a, PD-L1의 발현을 발견하고, CD40는 TRC를 사용해 및 수정체 상피 (그림 2B) 모두에서 CP 및 LP와 소화시 높았다. 이러한 결과는 콜라게나 IV와 D 일부 표면 분자의 분해 콜라 P와 디스 파제와보다 강한 것이 좋습니다.

이와 함께, 현재 프로토콜은 가능한 림프절 기질 세포 표면 마커의 열화를 최소화하기 위해 자동화 된 기계식 세분화 결합 짧은 소화를 포함한다.

"/>
C57BL / 6 마우스의 그림 1 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포 염색, 게이트 및 정량화. 림프 노드, 현재의 프로토콜에 따라 소화 TRC, LEC를 정의하는 CD45, gp38 및 CD31, / 라이브 죽은 염색했다 유동 세포 계측법에 의해 BEC 및 DN 세포. 데이터는 염색의 대표적인 결과를 보여줍니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림이
림프절 기질 세포의 그림 2 생존 및 표면 마커 식입니다. C57BL / 6 마우스의 림프 노드, 링크의 (LP)와 플레처의 프로토콜 (FP) 및 CD45, gp38 및 CD31 염색을 정의하기 위해 현재 (CP) 다음과 같은 소화했다 유동 세포 계측법.) Viabil하여 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포성만 및 라이브 / 죽은 염색 후 모든 림프절 기질 세포 개체군의 총 세포 수. B) IA (b)의 표면 발현 분석 (APC-Cy7), CD140a (N ≥ 5, 2 독립적 인 실험의 풀링 된 데이터는 막대는 SEM을 나타냅니다) (PerCP-Cy5.5), CD80 (PerCP-Cy5.5), PD-L1 (PE-Cy7) 및 TRC를 사용해에 CD40 (PE-Cy7) 및 수정체 상피 (N = 6 LP 및 CP에 대한 FP와 11 명에 대한 ,이 독립적 인 실험의 풀링 된 데이터는, 바)는 SEM을 나타냅니다. LEC-APC-Cy7에 대한 기하학적 MFI 자동 형광 값 : 324 ± 97, LEC-PECy7 : 163 ± 82.5, LEC-PerCpCy5.5 : 156 ± 36, TRC-APC-Cy7 : 349 ± 152, TRC-PECy7 : 117 . 121 ± 45 : TRC-PerCP-Cy5.5을 54 ± 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

현재 프로토콜 효소 현재 프로토콜 링크 프로토콜 효소 링크 프로토콜 Fletcher 프로토콜 효소 플레처 프로토콜
콜라겐 IV, DNase의 I 30 분, 37 ° C, 교반 콜라겐 IV, DNase의 I 30 분, 37 ° C 콜라겐 P, 디스 파제, DNase의의 I 20 분, 37 ° C는 5 분마다 반전
콜라게나 D, DNase의 I 5 분, 37 ° C, 교반에 resuspend 콜라게나 D, DNase의 I 20 분, 37 ° C 콜라겐 P, 디스 파제, DNase의의 I 10 분, 37 ° C는 30 초를 재현 탁
10 분, 37 ° C, 교반 콜라게나 D, DNase의 I 37 ° C는 완전 소화 될 때까지 매 10 분을 재현 탁 콜라겐 P, 디스 파제, DNase의의 I 37 ° C는 완전 소화 될 때까지 5 분마다 재현 탁
자동화 된 기계 재 부상

CP의 표 1 짧은 요약, LP는 FP 효소를 사용하고 프로토콜을 지원합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

림프절 기질 세포의 연구는 최근에 의한 소화 작용이 발행 프로토콜 6,13의 개발에 연구 초점이되었다. 두 프로토콜은 단일 림프절 간질 세포를 획득하기에 적절하지만, 소화 효소의 이용과 소화의 시간 차이가있다. 기질 세포와 그 표면 마커 효소 소화와 기계적 스트레스에 민감하기 때문에, 최적화 된 프로토콜이 필요합니다.

갓 해부 림프절에서 가능한 림프절 기질 세포의 분리는 표현형 및 기능 분석을 수행하기 위해 첫 번째 단계이다. 따라서 신중 안정된 온도에서 지시 된 시간 동안, 효소의 농도 다이제스트 정의하는 것이 중요하다. 두 소화 프로토콜 그러나 약간 긴 소화 단계, 6,13를 설명 하였다. 소화 시간을 줄이기 위해 기계적 세분화 포함하고 멀티 채널 피펫을 사용하여 표준화 하였다. 에 현재 프로토콜의 장점은 전자 따라서 소화 효소와의 배양 시간을 최소화, 45 분에서 기질 세포의 분리를 허용하는 것이다. 또한, 소화 동안 일정 교반 림프절 구조 분해 효소의 최적의 액세스를 허용한다. 또한, 소화 볼륨이 사용 효소의 양을 최소화 μL 750으로 감소시켰다.

과도한 기계적인 힘 꽉 접합을 방해하지만 동시에 세포 사망을 일으킬 수 있습니다. 이러한 이유로 우리는 다시 중단주기와 다른 분리 장치의 여러 가지 조합을 시험했다. 우리는 자동화 된 멀티 채널 피펫의 사용은 99 사이클이 애플리케이션 내 해리 수 있다는 발견; 세포에 일정한 압력을 적용하고이 최적의 생존 단일 세포 현탁액가 발생합니다. 4-6 샘플 혼합 림프절 기질 세포의 분리 시간을 줄이는 동시에 피펫 팅 될 수있다.

ontent "> 소화 프로토콜은 거의 모든 분자의 표면 발현을 유지할 갖는다. 인구 동종 또는 이종의 경우에만 이러한 방식으로 여러 마커 병용 염색 밝힐 수 예를 들어, 목록 BP-3, CD35의 사용 TRC의 gp38 + CD31 -. 수질 TRC (Sanjiv 루터, 개인 통신)의 시각화 및 격리를 할 수 있습니다 또한, 특성화를 잘 DN 분율이 더 α7 인테그린에 대한 양성 세포처럼 에르 + 세포와 혈관 주위 세포를 포함하는 것으로 분석되었다가 (7 검토 13). 따라서, 본 프로토콜은 공개 된 것들과 비교 하였다. 발행 것들에 비해 현재의 프로토콜을 얻었다 결과, 유사한 주파수 및 림프절 기질 세포의 수에 도시 된 바와 같이. 절연 TRC의 흥미롭게 주파수 및 번호 높은 전류 프로토콜보다 TRC 구조의보다 나은 분리를 제안 플레쳐 프로토콜을 사용하고,링크 프로토콜입니다. 또한, 각종 표면 분자의 발현은 플레쳐 프로토콜에 비해 현재 프로토콜 향상되었다. 소화 방법에서 이러한 차이는 림프절 기질 세포 연구 6,19,21에서 약간 다른 발현 양상에 대한 이유가 될 수 있습니다. 이 때문에 각 프로토콜의 장점은 다른 소화 프로토콜을 테스트하는 데 유용 할 수 있습니다. 플레처 프로토콜 전사 분석 가능한 세포의 높은 숫자의 분리를위한 유용 할 수 있습니다 동안 (말호 트라 등. 7에 발표 된) 현재 프로토콜은 표면 발현 분석을위한 더 나은 수 있습니다. 그러므로 세 소화 프로토콜을 비교하여 림프절 기질 세포의 분리 후 최적의 결과를 얻기 위해 중요 할 수 보완으로 간주되어야한다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29, (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10, (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200, (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8, (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13, (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192, (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198, (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12, (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12, (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6, (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6, (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21, (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210, (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207, (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32, (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207, (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120, (24), 4772-4782 (2012).
쥐과 림프절 기질 세포의 분리
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter