Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

doi: 10.3791/51803 Published: August 19, 2014
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lenf düğümleri, yabancı ve öz-antijenlere karşı adaptif immün yanıtları başlatılan ve koordine özelleşmiş bölmeleri bulunmaktadır. Burada sunulan prosedür lenf düğümü, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve çeşitli moleküllerinin yüzey ekspresyonunu korumak uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin erişmek için kullanılan otomatik mekanik pipetleme ile birlikte kısa bir enzimatik sindirim açıklanmaktadır.

Lenf nodu stromal hücre üç önemli fonksiyonları lenf nodu iskele oluşturacak ve yerine: ilk onlar vücut sıvıları antijenleri, patojenleri ve onların patojen ilişkili moleküler pattern (PAMP) yanı sıra, sitokinler ve tehlike ilişkili moleküler model örnek filtre (Damps) mevcut Vücutta. İkincisi, etkileşim ve adaptif immün yanıtları başlatmak için antijen sunan hücreler (APC) ve lenfositler çekmek ve talimat; ve üçüncüsü, lenfosit 1 homeostası farklılaşması için yapısal bir ortam sağlamak-3. Inflamasyon lenf düğümü, stromal hücreleri büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinlerin üretimi sırasında, dendritik hücreler (DCler) arasındaki etkileşimi düzenlemek ve böylece, T-ve B-hücrelerinin adapte şişme. Bağışıklık tepkilerinin düzenleme, farklı stromal hücre popülasyonları tarafından meydana getirilen kompleks yapısal mimarisine mümkündür.

Lenf nodülü hücreleri, stromal, CD45 negatif hücrelerdir ve fibroblastik ve endotel hücreleri 1 -6 'de CD31 ile gp38 ifadesi ya da ayırt edilebilir. CD31 + kan endotel hücreleri tanımlar (BEC) -, gp38 + CD31 + lenfatik endotel hücreleri (LIK), gp38 tanımlar: - Gp38 + CD31 (fibroblastik retikulum hücreleri de FRC olarak bilinen TRC) T bölgesi retiküler hücreleri tanımlar. Bundan başka, alt-popülasyonlarının tanımlanması diğer lenf nodu stromal hücrelerin varlığını ortaya çıkarmıştır. Gerçekten de, küçük bir perisit benzeri hücre popülasyonu içinde karakterize edilmiştirgp38 - CD31 - nüfus 7. Bu nedenle, izolasyon prosedürü adaptasyonu farklı lenf düğümü stromal hücrelerin fonksiyonel özelliklerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için avantajlıdır.

Lenf düğümü hücreleri, stromal sindirim geliştirilmesi önce lenf düğümü stromal hücrelerin doku çalışma bölümü ve mikroskopi kullanılarak yerinde gözlemlerle sınırlıydı protokolleri. Bununla birlikte, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar lenf düğümü stromal hücrelerin önemli özellikleri gösterdi. Lenf nodülü hücreleri, stromal yüksek endotelial lenf nodu subkapsüler sinüs lenf ve ilgili-düşük molekül kütlesi, protein nakil kanal sistemi olarak adlandırılan karmaşık bir 3 boyutlu bir yapı oluşturmak üzere podoplanin, kolajen ve hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile ilişkili T hücreleri bölgesinde 8 Venüller. DCler, stroma hücreleri ile yakın temas halinde olan ve boru şeklindeki con içine uzanan gözlemlenebilirDuit yapısı sıvı örneklemek ve antijenleri 8 algılamak için. DCler ile lenf düğümü stromal hücreler (Kızılay ve LECS) etkileşimi, kemokinler CCL21 ve CCL19 9,10 serbest bırakılması ve sunum aracılık eder. CCL19 ve CCL21 lenf nodu T hücre bölgesine 4,11 göç etmek DH'leri ve T hücrelerini kolaylaştırılması CCR7 reseptörü tarafından tanınır. Benzer kemokinlerle kullanarak rağmen, DC'ler ve T hücreleri lenf düğümlerine 12 içine farklı göç yolları var. Daha sonra, lenf düğümü ve saf lenf düğümü stromal hücrelerin izolasyonu enzimatik sindirim kullanılarak, fonksiyonel çalışmalar çeşitli lenf nodu stromal hücrelerin rolü DC'ler ve T / B hücreleri 6,13 ile etkileşim yetenekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, IFN-γ üreten efektör T hücrelerinin ve lenf düğümü stromal hücreler arasındaki karışma, ikincil lenfoid organların 14-16 T hücre yanıtları ve çoğalmasını azaltmak için gösterilen metabolit nitrik oksit üretimini indükler. İkinci olarak, lenf Kgazel stromal hücreler, IL-10, 17 üretimi ile düzenleyici DC alt kümelerinden farklılaşmasını desteklemek için ve IL-7 6,18 üretilmesi yoluyla saf T hücre homeostazının modüle bildirilmiştir. Üçüncü olarak, lenf düğümü stromal hücrelerde TLR sentezleme stromal hücreler, doku yaralanması sırasında ortaya çıkan bir enfeksiyon ya da kendi kendini moleküllerden türetilmektedir sinyale duyarlı olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, TLR3 poli ligandla lenf düğümü stromal hücrelerin tedavisi (I: C) ile sonuçlanan büyük histo-uyumluluk kompleksi sınıf I ve eş-ifade önleyici molekülün PD-L1 upregülasyonu mütevazı bir düzenlenişini uyarmaktadır değil, birlikte uyaran moleküllerin periferal dokuda dramatik değişiklikler ifadesini 19 antijenleri. Çeşitli gruplar, lenf düğümü, stromal hücreleri periferal doku antijenleri ifade eder ve kendinden reaktif T hücrelerinin 19,21-27 indüklenmesidir göstermiştir. Bu nedenle, lenf düğümü hücreleri ve diğer göçmen ve yeniden arasındaki etkileşimleri anlamaksident lenf düğümü hücreleri iltihap sırasında aktivasyonu ya da bağışıklık tepkilerinin bastırılması sağlamak için yeni bir hedef moleküller bulmak için yardımcı olacaktır. Bu nedenle, lenf düğümü yayınlanmış enzimatik ayırma uygulanması gereklidir.

Daha önce yayınlanmış protokoller düşük mekanik stres 6,19,20 ile kollajenaz tabanlı enzimatik sindirim farklı kombinasyonları kullanın. Bununla birlikte, sindirim enzimlerinin veya sindirim enzim farklı bir kombinasyonu ile uzun inkubasyon aktivasyon durumunu analiz etmek ve yeni lenf nodu stromal hücreleri tanımlamak için gereken çeşitli yüzey molekülleri düşürebilir. Stromal hücre analiz türüne bağlı olarak, bağlantı veya Protokol Protokol Fletcher daha uygun olabilir. Tarif edilen prosedürde, biraz daha kısa bir enzimatik sindirim uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey işaretleyici zararın en aza düşürülmesi için otomatik mekanik ayrıştırma ile bir araya getirilmektedir. Bu işlem, yüksek ölçüde tekrarlanabilir ayrılmasını sağlayan vedüşük değişkenlik ve% 95 daha fazla canlılığı ile lenf nodu stromal hücre popülasyonlarının ayrım. Taze olarak izole edilen lenf nodülü hücreleri, stromal, doğrudan in vitro fonksiyonel deneyleri gerçekleştirmek için, stromal hücreleri hatlarının yüzey markeri ekspresyonu, protein analizi ve transkripsiyon çalışmalar, hem de kurulması için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu görüntü yayını ve protokol, tüm hayvan prosedürleri Kanton Kurumu, Basel-Stadt, İsviçre tarafından onaylanan hayvan protokole uygun olarak yapılmıştır.

1. Lenf düğümleri Hazırlama ve Sindirim

  1. Isıtma plakası ile bir manyetik karıştırıcı üzerinde 37 ° C bir cam kapta Ön-ısıtma su.
  2. Aşağıdaki gibi temel Orta hazırlayın: DMEM ortamı (piruvat olmadan),% 2 FCS ile takviye edilmiş, 1.2 mM CaCl2 ve pen / strep (penisilin 100 birim, streptomisin, 100 ug).
  3. Kullanmadan önce tüm diseksiyon aletleri sterilize edin.
  4. CO 2 boğulma başına lenf nodu donör fareler Euthanize ve aseptik lenf düğümleri teşrih. Çevreleyen yağ teşrih etmeyin. NOT: Bu protokol periferik cilt-lenf düğümünde (inguinal, brakiyal, aksiller) için optimize edilmiştir.
  5. 2 ml buz soğukluğunda bazik ortam ihtiva eden steril bir Petri kabı, lenf düğümleri yerleştirin.
  6. Lenf nodu ca Disrupt1 ml şırınga sabit iki 25 G iğne kullanılarak psule.
  7. 1 mg / ml kollajenaz IV, 40 ug / ml DNAz I ile takviye edilmiş 750 ul Temel ortamı içeren 5 ml'lik bir polipropilen yuvarlak dipli tüp içinde kesintiye lenf nodu doku aktarın
  8. Her bir tüp bir manyetik karıştırıcı, steril ekleyin.
  9. 37 ° C ile çanak içinde yer tüpün artık su ısıtılır ve 30 dakika boyunca yavaş bir hızda (1 tur / sec) tüplerini karıştırın.
  10. Isıtma plakası ile manyetik karıştırıcı gelen tüp çıkarın ve lenf nodu fragmanları halledelim.
  11. Dikkatle "non-stromal hücre" zenginleştirilmiş süpernatant kaldırmak. NOT: T, B, dendritik hücreler ve CD45 analizi ise - gp38 - CD31 - öngörülen, "non-stromal hücreler" kısmını kaydedin.
  12. Yıkama 750 ul ortam maddesi ile bazik lenf düğümü dokusu kalmıştır. NOT: Bu adım, bağışıklık yetkin fareler ile çalışan sadece gereklidir.
  13. Lenf nodu fragmanları halledelim.
  14. Kaldırolmayan stromal hücre-yüzen fraksiyonu.
  15. 750 ul temel orta 3,5 mg ile takviye lenf nodu fragmanları Ekle / ml kollajenaz D ve 40 ug / ml Dnase I.
  16. Lütfen 37 ° C de içeren beher içinde yer tüpün artık su ısıtılır.
  17. Yavaş yavaş karıştırılırken buna 5 dakika boyunca lenf nodu dokusu Digest.
  18. Pipetleme ve çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 10 döngü boyunca 700 ul karıştırılarak Ayrık lemf nod dokusu parçalan olabilir. NOT: Bu sindirim geliştirmek için lenf nodu doku bozar.
  19. 37 ° C'ye ısıtılmış su ile tekrar beher tüpü yerleştirin.
  20. Yavaş yavaş karıştırılırken buna 10 dakika daha Özet lenf nodu dokusu parçalan olabilir.
  21. Pipetleme lemf nod dokusu parçaları parçalamak ve bir çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 99 çevrim için karıştırılması.
  22. Tek bir hücre süspansiyonu bakımı için, 0.5 M EDTA, 7.5 ul ekleyin.
  23. Boru itibariyle ayrılmış lemf nod dokusu parçalantting ve çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 99 çevrim için karıştırılması.
  24. 750 ul temel orta ekleyin ve 70 mikron naylon örgü ile hücrelere geçerler.
  25. Santrifüj Hücre süspansiyonu 1500 xg'de 5 dakika, 4 ° C.
  26. Stromal hücreler, bundan başka analizler için de kullanılabilir.

Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin 2. Boyama

  1. Başarılı bir şekilde TRC LEC BEC DN hücreleri tanıyan anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31 antikorlarının bir kombinasyonu kullanılır.
  2. Anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200), 100 ul HBSS içinde 2 ihtiva eden: Canlı / Ölü izleyici, bir anti-CD45-FITC (200 1) ile sindirilmiş lenf düğümü dokusu inkübe karanlıkta en az 20 dakika, 4 ° C,% FCS için.
  3. % 2 FCS ihtiva eden HBSS 500 eklenmesinin Hücreleri yıkamak
  4. Santrifüj Hücre süspansiyonu 1500 xg'de 3 dakika, 4 ° C.
  5. % 2 FCS içeren HBSS 100 ul yeniden askıya.
  6. Equipp bir akış sitometresinde boyalı hücrelerin çalıştırınAşağıdaki optik ile ed: uyarma kadar üç lazer ile kaynak: mavi (488 nm, hava soğutmalı, 20 mW katı hal), kırmızı (633 nm, 17 mW HeNe), mor (405 nm, 30 mW katı hal) .
  7. Kapısı CD45 - hücreler hematopoietik hücreleri hariç.
  8. Kapısı mayoları (FSC-W) ve canlı hücreleri (CANLI / DEAD izci) ikilileri ve ölü hücreleri hariç.
  9. , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) ve DN (gp38 - CD31 -) hücreleri (Şekil 1) - CD31 vs Arsa gp38 TRC (gp38 + CD31) görselleştirmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mevcut protokol nedeniyle bir çok kanallı otomatik pipet ile mekanik çözümlemesiyle kısa bir sindirim süre (45 dk maksimum) ile Bağlantı ve ark., 6, 2007 tarafından yayınlanan bir modifiye sindirim protokoldür. Buna ek olarak, işlem, daha standart, farklı lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey markerlerinin bozulmasını en aza indiren ve aynı anda birden fazla numunenin kullanılması mümkün olur.

Collagenasein IV ve Kollagenaz D Fletchers protokolünde 13 Bağlantılar protokol 6 ve geçerli protokol veya Kollagenaz P ve Dispase lenf nodu stromal hücreler canlılığını korumak ve CD45, gp38 ve CD31 dahil olmak üzere birçok yüzey belirteçlerinin sindirimini yedek. Test etmek için geçerli protokol, koltuk altı, kol ve kasık lenf nodülü düğümleri çıkarıldı ve stromal hücreleri izole etmek için sindirilmiştir. CD45, gp38 ve CD31 ekspresyonunun analizi, C57BL / 6 m izole TRC LEC BEC DN hücrelerinin varlığını gösterdibuz (Şekil 1, yolluk strateji).

Mekanik gerilim, sindirim sırasında lenf düğümü stromal hücrelerin canlılığını azaltabilir. Üç farklı protokolleri kullanarak stromal hücrelerin izole alt popülasyonlarının canlılığı karşılaştırıldığında, canlılığı, Fletcher protokolde daha yüksek% 95 idi, ama Akım protokolü ve Link protokolü (Şekil 2A) hem de daha düşük olduğu bulundu Şu protokol gösteri daha iyi olmasına rağmen BEC subpopülasyonu sağkalım sonra protokol bağlayın. Toplam hücre sayısı lenf nodu stromal hücre alt sonrası sindirimi kurtarıldı Link protokolü ve Fletcher protokolü (Şekil 2A) ile karşılaştırıldığında Akım protokolde biraz daha yüksek oldu. Bu sonuçlar Geçerli protokol yayınlanmış protokollere benzer lenf nodu stromal hücrelerin canlılığını koruduğunu göstermektedir. Üç protokol arasındaki temel farklar Tablo 1'de listelenmiştir.

Yüzey işaretleri bir flow sitometri ile lenf nodu stromal hücreleri karakterize etmek ve hücre sıralama onları izole etmek için yeniden gerekli. Kızılay ve LECS Link ve Fletcher protokolleri IA b, CD140a, CD80, PD-L1 ve CD40 ifade Cari karşılaştırıldı yoluyla izole. Diğer üç protokol de stromal hücrelerin izole edilmesi sonra, IA b, CD80, CD140a, PD,-L1 bir anlatım, CD40 ve Kızılay LECS (Şekil 2B) hem CP ve LP ile sindiriminden sonra daha yüksek olmuştur. Bu sonuçlar, kollajenaz IV ve D bir yüzeyi moleküllerinin parçalanması Kolajenaz P ve dispaz ile daha az güçlü olduğunu göstermektedir.

Birlikte ele alındığında, mevcut protokol uygulanabilir lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey işaretleyici zararın en aza düşürülmesi için otomatik bir mekanik ayrıştırma ile birlikte kısa bir sindirim içerir.

"/>
C57BL / 6 farelerden Şekil 1. TRC, LIK, BEC ve DN hücreler boyanması, yolluk ve ölçümü. Lenf düğümleri, mevcut protokolü aşağıdaki sindirilir ve TRC, LEC tanımlamak için CD45, gp38 ve CD31, / Canlı Dead ile boyandı flow sitometri ile BEC ve DN hücreler. Veri boyamanın temsili sonuçlar göstermektedir. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2
Lenf düğümü stromal hücrelerin Şekil 2. canlılığı ve yüzey markör ifade., C57BL / 6 farelerinden alınan Lenf düğümleri, Bağlanma (LP) ve Fletcher protokolü (AP) ve CD45, gp38 ve CD31 ile lekelenmiş tanımlamak için Akım (CP) aşağıdaki sindirildi Akış sitometri. A) Viabil tarafından TRC, LIK, BEC ve DN hücrelerSığ ve Canlı / Ölü boyandıktan sonra tüm lenf nodu stromal hücre alt toplam hücre sayısı. B) IA b yüzey ifadesinin Analizi (APC-Cy7), CD140a (n ≥ 5, 2 bağımsız deneyler birleştirilmiş veri, çubuklar SEM temsil) (PerCP Cy5.5 @), CD80 (PerCP Cy5.5 @), Pd-L1 (PE-Cy7) ve Kızılay CD40 (PE-Cy7) ve LECS (n = 6 LP ve CP AP ve n = 11 , 2 bağımsız deneyin verileri toplanmış, barlar) SEM temsil eder. LIK-APC-Cy7 için geometrik MFI oto-floresan değerleri: 324 ± 97, LIK-PECy7: 163 ± 82.5, LIK-PerCpCy5.5: 156 ± 36, TRC-APC-Cy7: 349 ± 152, TRC-PECy7: 117 . 121 ± 45: TRC-PerCP Cy5.5 54 ± resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şu Protokol-Enzimler Akım-protokol Link Protokolü-enzimler Link-protokol FLetcher Protokol-enzimler Fletcher-protokol
Kollajenaz IV, Dnaz i 30 dakika, 37 ° C'de, karıştırma işlemi Kollajenaz IV, DNAse I 30 dakika, 37 ° C Kolajenaz P Dispase, DNAse I 20 dakika, 37 ° C, 5 dakikada bir ters
Kolajenaz D Dnaz i 5 dakika, 37 ° C, karıştırma, tekrar süspansiyon Kolajenaz D DNAaz ben 20 dakika, 37 ° C Kolajenaz P Dispase, DNAse I 10 dakika, 37 ° C, 30 saniye tekrar süspansiyon
10 dakika, 37 ° C'de, karıştırma işlemi Kolajenaz D DNAaz ben 37 ° C'de, tam sindirim kadar her 10 dakikada bir yeniden süspanse Kolajenaz P Dispase, DNAse I 37 ° C'de, tam sindirim kadar her 5 dakika tekrar süspansiyon haline getirin
Otomatik, mekanik olarak yeniden süspansiyonun

CP Tablo 1. Kısa özetleri, LP, FP enzimler kullanılır ve protokolleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lenf nodu stromal hücrelerin çalışması nedeniyle son zamanlarda yayımlanmış iki sindirim protokolleri 6,13 gelişimine bir araştırma odağı haline geldi. Her iki protokol tek bir lenf düğümü stromal hücreler elde etmek için yeterli, ancak sindirim enzimlerinin kullanılması ve sindirim zaman içinde farklılık gösterir. Stromal hücreler ve onların yüzey belirteçleri enzimatik sindirim ve mekanik strese karşı hassas olduğu için, optimize edilmiş bir protokol gereklidir.

Taze kesilmiş lenf düğümünden uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin izolasyonu fenotipik ve işlevsel analiz gerçekleştirmek için ilk adımdır. Bu nedenle, dikkatli bir şekilde bir sabit sıcaklıkta ve belirlenen süre içinde, enzim tarafından belirlenen konsantrasyonu ile sindirmek için önemlidir. Ki sindirim protokolleri ancak oldukça uzun sindirim adımlarla, 6,13 tarif edilmiştir. Sindirim süresini azaltmak için, mekanik parçalanma dahil ve çok kanallı pipet kullanarak standardize edilmiştir. Açık mevcut protokolün avantajları E bu nedenle sindirim enzimleri ile inkübasyon zamanı en aza indirmek, sadece 45 dakika içinde stromal hücrelerin izole edilmesine izin verir olmasıdır. Buna ek olarak, sindirim sırasında sabit karıştırma lenf nodu yapısına sindirim enzimlerinin uygun erişim sağlar. Ayrıca, sindirim hacmi kullanılan enzim miktarı en aza indirgenmektedir ul 750 düşürülmüştür.

Aşırı mekanik kuvvet sıkı bağlantıları bozar ve aynı zamanda hücre ölümüne neden olabilir. Bu nedenle biz yeniden süspansiyon döngüleri ve farklı ayrışma cihazların çeşitli kombinasyonları test. Biz bir çok kanallı otomatik pipet kullanımının 99 döngülerinin 2 uygulamalarda ayrışma sağlayan bulundu; hücrelere sabit bir basınç uygular ve bu en iyi yaşayabilirliği ile tek bir hücre süspansiyonu ile sonuçlanacaktır. Dört ila altı numune karıştırılmış ve lenf nodu stromal hücre izolasyon süresini azaltmak, aynı zamanda pipetlenebilir.

ontent "> sindirim protokolü hemen hemen tüm moleküllerin yüzey ekspresyonunu korumak için vardır;. nüfusu, homojen veya heterojen ise, ancak bu şekilde çeşitli işaretler ile birlikte boyama ortaya çıkarabilir Örneğin kan basıncının-3 ve CD35 kullanımı TRC gp38 + CD31 -. medüller TRC (Ebru Luther, kişisel iletişim) görselleştirme ve izolasyon sağlar Ayrıca, kötü karakterize DN fraksiyon daha α7 integrin için pozitif hücrelerin gibi Aire + hücreleri ve perisit içeren olarak karakterize edildi (7'de yorumlanan 13). Dolayısıyla, mevcut protokolü yayınlanmış olanlar ile karşılaştırılmıştır. yayınlanmış olanlara kıyasla, mevcut protokolü ile elde edilen sonuçlar, benzer sıklıkta ve lenf nodu stromal hücrelerin sayı gösterildiği gibi. izole TRC İlginç bir şekilde, frekans ve numara En Güncel protokolde daha TRC yapıların daha iyi ayrışmasını düşündüren Fletcher protokolünü kullanarak veBağlantı protokolü. Ayrıca, çeşitli yüzey moleküllerinin ifade Fletcher protokolüne kıyasla Mevcut protokolü ile geliştirilmiştir. Sindirim yönteminde bu farklılıklar lenf nodu stromal hücre çalışmalarında 6,19,21 biraz farklı ekspresyon modelleri için nedeni olabilir. Çünkü her protokolün avantajları farklı sindirimi protokolleri test etmek yararlı olabilir. Fletcher protokol transkripsiyon analizi için canlı hücre sayısının yüksek izolasyonu için yararlı olabilir iken (Malhotra ve ark. 7 yayınlanan gibi) Cari protokolü, yüzey ifade analizi için daha iyi olabilir. Bu nedenle her üç sindirim protokolleri karşılaştıran lenf nodu stromal hücrelerin izolasyonundan sonra en iyi sonuçları elde etmek için önemli olabilir ve tamamlayıcı olarak görülmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM LifeTechnologies-Gibco 41965-039
FCS Final concentration 2%
CaCl2 Sigma 499609 Final concentration 1.2 mM
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation >160 units per mg dry weight, use at final concentration of 1 mg/ml
Collagenase D Roche 11088882001 use at 3.5 mg/ml
DNAse I Roche  11284932001 use at 40 µg/ml
Stiring magnets FAUST 5 mm long-2 mm ø
Polystyrene round bottom tubes 5 ml Falcon-BD Bioscience
Magnetic stirrer with heating function IKA-RCT-standard 9720250
Petri dishes 100 mm, sterile TPP 6223201
25 G needles Terumo
anti mouse CD45 Ab Biolegend Clone 30-F11
anti mouse CD11c Ab Biolegend Clone N418
anti mouse Podoplanin Ab Biolegend Clone 8.1.1
anti mouse CD31 Ab Biolegend Clone MEC13.3

Eppendorf Xplorer plus, Multichannel
Eppendorf 4861 000.821/830 1.250 µl max. volume
anti mouse CD140a Biolegend Clone APA5
anti mouse CD80 Biolegend Clone 16-10A1
anti mouse CD40 Biolegend Clone 1C10
anti mouse I-Ab Biolegend Clone AF6-120.1
anti mouse CD274 (PD-L1) Biolegend Clone 10F.9G2
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell stain kit Invitrogen L10119

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
  2. Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29, (1), 23-43 (2011).
  3. Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nature Reviews Immunology. 10, (12), (2010).
  4. Bajénoff, M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 25, (6), 989-1001 (2006).
  5. Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes. The Journal of experimental medicine. 200, (6), 783-795 (2004).
  6. Link, A., et al. Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells. Nature Immunology. 8, (11), 1255-1265 (2007).
  7. Malhotra, D., et al. Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks. Nature Immunology. 13, (5), 499-510 (2012).
  8. Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex. The Journal of experimental medicine. 192, (10), 1425-1440 (2000).
  9. Sixt, M., et al. The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node. Immunity. 22, (1), 19-29 (2005).
  10. MartIn-Fontecha, A., et al. Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming. The Journal of experimental medicine. 198, (4), 615-621 (2003).
  11. Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (23), 12694-12699 (2000).
  12. Braun, A., et al. Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration. Nature Immunology. 12, (9), 879-887 (2011).
  13. Fletcher, A. L., et al. Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells. Frontiers in immunology. 2, 35 (2011).
  14. Lukacs-Kornek, V., et al. Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes. Nature Immunology. 12, (11), 1096-1104 (2011).
  15. Siegert, S., et al. Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide. PLoS ONE. 6, (11), e27618 (2011).
  16. Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. Regulation of T cell priming by lymphoid stroma. PLoS ONE. 6, (11), e26138 (2011).
  17. Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells. Immunity. 21, (6), 805-816 (2004).
  18. Onder, L., et al. Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation. The Journal of experimental medicine. 210, (3), 465-473 (2013).
  19. Fletcher, A. L., et al. Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions. The Journal of experimental medicine. 207, (4), 689-697 (2010).
  20. Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm. Trends in Immunology. 32, (1), 12-18 (2011).
  21. Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207, (4), 681-688 (2010).
  22. Lee, J. -W., et al. Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self. Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).
  23. Nichols, L. A., et al. Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes. J Immunol. 179, 993-1003 (2007).
  24. Gardner, J. M., et al. Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells. Science. 321, 843-847 (2008).
  25. Gardner, J. M., et al. Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells. Immunity. 39, 560-572 (2013).
  26. Magnusson, F. C., et al. Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity. Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).
  27. Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120, (24), 4772-4782 (2012).
Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).More

Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803, doi:10.3791/51803 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter