Introduction
Olfactory dysfunktion är kopplad till ett antal neurodegenerativa störningar inklusive Parkinsons sjukdom (PD), Alzheimers sjukdom och Huntingtons sjukdom 1. I PD, lukt nedskrivningar inkluderar underskott i lukt identifiering, spårning, och diskriminering och finns i upp till 70-95% av patienterna 2-5. Dessa underskott kan föregå de kardinal motoriska symtomen vid PS med upp till 4 år, vilket tyder på att lukt dysfunktion kan signalera ett tidigt skede av PD 6-10. Den tidiga förekomsten av lukt underskott i PD har lett till ett stort intresse för lukt dysfunktion och de bakomliggande mekanismerna. I prekliniska studier på gnagare, kan lukt dysfunktion vara en känslig effektmått för att förutsäga den terapeutiska potentialen av nya terapeutiska strategier.
Många tester har utformats och i stor utsträckning används för att karaktärisera sensomotoriska funktionsnedsättningar i gnagarmodeller av PD och test den terapeutiska potentialen av nya behandlingar 11-15. Även om lukt underskott är väl dokumenterade i PD, luktfunktion har inte rutinmässigt i många modeller. Denna uppfattning förändras dock med upptäckten av genetiska former av PD och mer accepterat föreställningen att PD är en systemisk sjukdom som drabbar mer än bara sensomotorisk funktion. För närvarande finns det många studier i genetiska musmodeller av PD och andra neurodegenerativa sjukdomar som nu omfattar analys av lukt i karakteriseringen 16-24. Med tanke på det växande intresset för lukt dysfunktion i neurodegenerativa sjukdomar, försökte vi sätta ihop ett batteri av lukttest som kan användas för att karakterisera nya modeller av neurodegeneration samt testa potentiella sjukdomsmodifierande terapier i prekliniska studier. De tester som beskrivs i den aktuella studien har använts i både karakterisering och prekliniska studier 18,25.
Testerna highlighted i denna studie har visat sig vara känsliga för att upptäcka lukt dysfunktion i en ofta utnyttjad alfa-synuklein överuttryck musmodell av Parkinsons sjukdom 18. De innefattar det begravda pelleten testet 26,27, en anpassad version av blocket testet 23,24,28,29 och tillvänjning / dishabituation testet 30. Det är viktigt att notera att det finns flera anpassningar av de prov som beskrivs i denna studie som är känsliga mått på lukt funktion i möss, de som lyfts fram i denna studie är testerna vårt laboratorium har mest erfarenhet och rutinmässigt använda.
Protocol
Alla steg i protokollet följer djurvård och använda riktlinjer och regler som av IACUC vid universitetet i Cincinnati.
1. Allmänna överväganden
- Om möjligt, testa mössen under sin aktiva fasen i mörkret cykeln. Normalt utför tester i svagt ljus och minst 1 timme i den mörka cykeln. Men om testning i mörker cykel inte är genomförbar, utföra alla tre tester under den ljusa cykeln. Tänk på att sniffa tider kan minska när möss testas under sin sömncykel. OBS: Även om testerna kan utföras under sömncykel mössen kan visa mindre intresse för den begravda pellets, block eller doftande kassett.
- För att minska eventuella effekten av utomstående luktsignaler, ha en bas par handskar hela tiden under varje test och sedan placera en ren par handskar över baspar för varje mus och varje prövning. Som en allmän regel, när du är osäker, sätta på en ren uppsättning handskar. Har en låda med handskar lästily tillgängliga eftersom de kommer att bytas ofta. OBS: Vi använder nitrilhandskar för alla djurhantering.
- Rengöring testmaterial och burar mellan individer med ett desinfektionsmedel / steriliseringsmedlet är också ett viktigt steg i denna batteri av tester för att minska risken för att sprida sjukdomar samt undanröja oönskade luktsignaler.
2. Buried Pellet Test
- Minst två dagar före testning, notera vikten av varje mus och sedan mat Begränsa till 90% av kroppsvikten. Före provning och under mat begränsning, ger varje mus 1-2 stycken av pellets som skall användas under provningen (t.ex. en bit sötad spannmål). Hoppa inte över detta steg eftersom möss är neophobic med mat och får inte söka efter pelleten under testet, om de inte har ätit pelletsen tidigare.
- På alla testdagar, vänja mössen för 1 timme före provning genom att placera sin bur i provningsrummet utan vattenflaska eller matare bin. hus dem i deras hem bur med bara en filter övre lock.
- Under tillvänjning, fylla en ren mus bur ~ 3 cm hög med rena sängkläder att göra vissa att strö är jämnt fördelade över buren. Ställ in en timer för 5 min.
- Efter 1 timme av tillvänjning, begrava en sötade flingor pellets 0,5 cm nedanför strö så att den inte syns.
- Ta bort test musen från sitt hem buren, placera den i mitten av prov buren, placera filtertopplocket på buren och starta timern.
- Stoppa timern när musen avtäcker pelleten och börjar äta den. Notera tiden för att avslöja begravda pellet.
- Om musen inte hittar pelleten inom 5 minuter, avsluta rättegången och notera en poäng på 300 sek för denna mus. Flytta pelleten till toppen av sängkläder så musen har tillgång till det och gör musen att äta pelleten.
- Efter rättegången, tillbaka musen till sitt hem bur.
- Töm strö från test buren och rengör cålder med djurrummet rengöringslösning.
- Upprepa steg från 2,4 till 2,9 för varje mus, och byta handskar före och efter varje mus.
- Efter alla möss testas, ger dem bara tillräckligt med mat för att hålla dem på 90% kroppsvikt.
- Utför testa dag 2-5 på samma sätt som testdag 1 med ett undantag; begrava pelleten i en annan plats i buren för varje försök.
- På testa dag 6, utför ytan pellets rättegången.
- För ytan pellets rättegången, följer samma procedur för testdag 1 men i stället för att gräva ner pelleten under strö placera den på toppen av sängkläder. Anteckna tiden för musen för att hitta och börja äta pellets.
3. Blocktest
- Individuellt hus möss i rena burar och placera 5 block i buren (märkt AE), byta handskar innan du ställer in varje bur.
- Utför testet 24 timmar senare. Flytta testmöss till testområdet, ta bort vattenflaska och matar bin, och placera all 5 block från buren tillsammans med en handfull av sängkläder i en plastpåse märkt med djurets identifiering. Placera förseglad plastpåse ovanpå musens hembur.
- Vänja djuren i deras hem buren utan vattenflaska, matarkorgen och block 1 timme före testning.
- Byt handskar mellan varje bur så att dofterna inte utbyts mellan djur / block.
- Rada upp musen burar bredvid varandra på ett bord med minst 10 cm mellan varje bur. Placera en videokamera så att framsidan av buren (inte den långa sidan av buren) är i fri sikt.
- Ställ in timern i 30 sekunder och märker ett kort med de viktiga experiment detaljerna (datum, mus-ID, recensioner, etc.). Videoband etiketten för 2-3 sek.
- Ta bort block AD från plastpåsen med den musens identifiering och placera dem i mitten av buren så att de syns tydligt på videokameran. Se till att det finns ~ 1 cm of utrymme mellan vart och ett av blocken. Placera filter topp tillbaka på buren. Starta timern och videoband för 30 sek.
- Efter 30 sekunder, stoppa inspelningen och ta bort block från buren och placera dem tillbaka i plastpåsen.
- Byt handskar och sedan gå vidare till nästa mus, upprepa samma procedur som används för den första rättegången. Gör detta för totalt 6 försök för varje mus som gör att det finns en inter rättegången intervall ~ 5 min.
- Den 7: e försöket, följ samma procedur för försök 1-6 utom i stället för att placera blocket D från musen egen bur lägga blockera E från en annan mus bur så att musen utsätts för block A, B och C från dess eget hem bur och blockera E från en annan mus bur. Notera i labbet bok vars blocket E varje mus utsätts för och suppleant där blocket E placeras i varje mus bur (t.ex. ABCE eller AEBC). Ta kvarter E från en mus av samma kön, men inte från ett original cagemate. Vi-deotape för 30 sek.
- Efter 7 försök, tillbaka djur till en ny ren bur med sina ursprungliga cagemates. Rena block som används i testet med ett milt rengöringsmedel och vatten och låt lufttorka för att användas i senare tester.
4. Tillvänjning / Dishabituation
- Utför tillvänjning / dishabituation prov på ett liknande sätt till blocktestet men istället för att använda block som har lukt av en mus, använd vävnad patroner rymmande bomull parfymerade med olika par av extrakt.
- Följ steg 3,1-3,4 med en enda, oparfymerad vävnadskassett i stället för blocken.
- Vänja möss i testrummet.
- Förbered doftande vävnadskassetter i ett separat rum. Placera en liten bomullstuss i en ren patron och sedan lägga till 5 l av extrakt (t.ex. mandel extrakt) i bomull. Snäpp fast patronen toppen över bomull och plats i en särskild låda eller påse märkt med denna doft.
- Gör samma procedur feller en andra doft (t ex, anis extrakt). Byt handskar mellan hantering av olika dofter. Se till att bomullstuss är helt innesluten i vävnaden patronen. OBS: Exposed fibrer från bomullstuss kan orsaka djuret att ha intresse av bomullstuss för häckande ändamål snarare än doften i sig.
- Följ sedan stegen 3,6-3,10 använda någon doftande vävnad kassett för de första sex försöken, och det andra doftande vävnadskassett för sjunde försöket.
5. Analys av videoband
- För blocket och tillvänjning / dishabituation tester, har en bedömare blind för experimentell skick mäta tid sniffa varje block, med sniffning definieras som nasal kontakt med det blocket. Om så önskas mäter andra beteenden såsom tid att närma sig romanen blocket (E) under Trial 7 och total aktivitet (antalet förflyttningar längs längden och bredden på buren) under varje försök. Betyg tiden sniffa end tid att närma sig från videobandet med hjälp av ett stoppur.
- På liknande sätt, för tillvänjning / dishabituation testet ha en rater blind för försöksbeting mäta den tid som tillbringas sniffning patronen, tid att närma patronen, och rörelseaktivitet.
6. Statistik
- Analysera begravda pellets test med icke-parametriska statistik eftersom latensen att hitta pelleten poäng tenderar att visa heterogenitet varians. Medelvärdet latensen att lokalisera pelleten över dagarna 3-5 och sedan jämföra mellan grupper av möss med användning av ett Mann-Whitney U-test. Likaså för ytan pelleten delen av testet, analysera latens att hitta pelleten med användning av ett Mann-Whitney U-test för att jämföra genotyper.
- För blocktestet, analysera data från Trial 7 (införande av romanen doftande blocket). Vanligtvis använder icke-parametriska analyser att redovisa heterogenitet varians. För att analysera skillnader i tid sniffa the roman blocket samt tid att närma blocken för olika försöksgrupper, använd av Mann-Whitney U-test. Använd Wilcoxon Signed Rank test för att jämföra tid sniffa romanen blocket till tid sniffa de välbekanta blocken.
- För tillvänjning / dishabituation test analyserar beteende parametrisk på försök 1, 6 och 7, som liknar tidigare studier 20. Om möss uppvisar liten eller ingen sniffning, använder icke-parametriska analyser.
Representative Results
De nedgrävda pellets, blockera och tillvänjning / dishabituation tester är alla mycket fördelaktiga utvärderingar av doftsinnet hos möss. Med hjälp av dessa tester har vi funnit betydande förändringar i lukt i flera modeller genetisk mus för Parkinsons sjukdom, inklusive alfa-synuklein överuttryck (Thy1-asyn) 18 och Atp13a2 knockoutmöss. Båda Thy1-asyn och Atp13a2 knockoutmöss tar längre tid att hitta den begravda pellets än kontroller 18. Figurerna 1-3 visar data från vildtyp och Atp13a2 knockoutmöss. I begravda pelletstestet, visar Atp13a2 knockoutmöss ökad latens för att hitta den begravda pellets jämfört med vildtyp kontrollmöss (Figur 1). I blocktestet både vildtyp och Atp13a2 knockoutmöss sniffa romanen kvarter från en annan mus bur jämfört kvarter från sitt eget hem bur (Figur 2). I tillvänjning / dishabituation testet vildtyp möss visar tillvänjning till en lukt och sedan ökas sniffning när en roman lukt införes (figur 3).
Figur 1 Buried pelleten test. Latens för att hitta pelleten i vildtyp (n = 10) och Atp13a2 KO (n = 14) vid 20 till 27 m av ålder. * P <0,05, Mann-Whitney U.
Figur 2 Blocktestet Time sniffa romanen blocket (E) i blocket testet i vildtyp (n = 10) och Atp13a2 KO (n = 12) honmöss vid 20 -. 27m ålder. ΔΔ betecknar p <0,01 jämfört med block A, B och C från samma genotyp. Mann-Whitney U.
"Src =" / filer / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3 Tillvänjning / dishabituation test. Medeltid sniffa en doftande patron i vildtyp möss (9 m ålder, n = 7) över 6 försök och införandet av en patron med en ny doft på prov 7.
Discussion
Var och en av de provningar som beskrivs i denna studie mäter olika aspekter av luktfunktion hos möss. Den begravda pelletstestet mäter maten motivationen aspekten av lukt, testa förmågan för hungriga (livsmedel begränsad, inte mat berövade) möss för att upptäcka en välsmakande bit av sötad spannmål begravd under sängar. Blocket test mäter mer om den sociala aspekten av luktfunktion, testa förmågan hos möss för att skilja mellan sin egen doft och det av en conspecific. Den tillvänjning / dishabituation Testet bedömer förmågan hos musen att diskriminera mellan bekanta och nya, oskadliga dofter. Använda flera tester är viktigt när kännetecknar en ny modell, eftersom avvikelser i livsmedels motivation eller rädsla kan bidra till skillnader som observerats i muterade möss jämfört med kontroller. Till exempel, om bara block testet utförs och minskade sniffa på blocket som har lukten av en annan mus observeras, är det oklart om det finns ett olfactory underskott eller ett förstärkt rädsla svar på konspecifikt som kan leda till undvikande av detta block. När flera tester utförs och underskott observeras i alla tester, stöder starkt en tolkning av luktnedsättning. Om skillnader kan observeras i bara ett test, men inte de andra så kan det finnas en mer subtil luktnedsättning, men det kommer att bli nödvändigt att utesluta andra förklaringar (dvs ökad rädsla eller reducerad mat motivation). Andra viktiga faktorer att tänka på när man testar luktfunktions möss inkluderar bakgrunds stam och kön av möss. Olika genetiska bakgrunds stammar (dvs. C57BL / 6, DBA, etc.) kan få långtgående effekter på mus beteende därför rekommenderas att anpassa varje protokoll i vildtyp möss av samma bakgrund innan du utför hela experimentet. Det rekommenderas också att manliga och kvinnliga möss testas separat från varandra eftersom det manliga luktsystemet är högly känslig för kvinnor i estrous och lukt upptäckt av en kvinna i estrous kan störa prestanda i alla tre testerna.
Vissa steg är helt avgörande för att följa när man testar olfaction i möss. Det är viktigt att vara medveten om de lukter försöksledaren introducerar till djuren. Att bära handskar för förfarandena är viktigt och frekvent byte av handskar mellan djur krävs. Det är alltid en god praxis för försöksledaren inte bära cologne eller parfym på lukttestdagar. Medan vissa delar av förfarandet är oflexibla, det finns andra delar som kan ändras och anpassas utan att giltigheten eller testets känslighet. Exempelvis kan ökas antalet tillvänjnings prövningar eller minskas beroende på den stam av möss som testas och hur snabbt de vänja till de stimuli. Den huvudsakliga begränsningen av dessa tester är att de är alla drivna av någon form av motivation, vara det livsmedel eller socialt, vilket gördet svårt att helt utesluta avvikelser i motivation som en förklaring när en förändrad respons observeras. Detta kan minimeras genom att analysera ytterligare parametrar, såsom aktivitet under testning och tid att närma stimuli.
När behärskar, kan testerna enkelt användas vid prövningen av fenotypen av nya musmodeller av neurodegenerativ sjukdom. Dessutom kan de prov som har den högsta effekt inkluderas i prekliniska studier testa potentiella terapeutiska medel (till exempel se ref. 25).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cap'n Crunch | Quaker Oats | 30000065310 | |
| Wooden Blocks | Lara's Crafts | 10144 | |
| Almond Flavor Extract | Kroger | 011110664716 | |
| Anise Flavor Extract | Kroger | 011110615619 | |
| Banana Flavor Extract | Kroger | 011110669919 | |
| Coconut Flavor Extract | Kroger | 011110669889 | |
| Lemon Flavor Extract | Kroger | 011110669957 | |
| Orange Flavor Extract | Kroger | 0011110669964 | |
| Tissue Cartridges | Sigma-Aldrich | Z672122-500EA | Manufactured by Simport no: M490-2 |
| Cotton Balls | Kroger | 11110793119 | |
| Mouse Cages | Ancare | 19 x 29 x 12.7 cm | |
| Camcorder | Sony | HDR-HC9 | |
| MiniDV Tapes | Sony DVC premium | 27242523432 | 60 minute long play |
References
- Hawkes, C. Olfaction in neurodegenerative disorder. Adv. Otorhinolaryngol. 63, 133-151 (2006).
- Ward, C., Hess, W., Calne, D. Olfactory impairment in Parkinson's disease. Neurology. 33, 943-946 (1983).
- Doty, R., Stern, M., Pfeiffer, C., Gollomp, S., Hurtig, H. Bilateral olfactory dysfunction in early stage treated and untreated idiopathic Parkinson's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 55, 138-142 (1992).
- Doty, R., Deems, D., Stellar, S. Olfactory dysfunction in parkinsonism: a general deficit unrelated to neurologic signs, disease stage, or disease duration. Neurology. 38, 1237-1244 (1988).
- Tissingh, G., et al. Loss of olfaction in de novo and treated Parkinson's disease: possible implications for early diagnosis. Movement Disorders. 16 (1), 41-46 (2001).
- Montgomery, E., Baker, K., Lyons, K., Koller, W. Abnormal performance on the PD test battery by asymptomatic first-degree relatives. Neurology. 52, 757-762 (1999).
- Berendse, H., et al. Subclinical dopaminergic dysfunction in asymptomatic Parkinson's disease patients' relatives with a decreased sense of smell. Ann. Neurol. 50 (1), 34-41 (2001).
- Ponsen, M., Stoffers, D., Booij, J., van Eck-Smit, B., Wolters, E., Berendse, H. Idiopathic hyposmia as a preclinical sign of Parkinson's disease. Ann. Neurol. 56, 173-181 (2004).
- Langston, J. The Parkinson's complex: parkinsonism is just the tip of the iceberg. Ann. Neurol. 59 (4), 591-596 (2006).
- Ross, G., et al. Association of olfactory dysfunction with risk for future Parkinson's disease. Ann. Neurol. 63, 167-173 (2008).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein. J. Neurosci. 24, 9434-9440 (2004).
- Fleming, S., Ekhator, O., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. J. Vis. Exp. , e50303 (2013).
- Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of DA neurons in parkinsonism: Optimizing behavioral assessment of outcome. Central Nervous System Diseases. , 131-151 (2000).
- Whishaw, I., O'Connor, W., Dunnett, S. The contributions of motor cortex, nigrostriatal dopamine and caudate-putamen to skilled forelimb use in the rat. Brain. 109 (5), 805-843 (1986).
- Schwarting, R., Huston, J. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Prog Neurobiol. 49 (3), 215-266 (1996).
- Glasl, L., et al. Pink1-deficiency in mice impairs gait, olfaction and serotonergic innervation of the olfactory bulb. Experimental Neurology. 235, 214-227 (2012).
- Kim, Y., Lussier, S., Rane, A., Choi, S., Andersen, J. Inducible dopaminergic glutathione depletion in an α-synuclein transgenic mouse model results in age-related olfactory dysfunction. Neuroscience. 172, 379-386 (2011).
- Fleming, S., Tetreault, N., Mulligan, C., Huston, C., Masliah, E., Chesselet, M. Olfactory deficits in mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein. The European Journal of Neuroscience. 28 (2), 247-256 (2008).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136 (2), 412-432 (2013).
- Macknin, J., Higuchi, M., Lee, V., Trojanowski, J., Doty, R. Olfactory dysfunction occurs in transgenic mice overexpressing human tau protein. Brain Res. 1000, 174-178 (2004).
- Lazic, S., et al. Olfactory abnormalities in Huntington's disease: decreased plasticity in the primary olfactory cortex of R6/1 transgenic mice and reduced olfactory discrimination in patients. Brain Res. 1151, 219-226 (2007).
- Wesson, D., Wilson, D., Nixon, R. Should olfactory dysfunction be used as a biomarker of Alzheimer's disease? Expert Review of Neurotherapeutics. 10 (5), 633-635 (2010).
- Taylor, T., Caudle, W., Miller, G. VMAT2-deficient mice display nigral and extranigral pathology and motor and nonmotor symptoms of Parkinson's disease. Parkinsons Dis. 2011, 124-165 (2011).
- Tillerson, J., Caudle, W., Parent, J., Gong, C., Schallert, T., Miller, G. Olfactory discrimination deficits in mice lacking the dopamine transporter or the D2 dopamine receptor. Behav. Brain Res. 172, 97-105 (2006).
- Fleming, S., et al. A pilot trial of the microtubule-interacting peptide (NAP) in mice overexpressing alpha-synuclein shows improvement in motor function and reduction of alpha-synuclein inclusions. Mol. Cell. Neurosci. 4, 597-606 (2011).
- Crawley, J. What's Wrong with My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , Wiley-Liss. NY. (2000).
- Nathan, B., Yost, J., Litherland, M., Struble, R., Switzer, P. Olfactory function in apoE knockout mice. Behav. Brain Res. 150, 1-7 (2004).
- Spinetta, M. A simple and sensitive odor recognition test for rats and mice detects retrograde amnesia caused by ethanol or other drugs that interfere with memory consolidation. Society for Neuroscience. , Washington, D.C. (2005).
- Spinetta, M., et al. Alcohol-induced retrograde memory impairment in rats: prevention by caffeine. Psychopharmacology. 201 (3), 361-371 (2008).
- Bielsky, I., Hu, S., Szegda, K., Westphal, H., Young, L. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice. Neuropsychopharmacology. 29, 483-493 (2004).
