Introduction
Olfaktorisk dysfunktion er knyttet til en række neurodegenerative sygdomme, herunder Parkinsons sygdom (PD), Alzheimers sygdom og Huntingtons sygdom 1. I PD, olfaktoriske nedskrivninger omfatter underskud i lugt identifikation, detektion og diskrimination og findes i op til 70-95% af patienterne 2-5. Disse underskud kan forud kardinalen motoriske symptomer på PD med op til 4 år, hvilket indikerer, at olfaktoriske dysfunktion kan signalere de tidlige stadier af PD 6-10. Den tidlige forekomst af olfaktoriske underskud i PD har ført til en stor interesse i olfaktoriske dysfunktion og de underliggende mekanismer, der er involveret. I prækliniske undersøgelser udført på gnavere, kan olfaktoriske dysfunktion være en følsom resultat foranstaltning til at forudsige det terapeutiske potentiale af nye terapeutiske strategier.
Mange tests er blevet designet og flittigt brugt til at karakterisere sensomotoriske nedskrivninger i gnavermodeller af PD og til TESt det terapeutiske potentiale af nye behandlinger 11-15. Selvom olfaktoriske underskud er veldokumenterede i PD, olfaktoriske funktion er ikke blevet målt rutinemæssigt i mange modeller. Dette synspunkt ændrer dog med opdagelsen af genetiske former for PD og mere accepteret tanken om, at PD er en systemisk lidelse, der rammer mere end bare sensomotoriske funktion. I øjeblikket er der talrige undersøgelser i genetiske musemodeller af PD og andre neurodegenerative lidelser, der nu omfatter analyse af lugtesansen i karakteriseringen 16-24. I betragtning af den stigende interesse af olfaktoriske dysfunktion i neurodegenerative sygdomme, vi forsøgt at samle et batteri af olfaktoriske test, der kan anvendes til at karakterisere nye modeller af neurodegeneration samt teste potentielle sygdomsmodificerende behandlinger i prækliniske studier. De er beskrevet i nærværende undersøgelse test er blevet brugt i både karakterisering og prækliniske studier 18,25.
Testene highlighted i denne undersøgelse har vist sig at være følsom påvisning olfaktoriske dysfunktion i et hyppigt anvendt alfa-synuclein overudtrykker muse-model af Parkinsons sygdom 18. De omfatter den begravede pellet testen 26,27, en tilpasset version af blokken testen 23,24,28,29 og tilvænning / dishabituation test 30. Det er vigtigt at bemærke, at der er flere tilpasninger i de i denne undersøgelse test, der er følsomme foranstaltninger af olfaktoriske funktion i mus, dem fremhævet i denne undersøgelse, er testene vores laboratorium har den største erfaring med og rutinemæssigt bruger.
Protocol
Alle trin i protokollen følger dyret pleje og bruge retningslinjer og forordninger fastsat af IACUC fra University of Cincinnati.
1. Generelle overvejelser
- Hvis det er muligt, teste mus under deres aktive fase i mørke cyklus. Typisk udføre test under lav lys og mindst 1 time i den mørke cyklus. Men hvis afprøvning i mørke cyklus ikke er muligt, skal du udføre alle tre test i løbet af lys cyklus. Husk på, at snuse tider kan falde, når musene testes i løbet af deres søvn cyklus. BEMÆRK: Mens test kan gennemføres i løbet af søvn cyklus mus kan udvise mindre interesse i den begravede pille, blokerer eller duftende patron.
- For at reducere nogen effekt af eksterne olfaktoriske tidskoder, bære en base par handsker på alle tidspunkter i løbet hver test, og derefter placere et par rene handsker over basepar for hver mus og hvert forsøg. Som en generel regel, når de er i tvivl, sat på en ren sæt handsker. Har en kasse med handsker læseily tilgængelige, da de vil blive ændret hyppigt. BEMÆRK: Vi bruger nitrilhandsker for al håndtering af dyr.
- Rengøring testmaterialer og bure mellem forsøgspersoner med et desinfektionsmiddel / steriliseringsmiddel er også et vigtigt skridt i denne batteri af tests med henblik på at mindske risikoen for spredning af sygdom samt fjerne uønskede olfaktoriske signaler.
2. Begravet Pellet Test
- Mindst to dage før testning, registrerer vægten af hver mus og derefter mad begrænse til 90% af kropsvægten. Forud for prøvning og under mad begrænsning, giver hver mus 1-2 stykker af pillerne, der skal anvendes under prøvningen (f.eks et stykke sødet korn). Må ikke springe dette trin, fordi mus er neophobic med mad og kan ikke søge efter pillen under testen, hvis de ikke har spist pillerne tidligere.
- På alle testdage, vænne musene i 1 time inden prøvningen ved at placere deres bur i test værelse med ingen vand flaske eller arkføder Bi. huse dem i deres hjem bur med blot et filter låg.
- Under tilvænning, fylde en ren musebur ~ 3 cm høj med ren strøelse gøre visse strøelse er jævnt fordelt over hele buret. Sæt en timer i 5 min.
- Efter 1 time af tilvænning, begrave 1 sødet korn pille 0,5 cm under strøelse, så det ikke er synligt.
- Tag testen musen fra sit hjem bur, placere den i midten af testen bur, skal du placere filteret låg på buret og starte timeren.
- Stoppe timeren når musen afdækker pillen og begynder at spise det. Bemærk tid til at afdække den begravede pille.
- Hvis musen ikke finder pillen inden for 5 min, afslutte forsøget og notere en score på 300 sekunder for denne mus. Flyt Pellet toppen af strøelse så musen har adgang til den og lade den mus til at spise pellet.
- Efter retssagen, returnere musen til sit hjem bur.
- Tøm strøelse fra testen bur og rengør Calder med dyr rengøring løsning.
- Gentag trin 2,4-2,9 for hver mus, og ændre handsker før og efter hver mus.
- Efter alle mus testes, give dem lige nok mad til at opretholde dem på 90% af kropsvægten.
- Udfør teste på dag 2-5 på samme måde som test dag 1 med en enkelt undtagelse; begrave pellet i et andet sted i buret for hvert forsøg.
- På test dag 6, udføre overfladen pille retssagen.
- Til overfladen pille forsøget, skal du følge samme procedure for test dag 1, men i stedet for at begrave pillen under strøelse sted det på toppen af strøelse. Optag tiden for musen til at finde og begynde at spise pelleten.
3. Blok Test
- Individuelt husmus i rene bure og placere 5 blokke i buret (mærket AE), skiftende handsker før der etableres hvert bur.
- Udfør testen 24 timer senere. Flyt testmus til testområdet, fjern vandflaske og feeder bin og lægge all 5 gader fra buret sammen med en håndfuld af strøelse i en plastpose mærket med dyrets identifikation. Placer forseglet plastpose oven på musens hjembur.
- Vænne dyrene i deres hjem bur uden vandflaske, feeder bin, og blokke i 1 time før testning.
- Skift handsker mellem hver bur, så duftene ikke udveksles mellem dyr / blokke.
- Line up musen bure ved siden af hinanden på et bord med mindst 10 cm mellem hvert bur. Anbring et videokamera, således at den forreste del af buret (ikke den lange side af buret) er i klar visning.
- Indstil timeren til 30 sekunder og mærke et kort med de vigtige eksperiment oplysninger (tidspunkt, mus id, forsøg, etc.). Videobånd etiketten i 2-3 sek.
- Fjern blokke AD fra plastikposen med, at mus identifikation og placere dem i midten af buret, så de er klart synlige på videokamera. Sørg for at der er ~ 1 cm of mellemrum mellem hver af blokkene. Placer filteret toppen tilbage på buret. Starte timeren og videobånd i 30 sek.
- Efter 30 sek, stoppe optagelsen og fjerne blokke fra buret og læg dem tilbage i plastikposen.
- Skift handsker og derefter gå videre til den næste mus, gentage den samme procedure, der anvendes til den første retssag. Gør dette for i alt 6 forsøg for hver mus sikre, at der er en inter-retssagen interval på ~ 5 min.
- På den 7. retssag, skal du følge den samme fremgangsmåde for forsøgene 1-6 undtagen i stedet for at placere blok D fra musens eget bur tilføje blok E fra en anden mus bur, så musen er udsat for blokkene A, B og C fra dets eget hjem bur og blok E fra en anden mus bur. Bemærk i laboratoriet bog, hvis blok E hver mus udsættes for og suppleant hvor blok E er placeret i hver mus bur (f.eks ABCE eller AEBC). Tag blok E fra en mus af samme køn, men ikke fra en original cagemate. Videotape i 30 sek.
- Efter 7 forsøg returnere dyr til en ny ren bur med deres oprindelige cagemates. Rene blokke anvendt ved testen med mildt vaskemiddel og vand og lad dem lufttørre til brug i senere tests.
4. Tilvænning / Dishabituation
- Udfør tilvænning / dishabituation test på en måde svarende til blokken test, men i stedet for at anvende blokke, der har lugt af en mus, bruge væv patroner holder bomuld parfumeret med forskellige par af ekstrakter.
- Følg trin 3.1-3.4 hjælp af en enkelt, uparfumeret væv patron i stedet for blokkene.
- Vænne mus i test værelse.
- Forbered duftende væv patroner i et separat rum. Placer en lille stykke vat i en ren patron og derefter tilføje 5 ul ekstrakt (fx mandel ekstrakt) i bomuld. Snap patronen toppen over bomuld og sted i en dedikeret kasse eller pose mærket med denne duft.
- Gør det samme procedure feller en anden duft (f.eks anis ekstrakt). Skift handsker mellem håndtering af forskellige dufte. Sørg for, at vat er helt indkapslet i vævet patron. BEMÆRK: Udsat fibre fra bomuld bold kan forvolde dyret at have interesse i vat til redebygning formål snarere end duften selv.
- Følg derefter trin 3,6-3,10 ved hjælp af en duftende væv patron for de første seks forsøg, og den anden duftende væv patron for syvende forsøg.
5. Analyse af videobånd
- For blokken og tilvænning / dishabituation tests har en Rater blind for eksperimentel betingelse måle den tid sniffing hver blok, med snifning defineret som nasal kontakt med denne blok. Hvis det ønskes, at måle andre adfærd såsom tid til at nærme romanen blok (E) under Trial 7 og den samlede aktivitet (antallet af flytninger langs længden og bredden af hjemmet bur) under hvert forsøg. Score tidsforbruget sniffing end tid til at nærme sig fra videobånd ved hjælp af et stopur.
- Tilsvarende for tilvænning / dishabituation test, har en Rater blind for eksperimentel betingelse måle den tid sniffing patronen, tid til at henvende sig til patronen, og motorisk aktivitet.
6. Statistik
- Analyser begravet pille test med ikke-parametriske statistiske fordi latenstiden til at finde pillen scoringer tendens til at vise heterogenitet varians. Gennemsnittet latenstiden til at finde pillen tværs dage 3-5 og derefter sammenligne mellem grupper af mus ved anvendelse af en Mann-Whitney U-test. Tilsvarende for overfladen pelleten del af prøven, analysere latenstiden til at finde pelleten under anvendelse af en Mann-Whitney U-test til sammenligning af genotyper.
- For blok test, analysere data fra Trial 7 (indførelse af romanen-duftende blok). Typisk ansætte nonparametriske analyser til at redegøre for heterogenitet af varians. For at analysere forskelle i tidsforbrug sniffing the roman blok samt tid til at nærme blokkene for forskellige eksperimentelle grupper, skal du bruge Mann-Whitney U-test. Brug Wilcoxon Signed Rank test til at sammenligne tid sniffing romanen blok til tid sniffing de velkendte blokke.
- For tilvænning / dishabituation test, adfærd parametrisk analyser af forsøg 1, 6 og 7, der svarer til tidligere undersøgelser 20. Hvis mus udviser lidt at ingen sniffing bruge parametriske analyser.
Representative Results
De begravede piller, blok og tilvænning / dishabituation test er alle meget fordelagtige evalueringer af lugtesansen hos mus. Ved hjælp af disse tests, har vi fundet betydelige ændringer i lugtesansen i flere genetiske musemodeller for Parkinsons sygdom, herunder alfa-synuclein overudtrykkende (Thy1-aSyn) 18 og Atp13a2 knockout-mus. Både Thy1-aSyn og Atp13a2 knockout-mus tage længere tid at finde den begravede pille end kontrol 18. Figur 1-3 viser data indsamlet fra vildtype og Atp13a2 knockout-mus. I den begravede pellet test viser Atp13a2 knockout-mus forøget latens for at finde den begravede pille sammenlignet med vildtype-kontrolmus (figur 1). I blokken testen både vildtype og Atp13a2 knockout-mus sniffe romanen blok fra en anden mus bur i forhold til blokke fra deres eget hjem bur (figur 2). I tilvænning / dishabituation test vildtypemus viser tilvænning til en lugt og steg derefter sniffing når en ny lugt indføres (figur 3).
Figur 1. Buried pellet test. Latency at finde pellet i vildtype (n = 10) og Atp13a2 KO (n = 14) på 20-27 m alder. * P <0,05, Mann-Whitney U.
Figur 2. Blok testtid snuse romanen blok (E) i blok test i vildtype (n = 10) og Atp13a2 KO (n = 12) hunmus ved 20 -. 27m alder. ΔΔ repræsenterer p <0,01 i forhold til blokkene A, B og C fra den samme genotype. Mann-Whitney U.
"Src =" / filer / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Tilvænning / dishabituation test. Middeltid snuse en duftende patron i vildtypemus (alder 9 m, n = 7) på tværs af 6 forsøg og indførelse af en patron med en roman duft på anklagebænken 7.
Discussion
Hver af de i denne undersøgelse test måler forskellige aspekter af olfaktoriske funktion i mus. Den begravede pille test måler mad motivation aspekt af lugtesansen, at afprøve, om sultne (fødevarer begrænset, ikke mad berøvet) mus til påvisning af en spiselig stykke sødet korn begravet under sengetøj. Blokken test måler mere af det sociale aspekt af olfaktoriske funktion, teste evnen af mus til at skelne mellem deres egen duft og af en conspecifikt. Den tilvænning / dishabituation test vurderer evne af musen til at skelne mellem kendte og nye, uskadelige dufte. Brug af flere test er vigtig, når der kendetegner en ny model, fordi uregelmæssigheder i fødevarer motivation eller frygt kunne bidrage til observerede forskelle i mutant mus sammenlignet med kontrolgruppen. For eksempel, hvis kun blokken testen udføres og nedsat sniffing af blokken, der har lugt af en anden mus observeres, er det uklart, om der er en olfactory underskud eller en forøget frygt reaktion på conspecifikt som kan føre til undgåelse af denne blok. Når flere tests udføres og underskud overholdes i alle test, det støtter en fortolkning af olfaktoriske værdiforringelse. Men hvis der observeres forskelle i kun én test, men ikke de andre, så der kan være en mere subtil olfaktoriske nedskrivninger, men det vil være afgørende for at udelukke andre forklaringer (dvs. øget frygt eller reduceret mad motivation). Yderligere vigtige faktorer at huske på, når afprøvning olfaktoriske funktion mus omfatter baggrunden stamme og køn mus. Forskellige genetiske baggrund stammer (dvs. C57BL / 6, DBA, etc.) kan have dybtgående virkninger på museadfærd derfor anbefales det at tilpasse hver protokol i vildtype mus af den samme baggrund, før du udfører hele eksperimentet. Det anbefales også, at mandlige og kvindelige mus testes adskilt fra hinanden, fordi den mandlige olfaktoriske system er højly følsom over for kvinder i østrus og olfaktoriske påvisning af en kvinde i estrale kan interferere med performance i alle tre prøver.
Nogle af trinene er helt afgørende at følge, når test af lugtesansen hos mus. Det er vigtigt at være bekendt med lugte forsøgslederen er indfører dyrene. Iført handsker til de procedurer, der er afgørende, og hyppige skift af handsker mellem dyr er påkrævet. Det er altid en god praksis for forsøgslederen ikke at bære Köln eller parfume på lugtesansen testdage. Mens nogle dele af proceduren er ufleksible, er der andre dele, der kan ændres og tilpasses, uden at gyldigheden eller testens sensitivitet. For eksempel kan antallet af tilvænnings- forsøg forøges eller formindskes afhængigt af stammen af mus testes, og hvor hurtigt de vænne på stimuli. Den største begrænsning af disse tests er, at de alle er drevet af en form for motivation, det være sig fødevarer eller sociale, gørdet vanskeligt helt at udelukke uoverensstemmelser i motivation som en forklaring, når en ændret respons observeret. Dette kan minimeres ved at analysere yderligere parametre, såsom aktivitet under afprøvning og tid til at nærme stimuli.
Når mestrer, kan testene nemt bruges til at undersøge fænotypen af nye musemodeller for neurodegenerativ sygdom. Desuden kan de forsøg, der har den højeste effekt skal medtages i prækliniske studier teste potentielle lægemidler (for eksempel se ref. 25).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cap'n Crunch | Quaker Oats | 30000065310 | |
| Wooden Blocks | Lara's Crafts | 10144 | |
| Almond Flavor Extract | Kroger | 011110664716 | |
| Anise Flavor Extract | Kroger | 011110615619 | |
| Banana Flavor Extract | Kroger | 011110669919 | |
| Coconut Flavor Extract | Kroger | 011110669889 | |
| Lemon Flavor Extract | Kroger | 011110669957 | |
| Orange Flavor Extract | Kroger | 0011110669964 | |
| Tissue Cartridges | Sigma-Aldrich | Z672122-500EA | Manufactured by Simport no: M490-2 |
| Cotton Balls | Kroger | 11110793119 | |
| Mouse Cages | Ancare | 19 x 29 x 12.7 cm | |
| Camcorder | Sony | HDR-HC9 | |
| MiniDV Tapes | Sony DVC premium | 27242523432 | 60 minute long play |
References
- Hawkes, C. Olfaction in neurodegenerative disorder. Adv. Otorhinolaryngol. 63, 133-151 (2006).
- Ward, C., Hess, W., Calne, D. Olfactory impairment in Parkinson's disease. Neurology. 33, 943-946 (1983).
- Doty, R., Stern, M., Pfeiffer, C., Gollomp, S., Hurtig, H. Bilateral olfactory dysfunction in early stage treated and untreated idiopathic Parkinson's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 55, 138-142 (1992).
- Doty, R., Deems, D., Stellar, S. Olfactory dysfunction in parkinsonism: a general deficit unrelated to neurologic signs, disease stage, or disease duration. Neurology. 38, 1237-1244 (1988).
- Tissingh, G., et al. Loss of olfaction in de novo and treated Parkinson's disease: possible implications for early diagnosis. Movement Disorders. 16 (1), 41-46 (2001).
- Montgomery, E., Baker, K., Lyons, K., Koller, W. Abnormal performance on the PD test battery by asymptomatic first-degree relatives. Neurology. 52, 757-762 (1999).
- Berendse, H., et al. Subclinical dopaminergic dysfunction in asymptomatic Parkinson's disease patients' relatives with a decreased sense of smell. Ann. Neurol. 50 (1), 34-41 (2001).
- Ponsen, M., Stoffers, D., Booij, J., van Eck-Smit, B., Wolters, E., Berendse, H. Idiopathic hyposmia as a preclinical sign of Parkinson's disease. Ann. Neurol. 56, 173-181 (2004).
- Langston, J. The Parkinson's complex: parkinsonism is just the tip of the iceberg. Ann. Neurol. 59 (4), 591-596 (2006).
- Ross, G., et al. Association of olfactory dysfunction with risk for future Parkinson's disease. Ann. Neurol. 63, 167-173 (2008).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein. J. Neurosci. 24, 9434-9440 (2004).
- Fleming, S., Ekhator, O., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. J. Vis. Exp. , e50303 (2013).
- Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of DA neurons in parkinsonism: Optimizing behavioral assessment of outcome. Central Nervous System Diseases. , 131-151 (2000).
- Whishaw, I., O'Connor, W., Dunnett, S. The contributions of motor cortex, nigrostriatal dopamine and caudate-putamen to skilled forelimb use in the rat. Brain. 109 (5), 805-843 (1986).
- Schwarting, R., Huston, J. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Prog Neurobiol. 49 (3), 215-266 (1996).
- Glasl, L., et al. Pink1-deficiency in mice impairs gait, olfaction and serotonergic innervation of the olfactory bulb. Experimental Neurology. 235, 214-227 (2012).
- Kim, Y., Lussier, S., Rane, A., Choi, S., Andersen, J. Inducible dopaminergic glutathione depletion in an α-synuclein transgenic mouse model results in age-related olfactory dysfunction. Neuroscience. 172, 379-386 (2011).
- Fleming, S., Tetreault, N., Mulligan, C., Huston, C., Masliah, E., Chesselet, M. Olfactory deficits in mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein. The European Journal of Neuroscience. 28 (2), 247-256 (2008).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136 (2), 412-432 (2013).
- Macknin, J., Higuchi, M., Lee, V., Trojanowski, J., Doty, R. Olfactory dysfunction occurs in transgenic mice overexpressing human tau protein. Brain Res. 1000, 174-178 (2004).
- Lazic, S., et al. Olfactory abnormalities in Huntington's disease: decreased plasticity in the primary olfactory cortex of R6/1 transgenic mice and reduced olfactory discrimination in patients. Brain Res. 1151, 219-226 (2007).
- Wesson, D., Wilson, D., Nixon, R. Should olfactory dysfunction be used as a biomarker of Alzheimer's disease? Expert Review of Neurotherapeutics. 10 (5), 633-635 (2010).
- Taylor, T., Caudle, W., Miller, G. VMAT2-deficient mice display nigral and extranigral pathology and motor and nonmotor symptoms of Parkinson's disease. Parkinsons Dis. 2011, 124-165 (2011).
- Tillerson, J., Caudle, W., Parent, J., Gong, C., Schallert, T., Miller, G. Olfactory discrimination deficits in mice lacking the dopamine transporter or the D2 dopamine receptor. Behav. Brain Res. 172, 97-105 (2006).
- Fleming, S., et al. A pilot trial of the microtubule-interacting peptide (NAP) in mice overexpressing alpha-synuclein shows improvement in motor function and reduction of alpha-synuclein inclusions. Mol. Cell. Neurosci. 4, 597-606 (2011).
- Crawley, J. What's Wrong with My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , Wiley-Liss. NY. (2000).
- Nathan, B., Yost, J., Litherland, M., Struble, R., Switzer, P. Olfactory function in apoE knockout mice. Behav. Brain Res. 150, 1-7 (2004).
- Spinetta, M. A simple and sensitive odor recognition test for rats and mice detects retrograde amnesia caused by ethanol or other drugs that interfere with memory consolidation. Society for Neuroscience. , Washington, D.C. (2005).
- Spinetta, M., et al. Alcohol-induced retrograde memory impairment in rats: prevention by caffeine. Psychopharmacology. 201 (3), 361-371 (2008).
- Bielsky, I., Hu, S., Szegda, K., Westphal, H., Young, L. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice. Neuropsychopharmacology. 29, 483-493 (2004).
