מבחני חוש הריח למודלי עכבר של ניווניות מחלות

Introduction

תפקוד לקוי של חוש הריח קשור למספר ההפרעות ניווניות כוללים מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר, ומחלת הנטינגטון ^1. בפ"ד, ליקויי חוש הריח כוללים גירעונות בזיהוי ריח, זיהוי, ואפליה ונמצאים בעד 70-95% מחולי ^2-5. גירעונות אלה יכולים להקדים את הסימפטומים מוטורי קרדינל של PD בשיעור של עד 4 שנים, מצביעים על כך שתפקוד לקוי של חוש הריח עשוי לאותת המוקדמים של PD ^6-10 השלבים. ההתרחשות המוקדמת של גירעונות חוש הריח בפ"ד הובילה לעניין רב בתפקוד הלקוי של חוש הריח והמנגנונים הבסיסיים מעורבים ב. במחקרים פרה במכרסמים, בעיות בתפקוד חוש הריח יכול להיות מדד תוצאה רגיש לחזות את הפוטנציאל הטיפולי של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות.

בדיקות רבות תוכננו ושימוש נרחב לאפיין ליקויים הסנסורית במודלים של מכרסמים של PD ולtest את הפוטנציאל הטיפולי של טיפולים חדשניים ^11-15. למרות גירעונות חוש הריח מתועדים היטב בPD, פונקצית חוש הריח לא נמדדת באופן שגרתי בדגמים רבים. השקפה זו משתנה אם כי עם הגילוי של צורות גנטיות של מחלת הפרקינסון והרעיון מקובל יותר שפ"ד הוא הפרעה מערכתית המשפיעה על יותר מאשר רק פונקציה הסנסורית. נכון לעכשיו, יש מספר רב של מחקרים בעכברי מודל גנטיים של מחלת הפרקינסון והפרעות ניווניות אחרות שכוללים כעת ניתוח של olfaction באפיון ^16-24. לאור ההתעניינות הגובר של בעיות בתפקוד חוש הריח בהפרעות ניווניות, ביקשתי להרכיב סוללה של בדיקות חוש הריח, שניתן להשתמש כדי לאפיין מודלים רומן של ניוון מוחיים, כמו גם טיפולי שינוי מחלה פוטנציאל מבחן במחקרים פרה. הבדיקות שתוארו במחקר הנוכחי נעשו שימוש בשני אפיון ומחקרים פרה ^18,25.

בדיקות highlighted במחקר זה הוכח להיות רגיש באיתור בעיות בתפקוד חוש הריח במודל של עכברי overexpressing אלפא סינוקלאין לעתים קרובות מנוצל למחלת פרקינסון ^18. הם כוללים את המבחן נקבר גלולה ^26,27, גרסה מותאמת של מבחן הבלוק ^23,24,28,29, ומבחן ההתרגלות / dishabituation ^30. חשוב לציין כי יש מספר עיבודים של הבדיקות שתוארו במחקר זה, כי הם אמצעים רגישים של תפקוד חוש הריח בעכברים, אלה מודגשים במחקר זה הם בדיקות המעבדה שלנו יש הכי הרבה הניסיון עם ומשתמשת באופן שיגרתי.

Protocol

כל הצעדים של פרוטוקול מעקב הטיפול בבעלי החיים ולהשתמש בהנחיות והתקנות שנקבעו על ידי IACUC של אוניברסיטת סינסינטי.

.1 שיקולים כלליים

1. במידת האפשר, לבדוק עכברים במהלך השלב הפעיל שלהם במחזור הכהה. בדרך כלל, לבצע בדיקה תחת אור נמוך ושעה לפחות 1 למחזור הכהה. עם זאת, אם בדיקה במחזור הכהה היא לא ריאלי, לבצע את כל שלוש הבדיקות במהלך מחזור האור. זכור כי מרחרחים פעמים עלול לגרום לירידה כאשר עכברים שנבדקו במהלך מחזור השינה שלהם. הערה: בעוד שניתן לבצע הבדיקות במהלך מחזור שנת העכברים עשויים להראות פחות עניין בגלולה נקברה, בלוקים, או מחסנית ריחנית.
2. על מנת להקטין את ההשפעה של רמזי חוש הריח בחוץ, ללבוש זוג בסיס של כפפות בכל העת לאורך כל בדיקה ולאחר מכן למקם זוג נקי של כפפות על זוג הבסיס לכל עכבר וכל ניסוי. ככלל, במקרה של ספק, לשים על סט נקי של כפפות. האם קופסא של כפפות לקרואily זמין כיוון שהם יהיו שונה בתדירות גבוהה. הערה: אנו משתמשים בכפפות ניטריל לכל הטיפול בבעלי החיים.
3. חומרי ניקוי בדיקה וכלובים בין נושאים עם חומר חיטוי / עיקור הסוכן הוא גם צעד חשוב בסוללה זו של בדיקות על מנת לצמצם את הפוטנציאל להפצת מחלה, כמו גם להסיר את רמזי חוש הריח לא רצויים.

מבחן גלולה קבור .2

1. לפחות יומיים לפני הבדיקה, להקליט את המשקל של כל עכבר ולאחר מכן מזון להגביל 90% ממשקל גוף. לפני הבדיקה ובמהלך הגבלת מזון, לתת לכל עכבר 1-2 חתיכות של כדורים לשימוש במהלך הבדיקה (למשל, פיסת דגנים ממותקים). לא לדלג על השלב הזה, כי עכברי neophobic עם אוכל ולא יכולים לחפש את הכדור במהלך הבדיקה אם הם לא אכלו את כדורים בעבר.
2. בכל ימי המבחן, להרגיל עכברים עבור שעה 1 לפני בדיקה על ידי הצבת את הכלוב שלהם בחדר הבדיקות עם לא בקבוק מים או מזין בב. ביתם בכלוב בבית שלהם רק עם מכסה העליון של מסנן.
3. במהלך התרגלות, למלא כלוב עכבר נקי ~ 3 סנטימטר גבוה עם מצעים נקיים ביצוע מסוימים המצעים מופץ באופן שווה לאורך כל הכלוב. להגדיר טיימר למשך 5 דקות.
4. בעקבות שעה 1 של התרגלות, לקבור 1 גלולה דגני 0.5 סנטימטר ממותק מתחת למצעים, כך שהוא אינו נראה לעין.
5. הסר את עכבר המבחן מהכלוב בבית שלה, למקם אותו במרכז כלוב המבחן, למקם את המכסה העליון של מסנן בכלוב ולהתחיל את הטיימר.
6. לעצור את שעון העצר כאשר העכבר חושף את גלולה ומתחיל לאכול אותו. שים לב לזמן לחשוף את גלולה נקברה.
7. אם העכבר אינו מוצא את גלולה תוך 5 דקות, בסופו של המשפט ולציין ציון של 300 שניות לעכבר ש. הזז את הכדור לחלק העליון של המיטה ולכן יש עכבר גישה אליו, ולאפשר לעכבר לאכול את הכדור.
8. בעקבות המשפט, להחזיר את העכבר לכלוב בבית שלה.
9. רוקן את המצעים מכלוב המבחן ולנקות את גגיל עם תמיסת ניקוי חדר בעלי החיים.
10. חזור על השלבים 2.4-2.9 לכל עכבר, ולשנות את הכפפות לפני ואחרי כל עכבר.
11. אחרי כל העכברים נבדקו, לתת להם מספיק מזון כדי לשמור אותם ב90% במשקל גוף.
12. תבצע את הבדיקות בימים 2-5 באותה צורה כמו היום מבחן 1 עם חריג אחד; לקבור את הכדור במקום אחר בכלוב לכל ניסוי.
13. ביום הבדיקה 6, לבצע את הניסוי גלולה משטח.
14. לניסוי גלולה המשטח, לפי אותו הנוהל ליום מבחן 1 אבל במקום לקבור את הכדור מתחת למקום זה במצעים על גבי המצעים. רשום את הזמן לעכבר כדי למצוא ולהתחיל לאכול את הכדור.

מבחן בלוק 3

1. בנפרד לשכן עכברים בכלובים נקיים ומניח 5 בלוקים בכלוב (שכותרתו AE), שינוי כפפות לפני הקמת כל כלוב.
2. בצע את שעה מבחן 24 מאוחר יותר. הזז עכברי מבחן לאזור הבדיקה, להסיר את סל בקבוק מים ומזין, ולמקם את אלl 5 בלוקים מהכלוב יחד עם קומץ של מצעים לתוך שקית פלסטיק שכותרתו עם זיהוי של בעל החיים. מניחים את שקית הפלסטיק האטום על גבי הכלוב בביתו של העכבר.
3. להרגיל את החיות בכלוב בבית שלהם בלי בקבוק המים, בן מזין, ובלוקים עבור שעה 1 לפני הבדיקה.
4. לשנות כפפות בין כל כלוב, כך שהריחות אינם מוחלפים בין בעלי חיים / בלוקים.
5. בשורה כלובי העכבר לצד זה על שולחן עם לפחות 10 סנטימטר בין כל כלוב. מקם מצלמת וידאו, כך שהחלק הקדמי של הכלוב (לא בצד של הכלוב הארוך) הוא בתצוגה ברורה.
6. כיוונת את הטיימר ל30 שניות ותווית כרטיס עם הפרטים החשובים הניסוי (תאריך, מזהה עכבר, משפט, וכו '). קלטת וידאו את התווית של 2-3 שניות.
7. להסיר בלוקים לספירה משקית הניילון עם זיהוי של העכבר ושלמקם אותם באמצע הכלוב, כך שהם נראים בבירור במצלמת הווידאו. ודא שיש ~ 1 סנטימטר oחלל f בין כל אחד מהגושים. הנח את החלק העליון של המסנן חזרה על הכלוב. התחל את הטיימר וקלטת וידאו ל30 שניות.
8. לאחר 30 שניות, לעצור את ההקלטה ולהסיר בלוקים מהכלוב ומניח בחזרה לשקית הניילון אותם.
9. לשנות כפפות ולאחר מכן לעבור לעכבר הבא, חוזר על אותו התהליך המשמש לניסוי הראשון. לעשות את זה עבור הסכום כולל של 6 ניסויים עבור כל עכבר כדי לוודא שיש מרווח בין משפט של ~ 5 דקות.
10. על המשפט ^ה -7, לפי אותו הנוהל לניסויים 1-6 למעט במקום הצבת הבלוק D מכלוב משלו של העכבר להוסיף E בלוק מהכלוב של עכבר אחר כך העכבר חשוף ללוקים, B, C ומשלה כלוב שלו בבית וE בלוק מהכלוב של עכבר אחר. שים לב בספר המעבדה הבלוק שE כל עכבר חשוף ולחלופי שבי E בלוק ממוקמת בכלוב של כל עכבר (למשל, ABCE או AEBC). קח E בלוק מעכבר מאותו המין, אך לא מcagemate מקורי. ויdeotape ל30 שניות.
11. בעקבות 7 הניסויים, לחזור בעלי חיים לכלוב נקי חדש עם cagemates המקורי שלהם. בלוקים נקיים המשמשים במבחן עם חומר ניקוי עדין ומים ולאפשר לאוויר יבש לשימוש בבדיקות מאוחרות יותר.

.4 הרגלה / Dishabituation

1. בצע את בדיקת ההתרגלות / dishabituation באופן דומה למבחן הבלוק אך במקום להשתמש בלוקים שיש לי הריח של עכבר, להשתמש במחסניות רקמה מחזיקות כותנה בניחוח זוגות שונים של תמציות.
2. בצע את הפעולות 3.1-3.4 שימוש במחסנית אחת, ללא בישום רקמה במקום בלוקים.
3. להרגיל עכברים בחדר הבדיקה.
4. הכן את מחסניות רקמה ריחנית בחדר נפרד. מניחים כדור צמר גפן קטן לתוך מחסנית נקייה ולאחר מכן להוסיף 5 μl של תמצית (למשל, תמצית שקדים) לכותנה. הצמד עליון מחסנית על הכותנה והמקום בתיבה ייעודית או בתיק שכותרתו עם ריח ש.
5. לעשות את אותו הדבר ו ההליךאו ריח שני (למשל, תמצית אניס). לשנות כפפות בין טיפול בריחות שונים. ודא כדור צמר גפן הוא עטוף לגמרי במחסנית הרקמה. הערה: חשוף סיבים מכדור צמר גפן עלולים לגרום לבעלי החיים יש עניין בכדור צמר גפן למטרות קינון ולא הריח עצמו.
6. לאחר מכן, בצע את הפעולות 3.6-3.10 באמצעות מחסנית אחת ריחנית רקמה בששת הניסויים הראשונים, ואת מחסנית הרקמה הריחנית השנייה לניסוי השביעי.

.5 ניתוח של סרטוני וידאו

1. לבלוק ובדיקות ההתרגלות / dishabituation, יש לי עיוור מדרג לתנאי ניסוי למדוד את המשך הזמן מרחרח כל בלוק, עם מרחרח מוגדר כמגע האף עם בלוק ש. אם תרצה, למדוד התנהגויות אחרות כגון זמן להתקרב לבלוק הרומן (E) במהלך ניסיון 7 ופעילות כוללת (מספר התנועות שנעשו לאורכה ורוחבה של כלוב בבית) במהלך כל ניסוי. ציון המשך הזמן מרחרחזמן ד להתקרב מקלטת הווידאו באמצעות שעון עצר.
2. בדומה לכך, לבדיקת ההתרגלות / dishabituation, יש לי עיוור מדרג לתנאי ניסוי למדוד את המשך הזמן מרחרח את המחסנית, הזמן להתקרב למחסנית, והפעילות של תנועה.

.6 סטטיסטיקה

1. לנתח את הבדיקה גלולה נקברה באמצעות סטטיסטיקה פרמטרית כי חביון למצוא גלולה ציונים נוטים להראות ההטרוגניות של שונות. ממוצע חביון לאתר את הכדור על פני ימים 3-5 ולאחר מכן להשוות בין קבוצות של עכברים באמצעות Mann-Whitney U-מבחן. באופן דומה, לחלק גלולה פני השטח של המבחן, לנתח חביון למצוא גלולה באמצעות Mann-Whitney U-מבחן כדי להשוות גנוטיפים.
2. לבדיקת הבלוק, לנתח את הנתונים מ7 משפט (הקדמה של הבלוק בניחוח הרומן). בדרך כלל, מעסיק ניתוחים פרמטרית לדין וחשבון על ההטרוגניות של שונות. על מנת לנתח את ההבדלים בזמן בילה מרחרח הבלוק רומן דואר כמו גם זמן לפנות ללוקים לקבוצות ניסוי שונים, להשתמש בMann-Whitney U-המבחן. השתמש בבדיקת דרגה חתומה Wilcoxon כדי להשוות את משך זמן מרחרח את בלוק הרומן לעת בילה מרחרח את הלוקים המוכרים.
3. למבחן ההתרגלות / dishabituation, פרמטרי התנהלות מנתח בניסויים 1, 6 ו -7, בדומה למחקרים קודמים ^20. אם עכברים להפגין לא מעט על מנת מרחרח, להשתמש ניתוחים פרמטרית.

Representative Results

גלולה, בלוק, ובדיקות ההתרגלות / dishabituation נקברו כל הערכות יתרון מאוד של olfaction בעכברים. באמצעות בדיקות אלה, מצאנו שינויים משמעותיים בolfaction במודלים מרובים עכבר הגנטי של מחלת פרקינסון, כוללים overexpressing אלפא סינוקלאין (Thy1-aSyn) ¹⁸ ועכברים נוקאאוט Atp13a2. שני עכברי נוקאאוט Thy1-aSyn וAtp13a2 להימשך זמן רב יותר כדי למצוא את גלולה נקברה בהשוואה לביקורות ^18. איורים 1-3 נתונים להראות שנאספו מעכברי wildtype ונוקאאוט Atp13a2. במבחן גלולה נקבר, עכברי נוקאאוט Atp13a2 להראות מוגברים חביון למצוא גלולה נקברה בהשוואה לעכברי wildtype שליטה (איור 1). בבדיקת בלוק שני wildtype והעכברים נוקאאוט Atp13a2 לרחרח בלוק הרומן מהכלוב של עכבר אחר בהשוואה לרחובות מהכלוב בבית שלהם (איור 2). בעכברי wildtype מבחן ההתרגלות / dishabituation להראות התרגלות לריח אחד ו לאחר מכן עלה מרחרחים כאשר ריח רומן הוא הציג (איור 3).

איור 1 קבור גלולה מבחן. חביון למצוא גלולה בwildtype (n = 10) וAtp13a2 KO (n = 14) בשעה 20-27 מ 'של גיל. * P <0.05, Mann-Whitney U.

מבחן בלוק איור 2 זמן מרחרח את בלוק הרומן (E) במבחן הבלוק בwildtype (n = 10) וAtp13a2 KO (n = 12) נקבות עכברים ב20 -. 27m של גיל. ΔΔ מייצג p <0.01 לעומת בלוקים, B, C ומאותו גנוטיפ. Mann-Whitney U.

"Src =" / קבצים / ftp_upload / 51,804 / "width =" 51804fig3highres.jpg 500 "/>
איור מבחן .3 הרגלה / dishabituation. זמן ממוצע מרחרח מחסנית ריחנית בעכברי wildtype (גיל 9 מ ', n = 7) על פני 6 ניסויים וכניסתה של מחסנית עם ניחוח רומן לדין 7.

Discussion

כל אחת מהבדיקות שתוארו במחקר זה למדוד היבטים שונים של תפקוד חוש הריח בעכברים. המבחן גלולה נקבר מודד את היבט המוטיבציה מזון של olfaction, בודק את היכולת של רעב (מזון המוגבל, לא נשללו מזון) עכברים כדי לזהות פיסת הדגנים ממותקים נקברו תחת מצעים טעימה. מבחן הבלוק מודד יותר של ההיבט החברתי של פונקצית חוש הריח, בדיקת היכולת של עכברים להבחין בין הריח שלהם וזה של conspecific. מבחן ההתרגלות / dishabituation מעריך את היכולת של העכבר כדי להפלות בין ריחות בלתי מזיקים מוכרים ורומן,. שימוש בבדיקות מרובות היא חשובה בעת אפיון מודל חדש, כי חריגות במוטיבציה מזון או פחד יכולות לתרום להבדלים שנצפו בעכברים שעברו מוטציה בהשוואה לקבוצת ביקורת. לדוגמא, אם רק מבחן הבלוק מתבצע וירידה ברחרוח של הבלוק שהריח של עכבר אחר הוא ציין, לא ברור אם יש olfactגירעון אורים או תגובת פחד משופרת לconspecific שעשויה להוביל להימנעות מבלוק ש. כאשר בדיקות מרובות מבוצעות וגירעונות הם נצפו בכל הבדיקות, זה מאוד תומך פרשנות של ירידת ערך חוש הריח. עם זאת, אם הבדלים הם נצפו במבחן אחד בלבד, אך לא לאחרים אז ייתכן שיש ירידת ערך חוש הריח עדינה יותר אבל זה יהיה חיוני כדי לשלול הסברים אחרים (כלומר, פחד משופר או מוטיבציה מזון מופחתת). גורמים חשובים נוספים שכדאי לזכור כאשר בודקים עכברי פונקצית חוש הריח כוללים מתח הרקע ומין של העכברים. זני רקע גנטי שונים (כלומר, C57BL / 6, DBA, וכו ') יכולים להיות השפעה עמוקה על התנהגות עכבר ולכן, מומלץ להתאים את כל פרוטוקול בעכברי wildtype מאותו הרקע לפני ביצוע הניסוי כולו. מומלץ גם שזכר ונקבות עכברים להיבדק בנפרד זה מזה בגלל מערכת חוש הריח הגברית היא גבוההly רגיש לנקבות בזיהוי ייחום וחוש הריח של נשים בייחום יכול להפריע לביצועים בכל שלושת המבחנים.

כמה צעדים קריטיים למעקב כאשר בודקים olfaction בעכברים. חשוב להיות מודע לריחות הנסיין מציג לבעלי החיים. לבישת כפפות לנהלים משתנה חיוני ותכוף של כפפות בין בעלי החיים נדרש. זה תמיד טוב להתאמן לניסוי לא ללבוש בושם או בושם בימי בדיקות olfaction. בעוד חלקים מסוימים של ההליך הם בלתי גמישים, יש חלקים אחרים שיכול להיות שונה ומותאמים, מבלי להקטין את תוקפו או רגישות של הבדיקה. לדוגמא, מספר מחקרי התרגלות ניתן להגדיל או להקטין בהתאם לזן של עכברים שנבדק וכמה מהר הם להרגיל לגירויים. המגבלה העיקרית של הבדיקות הללו היא שהם כולם מונעים על ידי צורה כלשהי של מוטיבציה, יהיה זה מזון או חברתי, מה שהופך אתזה קשה לשלוט לחלוטין את חריגות במוטיבציה כהסבר כאשר תגובה שינו נצפתה. זה יכול להיות ממוזער על ידי ניתוח פרמטרים נוספים, כגון פעילות במהלך בדיקה והזמן להתקרב גירויים.

ברגע שמשתלט עליו, הבדיקות יכולות לשמש בקלות בבדיקת הפנוטיפ של דגמי עכבר רומן של מחלה ניוונית של מערכת עצבים. בנוסף, הבדיקות שיש בכח הגבוה ביותר ניתן לכלול במחקרים פרה בדיקת תרופות פוטנציאליות (לדוגמא ראה נ"צ. 25).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cap'n Crunch	Quaker Oats	30000065310
Wooden Blocks	Lara's Crafts	10144
Almond Flavor Extract	Kroger	011110664716
Anise Flavor Extract	Kroger	011110615619
Banana Flavor Extract	Kroger	011110669919
Coconut Flavor Extract	Kroger	011110669889
Lemon Flavor Extract	Kroger	011110669957
Orange Flavor Extract	Kroger	0011110669964
Tissue Cartridges	Sigma-Aldrich	Z672122-500EA	Manufactured by Simport no: M490-2
Cotton Balls	Kroger	11110793119
Mouse Cages	Ancare		19 x 29 x 12.7 cm
Camcorder	Sony	HDR-HC9
MiniDV Tapes	Sony DVC premium	27242523432	60 minute long play