Introduction
嗅覚機能障害は、パーキンソン病（PD）、アルツハイマー病、およびハンチントン病1を含む多くの神経変性疾患にリンクされている。 PDでは、嗅覚障害は匂いの識別、検出、および識別の欠損を含み、患者2-5 70〜95％までに見ている。これらの赤字は、嗅覚機能障害は、PD 6-10の初期段階をシグナリングすることができることを示す、最大4年までのPDの基本的運動症状に先行することができる。 PDにおける嗅覚赤字の早期発生が嗅覚機能障害に強い関心と関与機序につながっている。げっ歯類での前臨床試験では、嗅覚機能障害は、新たな治療戦略の治療可能性を予測するための高感度アウトカム指標である可能性があります。
多くの試験が設計され、広くPDのげっ歯類モデルにおいて、およびTESに感覚障害を特徴付けるために使用されている小説の治療11-15の治療可能性をトン。嗅覚赤字はよくPDに文書化されていますが、嗅覚機能は、日常的に多くのモデルで測定されていません。このビューは、PDおよびPDだけで感覚運動機能よりも多くの影響を与える全身性疾患であることがより定説の遺伝的な形態の発見でも変化しています。現在、今特性評価16-24で嗅覚の分析を含む、PDおよび他の神経変性疾患の遺伝的マウスモデルにおける多数の研究があります。神経変性疾患における嗅覚障害の関心の高まりを考えると、私たちは前臨床試験では、神経変性の新規モデルとしてだけでなく、テストの潜在的疾患修飾治療を特徴付けるために使用することができる嗅覚検査のバッテリーを組み立てるように努めた。本研究で説明したテストは、特性評価および前臨床研究18,25の両方に使用されている。
テストhighlこの研究でightedは、パーキンソン病18の頻繁に利用されるα-シヌクレイン過剰発現マウスモデルにおける嗅覚機能不全を検出するのに敏感であることが示されている。彼らは埋もれペレットテスト26,27、ブロック試験23,24,28,29の適応バージョン、および馴化/脱馴化試験30が含まれています。これは、マウスでの嗅覚機能の敏感な尺度であるこの研究で説明したテストのいくつかの適応があることに注意することが重要である、本研究で強調されたものが私たちの研究室では、最も経験があり、日常的に使用するテストです。
Protocol
プロトコルのすべてのステップはシンシナティ大学のIACUCによって設定された動物の管理と使用ガイドラインと規則に従ってください。
1一般的な考慮事項
- 可能であれば、暗サイクルでの活動期中にマウスをテストします。一般的に、暗サイクルに低照度下でのテストと、少なくとも1時間行う。暗サイクルでのテストが不可能な場合は、明サイクル中にすべての3つのテストを実行します。マウスが彼らの睡眠サイクル中にテストされたときに時間を盗聴する低下する可能性があることに注意してください。注：テストは睡眠サイクルの間に実行することができるが、マウスが埋もれペレット、ブロック、または香りのカートリッジ内の少ない興味を示してもよい。
- 外嗅覚の影響を減らすそれぞれのテストを通して、常に手袋の塩基対を着用した後、各マウスと各試行のための塩基対の上の手袋のクリーンペアを配置するために。一般的なルールとして、疑わしい場合には、手袋のクリーンセットに置く。手袋のボックスには、読んだことがあります彼らは頻繁に変更されますので、ILY利用できる。注：私たちは、すべての動物の処理のためにニトリル手袋を使用しています。
- 殺菌剤/消毒剤を有する被験者との間で試験材料とケージのクリーニングは、病気を広める可能性を減らすだけでなく、望ましくない嗅覚を除去するために、テストのこの電池の重要なステップである。
ペレットテスト埋没2。
- 少なくとも二日試験前に、各マウスの体重を記録し、食品は、体重の90％に制限する。試験の前にし、食事制限中に、各マウスに、試験中に使用するペレットの1-2個を与える（ 例えば、加糖穀物の一部）。マウスは食品と新しいもの嫌いのであり、彼らが以前にペレットを食べていない場合は、試験中にペレットを探索しない可能性があるため、この手順を省略しないでください。
- すべての試験日には、ない水のボトルやフィーダーbで試験室に彼らのケージを置くことによって、試験前に1時間マウスを慣らすインチだけでフィルタートップのふたでホームケージでそれらを家。
- 馴化中は、きれいな寝具寝具が均等にケージ全体に分散されている特定のことで高〜3センチメートルクリーンマウスのケージを埋める。 5分間のタイマーを設定してください。
- それが見えないように馴化の1時間後に、寝具の下に1加糖穀物ペレット0.5cmに埋める。
- そのホームケージから試験マウスを取り外し、試験ケージの中央に置き、ケージにフィルタートップの蓋を置き、タイマーを開始。
- マウスがペレットをuncoversし、それを食べ始めたとき、タイマーを停止します。埋もれたペレットを発見するための時間に注意してください。
- マウスは5分以内にペレットが見つからない場合は、裁判を終了し、そのマウス用の300秒のスコアに注意してください。マウスはそれへのアクセス権を持っているので、寝具のトップにペレットを移動し、マウスがペレットを食べることができます。
- 裁判に続いて、そのホームケージにマウスを返す。
- 試験ケージから寝具を空にして、Cをきれいに動物室の洗浄液と時代。
- 繰り返します各マウスについて2.4〜2.9を段階的に説明し、各マウスの前後に手袋を変更します。
- すべてのマウスがテストされた後、彼らに90％の体重でそれらを維持するだけの十分な食料を与えます。
- 日2-5 1つの例外を除き、試験1日目と同じようにテストを実行。各試行のためにケージ内の別の場所にペレットを埋める。
- テスト6日目に、表面ペレットトライアルを行う。
- 表面ペレット裁判では、その代わりに、寝具の上に布団地、その下にペレットを埋め込むテスト1日目と同じ手順に従ってください。マウスが発見し、ペレットを食べ始めるまでの時間を記録します。
3ブロックのテスト
- 個別に各ケージを設定する前に、手袋を変え、（AEと表示）クリーンケージにマウスを収容し、ケージに5ブロックを配置。
- 後でテスト24時間を実行します。検査領域に試験マウスを移動し、水のボトルとフィーダビンを削除し、アルを配置lの動物の識別で標識されたプラスチック製の袋に布団の一握りと一緒にケージから5ブロック。マウスのホームケージの上に密封されたビニール袋を置きます。
- 試験前に1時間の水のボトル、フィーダビンなしのホームケージ内の動物、およびブロックを慣らす。
- 香りは、動物/ブロック間で交換されないように、各ケージの間に手袋を変更します。
- 各ケージの間に10cm以上でテーブルの上に互いに横にマウスのケージをラインアップ。ケージ（しないケージの長辺）の前面がクリアな視界に入るようにビデオカメラを置きます。
- 30秒間のタイマーを設定し、重要な実験の詳細（日付、マウスのID、裁判など ）でカードを標識する。 2-3秒間のビデオテープのラベルを。
- そのマウスの識別とビニール袋からブロックADを取り外し、それらは、ビデオカメラにはっきりと見えるように、ケージの中央に配置します。 〜1cmのoが存在することを確認してください各ブロックの間にFスペース。ケージにフィルタートップをバックに配置します。 30秒間のタイマーとビデオテープを起動します。
- 30秒後、録画を停止し、ケージからブロックを削除し、バックビニール袋に入れます。
- 手袋を変更した後、次のマウスに移り、最初の試験のために使用したのと同じ手順を繰り返す。各マウスは約5分の試行間の間隔があることを確認させるための6試験の合計のためにこれを行います。
- 7 回目のトライアルでは、マウスの代わりから、A、B、Cのブロックに露出するように別のマウスのケージからブロックEを追加し、マウス自体のケージからブロックDを配置する以外は試験の1〜6と同じ手順に従って、その別のマウスのケージから自身のホームケージとブロックE。そのブロックE各マウスは、ブロックEが各マウスのケージ（ 例えば、ABCEまたはAEBC）に配置され、交互に露出している研究室の本に注意してください。同性のマウスからではなく、元のcagemateからブロックEを取る。 630秒間deotape。
- 7裁判に続いて、元のcagematesで新しいクリーンなケージに動物を返します。クリーンブロックは、中性洗剤と水で試験に使用し、後のテストで使用するために空気乾燥させ。
4。馴化/脱馴化
- ブロック試験と同様の方法で、慣れ/脱馴化テストを実行しますが、代わりにマウスの臭気を持つブロックを使用しての、抽出物の異なる対を用いて香りコットンを保持している組織のカートリッジを使用しています。
- 代わりに、ブロックのシングル、無香組織カートリッジを使用しての手順3.1から3.4に従ってください。
- 試験室でマウスを慣らす。
- 別の部屋に香り組織カートリッジを準備します。きれいなカートリッジに小さなコットンボールを置き、次に綿に抽出物（ 例えば、アーモンドエキス）の5μlを添加する。その香りで標識された専用の箱や袋に入れて綿と場所の上のカートリッジ上部をはめ込みます。
- 同じ手続きfの操作を行いますまたは第二の香り（ 例えば、アニスエキス）。異なる香りを取り扱う間に手袋を変更します。コットンボールが完全に組織カートリッジに収納されていることを確認します。注：コットンボールから露出した繊維は、動物が営巣目的ではなく、香り自体のコットンボールに興味を持っている可能性があります。
- そして、一つの第6試験のための香りの組織カートリッジ及び第7の試用のための第二の香りの組織カートリッジを使用しての手順3.6から3.10に従ってください。
ビデオテープの5。分析
- ブロックと馴化/脱馴化のテストでは、実験条件に評価者のブラインドは、そのブロックと鼻連絡先として定義されてスニッフィングで、各ブロックをスニッフィング費やした時間を測定している。所望であれば、トライアル7および総活性、各試行の間（長さとホームケージの幅に沿って行わ移動回数）の間、新規のブロック（E）に近づくための時間のような他の行動を測定する。スニッフィング費やされた時間をスコアdは時間がストップウォッチを使用してビデオテープからアプローチする。
- 同様に、馴化/脱馴化試験のため、実験条件に評価者のブラインドを持っている時間を測定し、カートリッジをスニッフィングカートリッジにアプローチするための時間を過ごし、自発運動。
6。統計
- 待ち時間はスコアが分散の不均一性を示す傾向にあるペレットを見つけることがあるため、ノンパラメトリック統計を使用して埋めペレットテストを分析します。日3-5全体でペレットを検索し、マン·ホイットニーのU検定を用いて、マウスの群間で比較するために待ち時間を平均。同様に、テスト表面ペレット部分について、遺伝子型を比較するマン - ホイットニーU検定を使用してペレットを見つけるために待ち時間を分析する。
- ブロックテストでは、試用7（小説の香りのブロックの導入）からのデータを分析します。一般的に、分散の不均一性を考慮するために、ノンパラメトリック分析を採用している。第スニッフィング費やされる時間の差を分析するために電子小説ブロックは、同様に異なる実験群のためのブロックにアプローチする時間として、マン·ホイットニーU検定を使用しています。おなじみのブロックをスニッフィング費やした時間に対する新規のブロックをスニッフィングに費やした時間を比較するためにウィルコクソン符号付き順位検定を使用してください。
- 馴化/脱馴化試験において、行動のパラメータは、以前の研究20と同様の試験1、図6及び図7に解析する。マウスは無いスニッフィングがほとんどを呈する場合は、ノンパラメトリック分析を使用しています。
Representative Results
埋葬ペレット、ブロック、および馴化/脱馴化試験は、すべてのマウスでの嗅覚の非常に有利な評価である。これらのテストを用いて、α-シヌクレインを過剰発現する（はThy1-ASYN）18とAtp13a2ノックアウトマウスを含むパーキンソン病の複数の遺伝マウスモデルにおいて、嗅覚の重要な変更を発見した。両方はThy1-ASYNとAtp13a2ノックアウトマウスは対照18よりも埋もれペレットを見つけるために時間がかかります。野生型およびAtp13a2ノックアウトマウスから採取1-3ショーのデータを示す。埋設されたペレットの試験では、Atp13a2ノックアウトマウスは、野生型対照マウス（ 図1）と比較して埋設されたペレットを見つけるために待ち時間の増加を示している。ブロック試験において野生型およびAtp13a2ノックアウトマウスの両方が、自分のホームケージ（ 図2）からのブロックと比較して、別のマウスのケージから小説ブロックを嗅ぐ。馴化/脱馴化試験野生型マウスでは1臭いに慣れを示し、小説臭いが導入されたときに（ 図3）スニッフィング増加した。
ペレットテスト。レイテンシ埋設図1は、野生型第（n = 10）とAtp13a2 KOた（n = 14）、年齢の20〜27メートルで、ペレットを検索します。 *はp <0.05、マン·ホイットニーU.
図2のブロックの試験時間野生のブロック試験において、新規ブロック（E）をスニッフィング（n = 10）には20時Atp13a2 KOた（n = 12）の雌マウス- 。時代の27mの。 ΔΔは、同じ遺伝子型からのブロックA、B、およびCと比較してp <0.01を表す。マン·ホイットニーU。
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図3馴化/脱馴化試験。時間平均野生型マウスでは香りのカートリッジスニッフィング（年齢9メートルを、N = 7）6試験やトライアル7日に新たな香りを持つカートリッジの導入を横断。
Discussion
この研究で説明されているテストはそれぞれ、マウスでの嗅覚機能の異なる側面を測定します。寝具の下に埋もれ加糖穀物の味の良い部分を検出するためにマウスを空腹（奪わ食べ物制限はなく、食品）の能力を試験埋めペレット試験は、嗅覚の食品モチベーション側面を、。ブロック·テストは、独自の香りと同種のものとを区別するマウスの能力を試験する、嗅覚機能の社会的側面の多くを測定します。馴化/脱馴化試験は、使い慣れた小説無害な香りを区別するためにマウスの能力を評価する。食品のモチベーションや恐怖の異常は、対照と比較して変異マウスで観察された差異に寄与しなかったため、新しいモデルを特徴付ける際に複数のテストを使用することは重要です。ブロックのみテストが行われ、別のマウスの臭気が観察されたブロックのスニッフィング減少した場合、それはolfactがあるかどうかは不明であるモリ赤字またはそのブロックの回避につながる可能性が同種の強化恐怖反応。複数のテストが実行され、赤字がすべてのテストで観察されるとき、それは強く嗅覚障害の解釈をサポートしています。しかし、あれば違いが一つだけの試験で観察されたが、他は、より多くの微妙な嗅覚障害があるかもしれないが、それは他の説明（ すなわち、強化された恐怖や縮小食品モチベーション）を除外するために不可欠であるわけではない。嗅覚機能マウスをテストする際に留意すべき追加の重要な要因は、マウスのバックグラウンド系統とセックスが含まれています。異なる遺伝的背景の株（ すなわち、C57BL / 6、DBA など ） は 、それが実験全体を実行する前に、同じ背景の野生型マウスの各プロトコルを適合させるために推奨され、そのため、マウスの行動に大きな影響を持つことができます。また、男性の嗅覚系が高いので、その雄と雌のマウスは、互いに別個に試験することが推奨される発情中のメスの発情と嗅覚検出において、女性に敏感LYは、すべての3つのテストでのパフォーマンスを妨害する可能性があります。
一部のステップは、マウスにおける嗅覚をテストする際に従うことが絶対的に重要である。これは、実験者が動物に導入された匂いを認識することが重要です。手順については、手袋を身に着けていることは動物の間の手袋の本質的かつ頻繁な変更が必要である。それは、常に嗅覚検査の日にケルンまたは香水を着用しない実験者のための良い方法です。手順のいくつかの部分は柔軟性のあるが、試験の有効性または感受性を低下させることなく、修正し、適合させることができる他の部分がある。例えば、馴化試行回数は、試験されるマウス系統とどのように迅速にそれらが刺激に慣らすに応じて増減することができる。これらのテストの主な制限は、それが食べ物や社会的、作ることになり、それらはすべての動機のいくつかのフォームによって駆動されていることであるそれは難しい完全に変更された応答が観察説明としてモチベーションの異常を除外する。これは、テストおよび刺激に接近する時間中にこのような活性のような追加のパラメータを分析することによって最小化することができる。
習得した後、テストが容易に神経変性疾患の新規マウスモデルの表現型を調べることに使用することができる。また、最も高いパワーを有する試験は潜在的な治療薬を試験する前臨床試験に含めることができる（例えば、参考文献25参照）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cap'n Crunch | Quaker Oats | 30000065310 | |
| Wooden Blocks | Lara's Crafts | 10144 | |
| Almond Flavor Extract | Kroger | 011110664716 | |
| Anise Flavor Extract | Kroger | 011110615619 | |
| Banana Flavor Extract | Kroger | 011110669919 | |
| Coconut Flavor Extract | Kroger | 011110669889 | |
| Lemon Flavor Extract | Kroger | 011110669957 | |
| Orange Flavor Extract | Kroger | 0011110669964 | |
| Tissue Cartridges | Sigma-Aldrich | Z672122-500EA | Manufactured by Simport no: M490-2 |
| Cotton Balls | Kroger | 11110793119 | |
| Mouse Cages | Ancare | 19 x 29 x 12.7 cm | |
| Camcorder | Sony | HDR-HC9 | |
| MiniDV Tapes | Sony DVC premium | 27242523432 | 60 minute long play |
References
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