Introduction
Olfactorius dysfunksjon er knyttet til en rekke neurodegenerative forstyrrelser inkludert Parkinsons sykdom (PD), Alzheimers sykdom og Huntingtons sykdom 1. I PD, olfactory svekkelser inkluderer underskudd i lukt identifikasjon, deteksjon og diskriminering og finnes i opp til 70-95% av pasientene 2-5. Disse underskuddene kan komme før de Cardinal Motor symptomer på PD med opp til fire år, noe som indikerer at lukt dysfunksjon kan signalisere de tidlige stadier av PD 6-10. Den tidlige forekomsten av olfactory underskudd i PD har ført til en stor interesse i olfactory dysfunksjon og de underliggende mekanismene som er involvert. I prekliniske studier på gnagere, kan olfactory dysfunksjon være et sensitivt effektmål å forutsi den terapeutiske potensialet i nye terapeutiske strategier.
Mange tester er designet og mye brukt for å karakterisere sensorimotorisk svekkelser i gnager modeller av PD og til TESt det terapeutiske potensialet i nye behandlinger 11-15. Selv om olfactory underskudd er godt dokumentert i PD, luktesansen er ikke rutinemessig måles på mange modeller. Dette synet er i endring, men med oppdagelsen av genetiske former for PD og mer akseptert forestillingen om at PD er en systemisk sykdom som påvirker mer enn bare sensorimotor funksjon. For tiden er det en rekke studier i genetiske musemodeller av PD og andre nevrodegenerative lidelser som nå omfatter analyse av luktesans i karakterisering 16-24. Gitt den voksende interesse for olfaktoriske dysfunksjon i neurodegenerative forstyrrelser, søkte vi å montere et batteri av olfactory tester som kan benyttes for å karakterisere nye modeller for nevrodegenerasjon, så vel som test potensielle sykdomsmodifiserende behandling i prekliniske studier. Testene som er beskrevet i den foreliggende studie er blitt brukt i både karakterisering og prekliniske studier 18,25.
Testene highlighted i denne undersøkelsen har vist seg å være sensitiv påvise olfactory dysfunksjon i et hyppig benyttet alpha-synuclein overekspresjon musemodell av Parkinsons sykdom 18. De omfatter den begravde pellet test 26,27, en tilpasset versjon av blokken test 23,24,28,29, og tilvenning / dishabituation test 30. Det er viktig å merke seg at det er flere tilpasninger av de tester som er beskrevet i denne studie som er sensitive målinger av luktesansen hos mus, de som er fremhevet i denne studien er testene vårt laboratorium har mest erfaring med, og rutinemessig bruk.
Protocol
Alle trinn i protokollen følger dyret omsorg og bruke retningslinjer og forskrifter fastsatt av IACUC ved University of Cincinnati.
1. Generelle betraktninger
- Hvis det er mulig, å teste mus under sin aktive fase i mørke syklus. Vanligvis utfører testing under dårlige lysforhold og minst 1 time i mørke syklus. Imidlertid, hvis testing i mørke syklus ikke er gjennomførbart, å utføre alle tre tester under lys syklus. Husk at sniffing tider kan avta når mus er testet under søvnsyklus. MERK: Mens testene kan utføres i løpet av søvnsyklus musene kan vise mindre interesse for den begravde pellet, blokker, eller duftende kassett.
- For å redusere noen effekt av utenfor olfactory signaler, ha en base par hansker til alle tider gjennom hver test, og deretter plassere en ren par hansker over basepar for hver mus og hvert forsøk. Som en generell regel, når du er i tvil, ta på en ren sett med hansker. Har en boks med hansker leseily tilgjengelig, siden de vil bli endret ofte. MERK: Vi bruker nitrilhansker for alle dyrehåndtering.
- Rengjøring prøvemateriale og merder mellom fag med et desinfeksjonsmiddel / sterilisering agent er også et viktig skritt i denne batteri av tester for å redusere faren for å spre sykdom samt fjerne uønskede olfactory signaler.
2. Buried Pellet Test
- Minst to dager før testing, registrere vekten til hver mus og deretter mat begrenser til 90% av kroppsvekten. Før testing og under mat begrensning, gir hver mus 1-2 stykker av pelletene som skal brukes i løpet av testen (f.eks, et stykke søtet blanding). Ikke hopp over dette trinnet fordi mus er neophobic med mat og kan ikke søke etter pellet under testen hvis de ikke har spist pellets tidligere.
- Ved alle forsøksdager, tilvenne musene til 1 time før testing ved å plassere buret i testrommet uten flaske eller mater binn. huse dem i deres hjem bur med bare et filter topplokket.
- Under tilvenning, fylle en ren mus bur ~ 3 cm høy med rent sengetøy gjør sikkert sengetøy er jevnt fordelt over hele buret. Sett en timer for 5 min.
- Etter en time av tilvenning, begrave en sukret frokostblanding pellet 0,5 cm nedenfor sengetøy, slik at det ikke er synlig.
- Ta testen musen fra sitt hjem buret, plasser den i midten av test buret, plasserer filtertopplokket på buret og starte timeren.
- Stoppe tidtakeren når musen avdekker pellet og begynner å spise den. Merk deg tid til å avdekke den begravde pellet.
- Hvis musen ikke finner pellet innen 5 min, avslutter prøving og merke en poengsum på 300 sek for at musen. Beveg pellets til toppen av sengetøy slik at musen har adgang til den, og at musen til å spise pelleten.
- Etter rettssaken, returnere musen til sitt hjem buret.
- Tømme sengetøy fra testen buret og rengjør calder med dyrerom rengjøringsmiddel.
- Gjenta trinn 2.4 til 2.9 for hver mus, og bytte hansker før og etter hver mus.
- Etter at alle mus testes, gi dem akkurat nok mat for å holde dem ved 90% av kroppsvekten.
- Utfør testing på dager 2-5 på samme måte som testdagen 1 med et unntak; begrave pellet i et annet sted i buret for hvert forsøk.
- På testing dag 6, utføre overflaten pellet rettssaken.
- For overflaten pellet rettssaken, følger du samme prosedyre for test dag 1, men i stedet for å begrave pellet under sengetøy Plasser den på toppen av sengetøy. Notere tiden for musen å finne og begynne å spise pellets.
3. Block Test
- Individuelt huse mus i rene bur og plassere fem blokker i buret (merket AE), endre hansker før du setter opp hvert bur.
- Utfør testen 24 timer senere. Flytt test mus til testing området, fjerne vannflaske og mater bin, og plassere all 5 kvartaler fra buret sammen med en håndfull av sengetøy i en plastpose merket med dyrets identifikasjon. Plasser forseglet plastpose på toppen av musens hjemmeburet.
- Tilvenne dyrene i deres hjem bur uten vannflaske, mater bin, og blokker 1 time før testing.
- Bytt hansker mellom hver merd slik at luktene ikke utveksles mellom dyr / blokker.
- Stille opp muse bur ved siden av hverandre på et bord med minst 10 cm mellom hvert bur. Plasser et videokamera slik at fronten av buret (ikke den lange siden av buret) er i fri sikt.
- Sett timeren i 30 sek og merke et kort med de viktige eksperimentet detaljer (dato, mus ID, trial, etc.). Videobånd etiketten for 2-3 sek.
- Fjern blokker AD fra plastposen med at musen identifikasjon og plassere dem i midten av buret, slik at de er godt synlige på videokameraet. Pass på at det er ~ 1 cm of mellomrom mellom hver av blokkene. Plasser filteret toppen tilbake på buret. Starter tidtakeren og videotape på 30 sek.
- Etter 30 sek, stoppe opptak og fjerne blokker fra buret og legg dem tilbake i plastposen.
- Bytt hansker og deretter gå videre til neste mus, gjenta samme prosedyre som brukes for den første rettssaken. Gjøre dette for en total av seks forsøk for hver mus gjør at det er en inter-prøveintervall på ~ 5 min.
- På den 7. rettssaken, følger du samme fremgangsmåte for forsøkene 1-6 bortsett fra i stedet for å plassere blokk D fra musens eget bur legge blokk E fra en annen mus bur slik at musen er utsatt for blokkene A, B, og C fra sin eget hjem bur og blokk E fra en annen mus bur. Legg merke til i laboratoriet bok med blokk E hver mus er utsatt for og alternativ der blokk E er plassert i hver mus bur (f.eks ABCE eller AEBC). Ta blokk E fra en mus av samme kjønn, men ikke fra en opprinnelig cagemate. Videotape i 30 sek.
- Etter syv forsøk, returnere dyrene til en ny ren bur med sine opprinnelige cagemates. Rene blokker brukt i testen med et mildt vaskemiddel og vann og la det lufttørke for bruk i senere tester.
4. Tilvenning / Dishabituation
- Utfør tilvenning / dishabituation test på en lignende måte til blokken test, men i stedet for ved hjelp av blokker som har en lukt av mus ved å bruke vev patroner holder bomull parfymert med forskjellige par av ekstrakter.
- Følg trinn 3.1 til 3.4 ved hjelp av et enkelt, uparfymert vev patron i stedet for blokkene.
- Tilvenne mus i prøverommet.
- Forbered duftende vev patroner i et eget rom. Plasser en liten bomullsdott i en ren kassetten og deretter legge til 5 mL av ekstrakt (f.eks mandel ekstrakt) inn i bomull. Smekk kassetten toppen over bomull og plasser i en egen boks eller pose merket med det duft.
- Gjør det samme prosedyre feller en andre duft (f.eks, anis ekstrakt). Bytt hansker mellom håndtering av ulike dufter. Kontroller at bomullsdott er fullstendig innkapslet i vev kassetten. MERK: Exposed fibre på bomullsdott kan føre til at dyret å ha interesse i bomullsdott for hekkende formål snarere enn duften selv.
- Deretter følger du trinn 03.06 til 03.10 ved hjelp av en duftende vev patron for de seks første forsøk, og den andre duftende vev patronen for den sjuende rettssaken.
5. Analyse av videobånd
- For blokken og habituering / dishabituation tester, har en rater blind for eksperimentell tilstand måle tidsbruk sniffing hver blokk, med sniffing definert som nasal kontakt med den blokken. Dersom det er ønskelig, måle andre atferd som tid å nærme romanen blokken (e) under Trial 7 og total aktivitet (antall bevegelser gjort langs lengden og bredden av hjemmet buret) under hvert forsøk. Resultat tidsbruk sniffing end tid til å nærme seg fra videobåndet ved hjelp av en stoppeklokke.
- Tilsvarende for tilvenning / dishabituation test, har et rater blind for eksperimentell tilstand måle tidsbruk sniffing kassetten, tid til å nærme kassetten, og bevegelsesaktiviteten.
6. Statistikk
- Analyser begravet pellet test med parametriske statistikk fordi ventetid for å finne pelleten score tendens til å vise heterogenitet av variansen. Gjennomsnittlig ventetid for å finne pellet tvers dager 3-5 og deretter sammenligne mellom grupper av mus ved hjelp av en Mann-Whitney U-test. Tilsvarende for overflate pellet del av testen, analysere ventetid for å finne pellet ved hjelp av en Mann-Whitney U-test for å sammenligne genotyper.
- For blokken test, analysere dataene fra Trial 7 (innføring av romanen duftende blokk). Vanligvis benytter parametriske analyser for å redegjøre for heterogenitet av varians. For å analysere forskjeller i tid brukt sniffing the roman blokk samt tid til å nærme blokkene for ulike eksperimentelle grupper, bruker du Mann-Whitney U-test. Bruk Wilcoxon Signed Rank test for å sammenligne tidsbruk sniffing romanen blokk til tidsbruk sniffing de kjente blokker.
- For tilvenning / dishabituation test, analyserer oppførsel para på forsøk 1, 6 og 7, i likhet med tidligere studier 20. Hvis mus utviser liten eller ingen sniffing, bruke parametriske analyser.
Representative Results
The Buried pellets, blokk og tilvenning / dishabituation tester er alle svært fordelaktige evalueringer av luktesans hos mus. Ved hjelp av disse testene, har vi funnet signifikante endringer i luktesans i flere genetiske musemodeller av Parkinsons sykdom, inkludert alfa-synuclein overekspresjon (Thy1-asyn) 18 og Atp13a2 knockout mus. Begge Thy1-asyn og Atp13a2 knockout mus ta lengre tid å finne den begravde pellet enn kontrollene 18. Figurene 1-3 viser data samlet inn fra villtype og Atp13a2 knockout mus. I begravet pellet testen, viser Atp13a2 knockout mus økt ventetid for å finne den begravde pellet i forhold til villtype kontroll mus (figur 1). I blokken test både villtype og Atp13a2 knockout mus snuse romanen kvartal fra en annen mus bur i forhold til kvartaler fra sitt eget hjem bur (figur 2). I tilvenning / dishabituation test villtype mus viser tilvenning til en lukt og Deretter økte sniffing når en roman lukt er innført (figur 3).
Figur 1. Grav pellet-test. Latency å finne pelleten i villtype (n = 10) og Atp13a2 KO (n = 14) ved 20-27 m av alder. * P <0,05, Mann-Whitney U.
Figur 2. Block test Tid sniffing romanen blokken (E) i blokken test i villtype (n = 10) og Atp13a2 KO (n = 12) hunnmus ved 20 -. 27m av alder. ΔΔ representerer p <0,01 sammenlignet med blokkene A, B og C fra den samme genotype. Mann-Whitney U.
"Src =" / filer / Ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Tilvenning / dishabituation test. Gjennomsnittlig tid sniffing en duftende patron i villtype mus (9 m alder, n = 7) over seks forsøk og innføring av en patron med en roman duft på prøvespill 7.
Discussion
Hver av testene er beskrevet i denne studie måle forskjellige aspekter av luktesansen hos mus. Den begravde pellet test måler maten motivasjon aspekt av luktesans, testing evne sulten (mat begrenset, ikke mat fratatt) mus til å oppdage en velsmakende stykke sukret frokostblanding begravd under senger. Blokken test måler mer av det sosiale aspekt av luktesansen, testing av evnen hos mus til å diskriminere mellom deres egen lukt og det av et conspecific. Den tilvenning / dishabituation test vurderer muligheten av musen til å diskriminere mellom kjente og nye, ufarlige dufter. Bruke flere tester er viktig å karakterisere en ny modell fordi uregelmessigheter i mat motivasjon eller frykt kan bidra til forskjeller observert i muterte mus sammenlignet med kontroller. For eksempel, hvis bare blokken testen er utført og redusert sniffing av blokken som har lukt av en annen mus er observert, er det uklart om det er en olfactory underskudd eller en forsterket angst som svar på conspecific som kan føre til unngåelse av at blokken. Når flere tester er utført og underskudd er observert i alle tester, støtter det sterkeste en tolkning av luktefunksjon. Men hvis forskjellene er observert i bare en test, men ikke de andre så det kan være en mer subtil luktefunksjon, men det vil være viktig å utelukke andre forklaringer (dvs. økt frykt eller redusert mat motivasjon). Andre viktige faktorer å huske på når du tester luktesansen mus inkluderer bakgrunnen belastning og sex av musene. Ulike genetisk bakgrunn stammer (dvs. C57BL / 6, DBA, etc.) kan ha betydelig effekt på mus atferd derfor anbefales det å tilpasse hver protokoll i villtype mus av samme bakgrunn før du utfører hele eksperimentet. Det er også anbefalt at hann og hunn-mus testes separat fra hverandre fordi den mannlige luktsystemet er høyly følsom for kvinner i estrous og lukte påvisning av en kvinne i estrous kan forstyrre ytelse i alle tre testene.
Noen tiltak er helt avgjørende å følge når du tester luktesans hos mus. Det er viktig å være bevisst den lukt eksperimentator innfører til dyrene. Iført hansker for prosedyrene er viktig og hyppig skifte av hansker mellom dyr er nødvendig. Det er alltid en god praksis for eksperimentator ikke å bære cologne eller parfyme på luktesans testing dager. Mens enkelte deler av fremgangsmåten, er ikke-fleksible, er det andre deler som kan modifiseres og tilpasses uten å redusere gyldigheten eller følsomheten av testen. For eksempel kan antallet tilvennigs forsøk økes eller reduseres avhengig av stammer av mus testes, og hvor raskt de tilvenne til stimuli. Den viktigste begrensning av disse testene er at de alle er drevet av en eller annen form av motivasjon, det være seg mat eller sosiale, noe som gjørdet vanskelig å helt utelukke anomalier i motivasjon som en forklaring når en endret respons observert. Dette kan minimeres ved å analysere flere parametere, slik som aktivitet under testing og tid til å nærme stimuli.
Når mestret, kan testene enkelt brukes i behandlingen av fenotypen av nye musemodeller av neurodegenerative sykdommer. I tillegg kan de testene som har høyest effekt bli inkludert i prekliniske studier testing av potensielle terapeutiske midler (for eksempel se ref. 25).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cap'n Crunch | Quaker Oats | 30000065310 | |
| Wooden Blocks | Lara's Crafts | 10144 | |
| Almond Flavor Extract | Kroger | 011110664716 | |
| Anise Flavor Extract | Kroger | 011110615619 | |
| Banana Flavor Extract | Kroger | 011110669919 | |
| Coconut Flavor Extract | Kroger | 011110669889 | |
| Lemon Flavor Extract | Kroger | 011110669957 | |
| Orange Flavor Extract | Kroger | 0011110669964 | |
| Tissue Cartridges | Sigma-Aldrich | Z672122-500EA | Manufactured by Simport no: M490-2 |
| Cotton Balls | Kroger | 11110793119 | |
| Mouse Cages | Ancare | 19 x 29 x 12.7 cm | |
| Camcorder | Sony | HDR-HC9 | |
| MiniDV Tapes | Sony DVC premium | 27242523432 | 60 minute long play |
References
- Hawkes, C. Olfaction in neurodegenerative disorder. Adv. Otorhinolaryngol. 63, 133-151 (2006).
- Ward, C., Hess, W., Calne, D. Olfactory impairment in Parkinson's disease. Neurology. 33, 943-946 (1983).
- Doty, R., Stern, M., Pfeiffer, C., Gollomp, S., Hurtig, H. Bilateral olfactory dysfunction in early stage treated and untreated idiopathic Parkinson's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 55, 138-142 (1992).
- Doty, R., Deems, D., Stellar, S. Olfactory dysfunction in parkinsonism: a general deficit unrelated to neurologic signs, disease stage, or disease duration. Neurology. 38, 1237-1244 (1988).
- Tissingh, G., et al. Loss of olfaction in de novo and treated Parkinson's disease: possible implications for early diagnosis. Movement Disorders. 16 (1), 41-46 (2001).
- Montgomery, E., Baker, K., Lyons, K., Koller, W. Abnormal performance on the PD test battery by asymptomatic first-degree relatives. Neurology. 52, 757-762 (1999).
- Berendse, H., et al. Subclinical dopaminergic dysfunction in asymptomatic Parkinson's disease patients' relatives with a decreased sense of smell. Ann. Neurol. 50 (1), 34-41 (2001).
- Ponsen, M., Stoffers, D., Booij, J., van Eck-Smit, B., Wolters, E., Berendse, H. Idiopathic hyposmia as a preclinical sign of Parkinson's disease. Ann. Neurol. 56, 173-181 (2004).
- Langston, J. The Parkinson's complex: parkinsonism is just the tip of the iceberg. Ann. Neurol. 59 (4), 591-596 (2006).
- Ross, G., et al. Association of olfactory dysfunction with risk for future Parkinson's disease. Ann. Neurol. 63, 167-173 (2008).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein. J. Neurosci. 24, 9434-9440 (2004).
- Fleming, S., Ekhator, O., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. J. Vis. Exp. , e50303 (2013).
- Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of DA neurons in parkinsonism: Optimizing behavioral assessment of outcome. Central Nervous System Diseases. , 131-151 (2000).
- Whishaw, I., O'Connor, W., Dunnett, S. The contributions of motor cortex, nigrostriatal dopamine and caudate-putamen to skilled forelimb use in the rat. Brain. 109 (5), 805-843 (1986).
- Schwarting, R., Huston, J. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Prog Neurobiol. 49 (3), 215-266 (1996).
- Glasl, L., et al. Pink1-deficiency in mice impairs gait, olfaction and serotonergic innervation of the olfactory bulb. Experimental Neurology. 235, 214-227 (2012).
- Kim, Y., Lussier, S., Rane, A., Choi, S., Andersen, J. Inducible dopaminergic glutathione depletion in an α-synuclein transgenic mouse model results in age-related olfactory dysfunction. Neuroscience. 172, 379-386 (2011).
- Fleming, S., Tetreault, N., Mulligan, C., Huston, C., Masliah, E., Chesselet, M. Olfactory deficits in mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein. The European Journal of Neuroscience. 28 (2), 247-256 (2008).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136 (2), 412-432 (2013).
- Macknin, J., Higuchi, M., Lee, V., Trojanowski, J., Doty, R. Olfactory dysfunction occurs in transgenic mice overexpressing human tau protein. Brain Res. 1000, 174-178 (2004).
- Lazic, S., et al. Olfactory abnormalities in Huntington's disease: decreased plasticity in the primary olfactory cortex of R6/1 transgenic mice and reduced olfactory discrimination in patients. Brain Res. 1151, 219-226 (2007).
- Wesson, D., Wilson, D., Nixon, R. Should olfactory dysfunction be used as a biomarker of Alzheimer's disease? Expert Review of Neurotherapeutics. 10 (5), 633-635 (2010).
- Taylor, T., Caudle, W., Miller, G. VMAT2-deficient mice display nigral and extranigral pathology and motor and nonmotor symptoms of Parkinson's disease. Parkinsons Dis. 2011, 124-165 (2011).
- Tillerson, J., Caudle, W., Parent, J., Gong, C., Schallert, T., Miller, G. Olfactory discrimination deficits in mice lacking the dopamine transporter or the D2 dopamine receptor. Behav. Brain Res. 172, 97-105 (2006).
- Fleming, S., et al. A pilot trial of the microtubule-interacting peptide (NAP) in mice overexpressing alpha-synuclein shows improvement in motor function and reduction of alpha-synuclein inclusions. Mol. Cell. Neurosci. 4, 597-606 (2011).
- Crawley, J. What's Wrong with My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , Wiley-Liss. NY. (2000).
- Nathan, B., Yost, J., Litherland, M., Struble, R., Switzer, P. Olfactory function in apoE knockout mice. Behav. Brain Res. 150, 1-7 (2004).
- Spinetta, M. A simple and sensitive odor recognition test for rats and mice detects retrograde amnesia caused by ethanol or other drugs that interfere with memory consolidation. Society for Neuroscience. , Washington, D.C. (2005).
- Spinetta, M., et al. Alcohol-induced retrograde memory impairment in rats: prevention by caffeine. Psychopharmacology. 201 (3), 361-371 (2008).
- Bielsky, I., Hu, S., Szegda, K., Westphal, H., Young, L. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice. Neuropsychopharmacology. 29, 483-493 (2004).
