Introduction
Обонятельный дисфункция связана с целым рядом нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона 1. В PD, обонятельные нарушения относятся дефицит идентификации запаха, обнаружения и дискриминации и находятся в до 70-95% пациентов 2-5. Эти дефициты могут предшествовать симптомы кардинал двигательные ПД на срок до 4 лет, указывая, что обонятельная дисфункция может сигнализировать ранние стадии ПД 6-10. Раннее появление обонятельных дефицита в PD привело к большим интересом в обонятельной дисфункции и основных механизмов, участвующих. В доклинических исследований на грызунах, обонятельной дисфункции может быть чувствительным критерием оценки для прогнозирования терапевтический потенциал новых терапевтических стратегий.
Многие тесты были разработаны и широко используются для характеристики сенсомоторных нарушений в моделях грызунов PD и ТЭСт терапевтический потенциал новых методов лечения 11-15. Даже при том, что обонятельные дефициты хорошо документированы в PD, обонятельная функция не была регулярно измеряется во многих моделях. Эта точка зрения меняется, хотя с открытием генетических форм ЧР и более принятой понятия, что PD является системная болезнь влияет больше, чем просто функции сенсомоторной. В настоящее время существует множество исследований в генетических мышиных моделях PD и других нейродегенеративных заболеваний, которые в настоящее время включают в себя анализ обоняния в характеристике 16-24. Учитывая растущий интерес обонятельной дисфункции в нейродегенеративных расстройств, мы стремились собрать батарею обонятельных тестов, которые могут быть использованы для характеристики новых моделей нейродегенеративных а также тестовые потенциальных болезнь-модифицирующие лечения в доклинических исследованиях. Испытания, описанные в настоящем исследовании были использованы в обоих характеристик и доклинических исследований 18,25.
Испытания Highlighted в данном исследовании было показано, чувствителен при обнаружении обонятельный дисфункции в часто используются альфа-синуклеина модели с гиперэкспрессией мыши болезни Паркинсона 18. Они включают в себя похоронили гранул тест 26,27, адаптированный вариант теста блока 23,24,28,29 и тест привыкание / dishabituation 30. Важно отметить, что существует несколько адаптаций испытаний, описанных в данном исследовании, чувствительные меры обонятельной функции у мышей, те, выделенные в этом исследовании, тесты наша лаборатория имеет наибольший опыт с и обычно используют.
Protocol
Все стадии протокола следовать ухода за животными и использовать принципы и правила, установленные в IACUC из Университета Цинциннати.
1. Общие соображения
- Если это возможно, проверить мышей во время их активной фазы в темном цикле. Как правило, проведение тестирования при слабом освещении и не менее 1 часа в темном цикле. Однако, если испытание в темном цикле не представляется возможным, выполнить все три теста при световом цикле. Имейте в виду, что нюхают раз может уменьшиться, если мышей испытывают во время их цикла сна. ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как тесты могут быть выполнены в течение цикла сна мышей может показать меньший интерес погребенного гранулы, блоки, или душистой картриджа.
- В целях снижения влияния внешних обонятельные сигналы, износ базовую пару перчаток в любой момент времени в течение каждого теста, а затем поместить чистую пару перчаток в течение пары оснований для каждой мыши и каждом испытании. Как правило, в случае сомнений, положить на чистую набора перчаток. Есть коробка перчатки читатьILY доступны, так как они будут часто меняться. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем нитриловые перчатки для всех перевозке животных.
- Очистка тестовые материалы и клетки между субъектами с дезинфицирующим / стерилизующего агента также является важным шагом в этом батарею тестов для того, чтобы уменьшить вероятность распространения болезней, а также удалить нежелательные обонятельные сигналы.
2 Похоронен на пеллетах Тест
- По крайней мере, за два дня до тестирования, записать вес каждой мыши, а затем еда ограничить до 90% от массы тела. Перед тестированием и во время ограничения пищи, дать каждой мыши 1-2 штук таблеток, которые будут использоваться во время испытания (например, кусок подслащенной каши). Не пропустите этот шаг, потому что мыши являются neophobic с пищей и не может искать гранул во время испытания, если они не ели гранул ранее.
- На всех тестовых дней, приучить мышей в течение 1 часа до тестирования путем размещения их клетку в комнату тестирования, не бутылку воды или подачи Ъв. их размещения в их доме клетку только с фильтром верхней крышке.
- Во время привыкания, заполнить чистой клетку мыши ~ 3 см в высоту с чистыми постельными принадлежностями убедившись, что постельное белье равномерно распределены по всей клетке. Установите таймер на 5 мин.
- После 1 часа привыкания, похоронить 1 подслащенные зерновых окатышей на 0,5 см ниже постельные принадлежности, так что его не видно.
- Извлеките тест-мышь от ее клетку, поместите его в центре каждой клетке, поместите фильтр верхнюю крышку на клетке и запустить таймер.
- Остановите таймер, когда мышь раскрывает осадок и начинает его есть. Обратите внимание на время, чтобы раскрыть похороненный осадок.
- Если мышь не найти таблетку в течение 5 мин, конец судебного разбирательства и отметить балл 300 сек для этого мышью. Перемещение гранул в начало постельных принадлежностей поэтому мышь имеет к ним доступ, и позволяют мышь, чтобы съесть таблетку.
- После судебного разбирательства, вернуться мышь, чтобы его клетку.
- Слейте кроватях от каждой клетке и очистите Cвозраст с чистящей животное номер решения.
- Повторите шаги 2,4 до 2,9 для каждой мыши, и меняйте перчатки до и после каждой мыши.
- После того как все мышей испытывают, дать им достаточно просто пищу для поддержания их в 90% массы тела.
- Выполнение проверки на 2-5 дней так же, как тест-дня 1, за одним исключением; похоронить осадок в другом месте в клетке для каждого испытания.
- На испытательной день 6, выполните пробную поверхность гранул.
- Для гранул суда поверхности, следовать той же процедуре для тестового дня 1, но вместо того, чтобы хоронить гранул под постельных принадлежностей разместить его на верхней части постельных принадлежностей. Запишите время для мыши, чтобы найти и начать есть осадок.
3 Block Test
- Индивидуально домовых мышей в чистых клетках и разместить 5 блоков в клетке (с маркировкой AE), изменение перчатки перед установкой каждый клетку.
- Выполните тест через 24 часа спустя. Перемещение испытаний мышей в области тестирования, снимите бутылку воды и подачи приемника и поместите альл в 5 кварталах от клетки вместе с горсткой постельные принадлежности в пластиковый пакет, помеченный идентификации животного. Поместите запечатанный пластиковый пакет поверх клетку мыши.
- Приучить животных в их доме клетку без бутылки с водой, Загрузочный бункер и блоки в течение 1 часа до тестирования.
- Изменение перчатки между каждой клетке так, чтобы ароматы не обмениваются животных / блоков.
- Выстроить клетки мыши рядом друг с другом на столе с не менее 10 см между каждой клетки. Расположите видеокамеру так, чтобы передняя часть клетки (не долго стороны клетки) является на виду.
- Установите таймер на 30 секунд и маркировать карту с важных деталей эксперимента (дата, регистрационный номер мышь, пробных и т.д.). Видеозапись метка на 2-3 сек.
- Удалить блоков AD из пластикового пакета с определением этого мыши и поместите их в середине клетки так, чтобы они хорошо видны на видеокамеру. Убедитесь, что ~ 1 см оF пространство между каждого из блоков. Поместите верхнюю фильтра обратно на клетку. Запустите таймер и видеозапись на 30 сек.
- Через 30 сек, остановить запись и удалить блоки из клетки и поместить их обратно в пластиковый пакет.
- Изменение перчатки, а затем перейти к следующему мыши, повторяя ту же процедуру, используемую для первого судебного разбирательства. Делайте это в течение в общей сложности 6 испытаний для каждой мыши убедившись есть между пробная интервал ~ 5 мин.
- На 7-й проб, следовать той же процедуре для испытаний 1-6, за исключением вместо размещения блока D от собственной клетке мыши добавить блок Е из клетки другого мыши так, что мышь подвергается блоков A, B, и C от его собственный дом клетка и блок Е из клетки другого мыши. Примечание в лабораторном журнале которого блок Е каждая мышь подвергается и чередуются где блок Е помещен в клетку каждой мыши (например, ABCE или AEBC). Возьмите блок Е от мыши того же пола, но не из первоначального cagemate. Videotape в течение 30 сек.
- После 7 исследований, вернуться животных к новому чистой клетке вместе со своими cagemates. Чистые блоки используются в тесте с мягким моющим средством и водой и дайте высохнуть на воздухе для использования в ходе последующих испытаний.
4 Привыкание / Dishabituation
- Выполнить проверку привыкание / dishabituation аналогичным образом к тесту блока, но вместо того, чтобы использовать блоки, которые имеют запах мыши, использовать ткани, удерживающие картриджи хлопка с ароматом разных пар экстрактов.
- Выполните шаги 3.1-3.4 с помощью одного, без запаха тканей картридж вместо блоков.
- Приучить мышей в испытательной камере.
- Подготовьте душистые ткани картриджи в отдельной комнате. Нанесите небольшое ватный тампон в чистую картриджа, а затем добавить 5 мкл экстракта (например, миндального экстракта) в хлопка. Привязать верх картриджа над хлопка и место в выделенном коробке или сумке, помеченный этой ароматом.
- Выполните те же действия Fили второй аромат (например, анис экстракт). Изменение перчатки между обработке различных ароматов. Убедитесь, что ватный тампон полностью заключенная в картридже ткани. ПРИМЕЧАНИЕ: Exposed волокна от ватным тампоном может заставить животное есть интерес к ватным тампоном для гнездования, а не самого аромата.
- Затем выполните шаги 3.6-3.10, используя одну душистую картридж тканей в течение первых шести испытаний, а второй картридж душистую ткани для седьмого судебного разбирательства.
5 Анализ видеомагнитофонов
- Для блока и привыкание / dishabituation тестов, есть оценщик слепы к экспериментальной состоянии измерить время, потраченное нюхают каждый блок, с нюхают определяется как носовой контакте с этого блока. При желании, измерить другие виды поведения, такие как время, чтобы подойти к новой блок (E) во время судебного разбирательства 7 и общей активности (количество движений, сделанных по длине и ширине клетку) во время каждого испытания. Оценка времени, затрачиваемого нюхаютг. Время подходить с видеопленки с помощью секундомера.
- Аналогично, для испытания на привыкание / dishabituation, есть оценщик слепы к экспериментальной состоянии измерить время, потраченное нюхают картриджа, времени на подход картридж и двигательную активность.
6. Статистика
- Анализ гранул тест похоронили помощью непараметрической статистики, так как задержка найти осадок баллы как правило, показывают неоднородность дисперсии. Нормальное время ожидания, чтобы найти шарик через дней 3-5, а затем сравнить между группами мышей, используя U-тест Манна-Уитни. Аналогично, для поверхности гранул части теста, анализировать задержки найти шарик с помощью U-тест Манна-Уитни для сравнения генотипов.
- Для теста блока, анализировать данные из Судебной 7 (введение романе с запахом блока). Как правило, используют непараметрические анализы для учета неоднородности дисперсии. Для того чтобы проанализировать различия во времени провел нюхают гоэ роман блок, а также время, чтобы приблизиться блоки для различных экспериментальных групп, использовать U-тест Манна-Уитни. Используйте Подпись Ранг критерия Вилкоксона для сравнения время, проведенное нюхать новый блок к времени, потраченного нюхают знакомые блоки.
- Для теста привыкание / dishabituation, проведение параметрического анализа на ознакомительные 1, 6 и 7, похож на предыдущих исследованиях 20. Если мыши обнаруживают практически не фырканье, использовать непараметрические анализы.
Representative Results
Погребенные пеллетах, блок, и привыкание / dishabituation тесты все очень выгодные оценки обоняния у мышей. С помощью этих тестов, мы обнаружили значительные изменения в обоняния в нескольких моделях генетическая мыши болезни Паркинсона, в том числе альфа-синуклеина с гиперэкспрессией (Thy1-ASYN) 18 и мышей с Atp13a2. Оба Thy1-ASYN и Atp13a2 нокаутные мыши занять больше времени, чтобы найти похоронили осадок, чем управления 18. Рисунки 1-3 приводятся данные, собранные из дикого типа и Atp13a2 мышей с. В погребенного теста гранул, нокаутные мыши Atp13a2 показывают увеличение латентности найти похоронили гранул по сравнению с дикого типа контрольных мышей (рисунок 1). В тесте блока как дикого типа и нокаут мышей Atp13a2 нюхать новый блок из клетки другого мыши по сравнению с блоками из своей домашней клетки (рисунок 2). В тест привыкание / dishabituation мышей дикого типа показать привыкания к одному запаху и затем увеличивается нюхают, когда роман запах вводится (рисунок 3).
Рисунок 1 Buried гранул теста. Задержка найти осадок в дикого типа (п = 10) и Atp13a2 КО (N = 14) в 20-27 м от возраста. * Р <0,05, Mann-Whitney U.
Рисунок 2 Блок испытание Время нюхать новый блок (E) в тесте блока в дикого типа (п = 10) и Atp13a2 KO (п = 12) самок мышей на 20 -. 27м возраста. ΔΔ представляет р <0,01 по сравнению с блоками А, В, и С от того же генотипа. Манна-Уитни U.
"SRC =" / файлы / ftp_upload / 51804 / 51804fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок тест 3 Привыкание / dishabituation. Среднее время нюхают душистую картридж в мышей дикого типа (возраст 9 м, N = 7) через 6 испытания и внедрение патрона с новым ароматом на суде 7.
Discussion
Каждый из испытаний, описанных в данном исследовании измерить различные аспекты обонятельной функции у мышей. Похоронен тест осадок измеряет продовольственной мотивации аспект обоняния, тестирования способности голодный (пищи ограничено, не пища лишена) мышей для обнаружения приятного на вкус кусочек подслащенного зерновых погребены под постельными принадлежностями. Тест блок измеряет больше социальном аспекте обонятельной функции, тестирования способности мышей различать их собственный аромат и что из конспецифичный. Тест привыкание / dishabituation оценивает способность мыши различать знакомые и новые, безвредные ароматов. Использование нескольких тестов важно при характеристике новую модель, потому что аномалии в пищевой мотивации или страха может способствовать различий, наблюдаемых у мутантных мышей по сравнению с контролем. Например, если только испытательный блок выполняется и снизился нюхают блока, который запах другой мыши наблюдается, неясно, есть ли Olfactрии дефицит или усиливается реакция страха на конспецифичный, которые могут привести к расторжению данного блока. Когда несколько тесты выполняются и дефициты наблюдаются во всех тестах, он решительно поддерживает интерпретацию обонятельной обесценение. Однако, если различия наблюдаются только в одном тесте, но не остальные то может быть более тонким обонятельная обесценения но это будет иметь важное значение, чтобы исключить другие объяснения (т.е., повышение страх или уменьшается мотивация питания). Дополнительные важные факторы, которые необходимо учитывать при тестировании мышей обонятельные функции включают фоновую нагрузку и пол мышей. Различные штаммы генетического фона (т.е., C57BL / 6, DBA, и т.д.) может оказать глубокое воздействие на поведение мыши поэтому, рекомендуется адаптировать каждого протокола мышей дикого типа того же фоне перед выполнением весь эксперимент. Кроме того, рекомендуется, что мужчина и женщина мыши испытывают отдельно друг от друга, потому что мужчина обонятельная система высоклы чувствительны к самкам в эстральным и обонятельной обнаружения женщиной в течки может помешать производительности во всех трех тестах.
Некоторые шаги абсолютно необходимо, чтобы следовать при тестировании обоняние у мышей. Важно быть в курсе запахов экспериментатор, внедряющих к животным. Надев перчатки для процедур является необходимым и частой смены перчаток между животными требуется. Это всегда хорошая практика для экспериментатора не носить одеколон или духи на обоняние тестирования дней. В то время как некоторые части процедуры являются негибкими, есть и другие части, которые могут быть модифицированы и адаптированы без снижения на действительность или чувствительность теста. Например, количество привыкания испытаний может быть увеличена или уменьшена в зависимости от штамма мышей проходит проверку и как быстро они привыкают к стимулам. Основным недостатком этих тестов является то, что все они обусловлен иной форме мотивации, будь то продукты питания или социального, делаятрудно полностью исключить аномалии в мотивации в качестве объяснения, когда наблюдается измененная реакция. Это может быть сведено к минимуму путем анализа дополнительные параметры, такие как активность во время тестирования и время, чтобы приблизиться стимулы.
После того, как освоили, тесты могут быть легко использованы в изучении фенотип новых моделях мыши нейродегенеративных заболеваний. Кроме того, тесты, которые имеют наибольшую мощность может быть включен в доклинических исследований тестирования потенциальных терапевтических средств (в качестве примера см. 25).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cap'n Crunch | Quaker Oats | 30000065310 | |
| Wooden Blocks | Lara's Crafts | 10144 | |
| Almond Flavor Extract | Kroger | 011110664716 | |
| Anise Flavor Extract | Kroger | 011110615619 | |
| Banana Flavor Extract | Kroger | 011110669919 | |
| Coconut Flavor Extract | Kroger | 011110669889 | |
| Lemon Flavor Extract | Kroger | 011110669957 | |
| Orange Flavor Extract | Kroger | 0011110669964 | |
| Tissue Cartridges | Sigma-Aldrich | Z672122-500EA | Manufactured by Simport no: M490-2 |
| Cotton Balls | Kroger | 11110793119 | |
| Mouse Cages | Ancare | 19 x 29 x 12.7 cm | |
| Camcorder | Sony | HDR-HC9 | |
| MiniDV Tapes | Sony DVC premium | 27242523432 | 60 minute long play |
References
- Hawkes, C. Olfaction in neurodegenerative disorder. Adv. Otorhinolaryngol. 63, 133-151 (2006).
- Ward, C., Hess, W., Calne, D. Olfactory impairment in Parkinson's disease. Neurology. 33, 943-946 (1983).
- Doty, R., Stern, M., Pfeiffer, C., Gollomp, S., Hurtig, H. Bilateral olfactory dysfunction in early stage treated and untreated idiopathic Parkinson's disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 55, 138-142 (1992).
- Doty, R., Deems, D., Stellar, S. Olfactory dysfunction in parkinsonism: a general deficit unrelated to neurologic signs, disease stage, or disease duration. Neurology. 38, 1237-1244 (1988).
- Tissingh, G., et al. Loss of olfaction in de novo and treated Parkinson's disease: possible implications for early diagnosis. Movement Disorders. 16 (1), 41-46 (2001).
- Montgomery, E., Baker, K., Lyons, K., Koller, W. Abnormal performance on the PD test battery by asymptomatic first-degree relatives. Neurology. 52, 757-762 (1999).
- Berendse, H., et al. Subclinical dopaminergic dysfunction in asymptomatic Parkinson's disease patients' relatives with a decreased sense of smell. Ann. Neurol. 50 (1), 34-41 (2001).
- Ponsen, M., Stoffers, D., Booij, J., van Eck-Smit, B., Wolters, E., Berendse, H. Idiopathic hyposmia as a preclinical sign of Parkinson's disease. Ann. Neurol. 56, 173-181 (2004).
- Langston, J. The Parkinson's complex: parkinsonism is just the tip of the iceberg. Ann. Neurol. 59 (4), 591-596 (2006).
- Ross, G., et al. Association of olfactory dysfunction with risk for future Parkinson's disease. Ann. Neurol. 63, 167-173 (2008).
- Fleming, S., et al. Early and progressive sensorimotor anomalies in mice overexpressing wild-type human alpha-synuclein. J. Neurosci. 24, 9434-9440 (2004).
- Fleming, S., Ekhator, O., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson's disease. J. Vis. Exp. , e50303 (2013).
- Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of DA neurons in parkinsonism: Optimizing behavioral assessment of outcome. Central Nervous System Diseases. , 131-151 (2000).
- Whishaw, I., O'Connor, W., Dunnett, S. The contributions of motor cortex, nigrostriatal dopamine and caudate-putamen to skilled forelimb use in the rat. Brain. 109 (5), 805-843 (1986).
- Schwarting, R., Huston, J. The unilateral 6-hydroxydopamine lesion model in behavioral brain research. Analysis of functional deficits, recovery and treatments. Prog Neurobiol. 49 (3), 215-266 (1996).
- Glasl, L., et al. Pink1-deficiency in mice impairs gait, olfaction and serotonergic innervation of the olfactory bulb. Experimental Neurology. 235, 214-227 (2012).
- Kim, Y., Lussier, S., Rane, A., Choi, S., Andersen, J. Inducible dopaminergic glutathione depletion in an α-synuclein transgenic mouse model results in age-related olfactory dysfunction. Neuroscience. 172, 379-386 (2011).
- Fleming, S., Tetreault, N., Mulligan, C., Huston, C., Masliah, E., Chesselet, M. Olfactory deficits in mice overexpressing human wildtype alpha-synuclein. The European Journal of Neuroscience. 28 (2), 247-256 (2008).
- Nuber, S., et al. A progressive dopaminergic phenotype associated with neurotoxic conversion of α-synuclein in BAC-transgenic rats. Brain. 136 (2), 412-432 (2013).
- Macknin, J., Higuchi, M., Lee, V., Trojanowski, J., Doty, R. Olfactory dysfunction occurs in transgenic mice overexpressing human tau protein. Brain Res. 1000, 174-178 (2004).
- Lazic, S., et al. Olfactory abnormalities in Huntington's disease: decreased plasticity in the primary olfactory cortex of R6/1 transgenic mice and reduced olfactory discrimination in patients. Brain Res. 1151, 219-226 (2007).
- Wesson, D., Wilson, D., Nixon, R. Should olfactory dysfunction be used as a biomarker of Alzheimer's disease? Expert Review of Neurotherapeutics. 10 (5), 633-635 (2010).
- Taylor, T., Caudle, W., Miller, G. VMAT2-deficient mice display nigral and extranigral pathology and motor and nonmotor symptoms of Parkinson's disease. Parkinsons Dis. 2011, 124-165 (2011).
- Tillerson, J., Caudle, W., Parent, J., Gong, C., Schallert, T., Miller, G. Olfactory discrimination deficits in mice lacking the dopamine transporter or the D2 dopamine receptor. Behav. Brain Res. 172, 97-105 (2006).
- Fleming, S., et al. A pilot trial of the microtubule-interacting peptide (NAP) in mice overexpressing alpha-synuclein shows improvement in motor function and reduction of alpha-synuclein inclusions. Mol. Cell. Neurosci. 4, 597-606 (2011).
- Crawley, J. What's Wrong with My Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , Wiley-Liss. NY. (2000).
- Nathan, B., Yost, J., Litherland, M., Struble, R., Switzer, P. Olfactory function in apoE knockout mice. Behav. Brain Res. 150, 1-7 (2004).
- Spinetta, M. A simple and sensitive odor recognition test for rats and mice detects retrograde amnesia caused by ethanol or other drugs that interfere with memory consolidation. Society for Neuroscience. , Washington, D.C. (2005).
- Spinetta, M., et al. Alcohol-induced retrograde memory impairment in rats: prevention by caffeine. Psychopharmacology. 201 (3), 361-371 (2008).
- Bielsky, I., Hu, S., Szegda, K., Westphal, H., Young, L. Profound impairment in social recognition and reduction in anxiety-like behavior in vasopressin V1a receptor knockout mice. Neuropsychopharmacology. 29, 483-493 (2004).
