Introduction
Disfunción olfativa está vinculada a una serie de trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson (PD), enfermedad de Alzheimer, y enfermedad de Huntington 1. En la EP, alteraciones olfatorias incluyen déficits en la identificación del olor, la detección y la discriminación y se encuentran hasta en el 70-95% de los pacientes 2-5. Estos déficits pueden preceder a los síntomas motores de la EP por el cardenal de hasta 4 años, lo que indica que la disfunción olfativa puede ser señal de las primeras etapas de la DP 6-10. La aparición temprana de los déficits olfativos en la EP ha generado un gran interés en la disfunción olfativa y los mecanismos subyacentes implicados. En estudios preclínicos en roedores, disfunción olfativa podría ser una medida de resultado sensible para predecir el potencial terapéutico de nuevas estrategias terapéuticas.
Muchas pruebas han sido diseñados y ampliamente utilizado para caracterizar alteraciones sensoriomotoras en modelos de roedores de PD y de TESt el potencial terapéutico de los tratamientos novedosos 11-15. A pesar de que los déficits olfativos están bien documentados en la EP, la función olfativa no se ha medido rutinariamente en muchos modelos. Esta visión está cambiando, aunque con el descubrimiento de formas genéticas de la EP y la noción más aceptada que la EP es una enfermedad sistémica que afecta a algo más que la función sensoriomotora. Actualmente, hay numerosos estudios en modelos genéticos de ratón de la EP y otros trastornos neurodegenerativos que ahora incluyen análisis de olfato en la caracterización 16-24. Dado el creciente interés de la disfunción olfatoria en los trastornos neurodegenerativos, hemos tratado de reunir una serie de pruebas olfativas que pueden ser utilizados para caracterizar nuevos modelos de neurodegeneración, así como las pruebas posibles terapias modificadoras de la enfermedad en los estudios preclínicos. Los ensayos descritos en el presente estudio se han utilizado tanto en la caracterización y estudios preclínicos 18,25.
Las pruebas highlighted en este estudio se ha demostrado que ser sensible en la detección de la disfunción olfativa en una utilizado con frecuencia alfa-sinucleína modelo de ratón que sobreexpresa de la enfermedad de Parkinson 18. Ellos incluyen la prueba enterrado pellet 26,27, una versión adaptada de la prueba de bloque de 23,24,28,29, y la prueba de habituación / deshabituación 30. Es importante tener en cuenta que hay varias adaptaciones de las pruebas descritas en este estudio que son medidas sensibles de la función olfativa en ratones, los que se destacan en este estudio son las pruebas de nuestro laboratorio tiene la mayor experiencia con y utilizar de forma rutinaria.
Protocol
Todos los pasos del protocolo siguen el cuidado de los animales y el uso de las directrices y normas establecidas por el IACUC de la Universidad de Cincinnati.
1. Consideraciones generales
- Si es posible, pruebe los ratones durante su fase activa en el ciclo de oscuridad. Por lo general, realizar pruebas con poca luz y por lo menos 1 hora en la oscuridad ciclo. Sin embargo, si las pruebas en el ciclo de oscuridad no es posible, realice las tres pruebas durante el ciclo de luz. Tenga en cuenta que los tiempos sniffing puede disminuir cuando los ratones se ponen a prueba durante su ciclo de sueño. NOTA: Si bien las pruebas se pueden realizar durante el ciclo de sueño de los ratones pueden mostrar menos interés en el sedimento enterrado, bloques, o cartucho perfumado.
- Con el fin de reducir cualquier efecto de fuera de señales olfativas, llevar un par de bases de guantes en todo momento a lo largo de cada prueba y luego colocar un par de guantes limpios en el par de bases para cada ratón y cada ensayo. Como norma general, en caso de duda, se puso un conjunto de guantes limpios. Tiene una caja de guantes de leerily disponible ya que serán cambiados con frecuencia. NOTA: Nosotros usamos guantes de nitrilo para toda manipulación de animales.
- Limpieza de los materiales de prueba y las jaulas entre los sujetos con un desinfectante / esterilizante es también un paso importante en esta serie de pruebas con el fin de reducir las posibilidades de propagación de enfermedades, así como eliminar las señales olfativas deseadas.
2. Buried Prueba Pellet
- Al menos dos días antes de la prueba, se registra el peso de cada ratón y luego alimentos restringir a 90% del peso corporal. Antes de la prueba y durante la restricción de alimentos, dar a cada ratón 1-2 piezas de los pellets que se utilizarán durante la prueba (por ejemplo, un pedazo de cereal azucarado). No se salte este paso porque los ratones son neofóbicos con los alimentos y pueden no buscar la pastilla durante la prueba, si no han comido los gránulos previamente.
- En todos los días de prueba, habituar a los ratones durante 1 hora antes de la prueba mediante la colocación de su jaula en la sala de pruebas sin botella de agua o en el alimentador ben. ellos casa en su jaula con sólo una tapa superior del filtro.
- Durante la habituación, llenar un ratón jaula limpia ~ 3 cm de alto con ropa de cama limpia asegurándose de la ropa de cama se distribuye uniformemente a través de la jaula. Establecer un temporizador durante 5 min.
- Después de 1 hr de la habituación, enterrar 1 endulzadas de pellets de cereales 0,5 cm por debajo de la ropa de cama de manera que no es visible.
- Retire el ratón de prueba de su jaula hogar, lugar en el centro de la jaula de ensayo, colocar la tapa superior del filtro en la jaula y iniciar el temporizador.
- Detener el temporizador cuando el ratón descubre el pellet y comienza comerlo. Tenga en cuenta el tiempo para descubrir el sedimento enterrado.
- Si el ratón no encuentra el sedimento en 5 minutos, poner fin al juicio y tenga en cuenta una puntuación de 300 segundos para que el ratón. Mueva el pellet a la parte superior de la ropa de cama por lo que el ratón tiene acceso a ella, y permitir que el ratón para comer la pastilla.
- Tras el juicio, devuelva el ratón a su jaula.
- Vacíe la ropa de cama de la jaula de prueba y limpiar el cedad con una solución de limpieza de habitaciones animal.
- Repita los pasos 2.4 a 2.9 para cada ratón, y cambiar los guantes antes y después de cada ratón.
- Después de todos los ratones se ponen a prueba, les dan suficiente comida para mantenerlos a 90% del peso corporal.
- Realizar pruebas en los días 2-5 del mismo modo que los días de prueba 1 con una excepción; enterrar el precipitado en un lugar diferente en la jaula para cada ensayo.
- El día de la prueba 6, realice el juicio pellet superficie.
- Para el ensayo de pellets superficie, siga el mismo procedimiento que para el día de la prueba 1, pero en lugar de enterrar el sedimento en el lugar de cama en la parte superior de la ropa de cama. Registre el tiempo para el ratón para encontrar y empezar a comer la pastilla.
3. Bloque de prueba
- Individualmente albergar ratones en jaulas limpias y colocar 5 bloques en la jaula (etiquetado AE), el cambio de los guantes antes de la creación de cada jaula.
- Realice la prueba 24 horas más tarde. Mueva los ratones de prueba a la zona de la prueba, retire la bandeja de botella de agua y de alimentación, y coloque all 5 cuadras de la jaula, junto con un puñado de ropa de cama en una bolsa de plástico etiquetada con la identificación del animal. Coloque la bolsa de plástico sellada en la parte superior de la jaula de la casa del ratón.
- Habituar a los animales en sus jaulas sin la botella de agua, bin alimentador, y los bloques durante 1 hora antes de la prueba.
- Cámbiese los guantes entre cada jaula para que los olores no se intercambian entre los animales / bloques.
- Alinear las jaulas de ratón al lado de otra, sobre una mesa con un mínimo de 10 cm entre cada jaula. Colocar una cámara de vídeo de manera que la parte delantera de la jaula (no el lado largo de la jaula) es a la vista.
- Ajuste el temporizador de 30 segundos y la etiqueta de una tarjeta con los detalles importantes del experimento (fecha, ID del ratón, el juicio, etc). Videotape la etiqueta para 2-3 seg.
- Retire los bloques de AD de la bolsa de plástico con la identificación de ese ratón y colocarlos en el centro de la jaula de manera que sean claramente visibles en la cámara de vídeo. Asegúrese de que hay ~ 1 cm of espacio entre cada uno de los bloques. Coloque la parte superior del filtro nuevo en la jaula. Inicie el temporizador y cintas de vídeo durante 30 segundos.
- Después de 30 segundos, detenga la grabación y quitar los bloques de la jaula y colocarlos de nuevo en la bolsa de plástico.
- Cambie los guantes y luego pasar a la siguiente ratón, repitiendo el mismo procedimiento utilizado para la primera prueba. Haga esto por un total de 6 pruebas para cada ratón asegurándose de que hay un intervalo entre ensayos de ~ 5 min.
- En la prueba de 7 º, siga el mismo procedimiento para los ensayos 1-6 excepto que en lugar de colocar el bloque D de la propia jaula del ratón añadir bloque E de la jaula de otro ratón de manera que el ratón está expuesto a los bloques A, B, y C de su propia jaula de alojamiento y el bloque E de la jaula de otro ratón. Nota en el libro de laboratorio cuyos E bloque cada ratón está expuesto y alternativa en la que el bloque E se coloca en la jaula de cada ratón (por ejemplo, ABCE o AEBC). Tome bloque E de un ratón del mismo sexo, pero no de un cagemate originales. Videotape durante 30 segundos.
- Después de los 7 ensayos, devuelva los animales a una nueva jaula limpia con sus compañeros de jaula originales. Bloques Limpie utilizados en el ensayo con un detergente suave y agua y dejar secar al aire para su uso en pruebas posteriores.
4. habituación / Deshabituación
- Realizar la prueba de habituación / deshabituación de una manera similar a la prueba de bloque, pero en lugar de utilizar bloques que tienen el olor de un ratón, utilice cartuchos de tejido de algodón que sostienen perfumado con diferentes pares de extractos.
- Siga los pasos 3.1 a 3.4 utilizando un único cartucho, tejido sin perfume en lugar de los bloques.
- Habituar a los ratones en la sala de ensayo.
- Prepare los cartuchos de tejidos perfumados en una habitación separada. Coloque una pequeña bola de algodón en un cartucho limpio y luego añadir 5 l de extracto (por ejemplo, extracto de almendra) en el algodón. Encaje la parte superior del cartucho sobre el algodón y colóquelo en un cuadro dedicado o bolsa etiquetada con ese olor.
- Realice el mismo procedimiento fo una segunda aroma (por ejemplo, extracto de anís). Cambiar los guantes entre el manejo de diferentes aromas. Asegúrese de que la bola de algodón está completamente encerrado en el cartucho de tejido. NOTA: Expuesto fibras de la bola de algodón pueden causar que el animal tiene interés en la bola de algodón para fines de anidación en lugar de la propia esencia.
- A continuación, siga los pasos 3.6 a 3.10 utilizando un cartucho de papel fragrante durante los primeros seis ensayos, y el segundo cartucho tejido perfumada para el séptimo juicio.
5. Análisis de cintas de vídeo
- Para el bloque y las pruebas de habituación / deshabituación, tiene una persiana rater a condición experimental medir el tiempo olfateando cada bloque, con sniffing definido como contacto nasal con ese bloque. Si se desea, medir otros comportamientos tales como el tiempo para acercarse a la novela bloque (E) durante la prueba de 7 y la actividad total (el número de movimientos realizados a lo largo de la longitud y la anchura de la jaula de alojamiento) durante cada ensayo. Puntuar el tiempo dedicado olfateando unatiempo d acercarse desde la cinta de vídeo utilizando un cronómetro.
- De manera similar, para la prueba de habituación / deshabituación, tienen un evaluador ciego a condición experimental medir el tiempo empleado olfateando el cartucho, tiempo para acercarse al cartucho, y la actividad locomotora.
6. Estadísticas
- Analizar la prueba pellet enterrados utilizando estadística no paramétrica porque la latencia para encontrar el pellet puntuaciones tienden a mostrar la heterogeneidad de la varianza. Promediar la latencia para localizar el sedimento a través de los días 3-5 y luego comparar entre grupos de ratones usando una prueba U de Mann-Whitney. Del mismo modo, para la parte de pellets superficie de la prueba, analizar la latencia para encontrar el sedimento usando una prueba U de Mann-Whitney para comparar los genotipos.
- Para la prueba de bloque, analizar los datos de prueba de 7 (introducción del bloque de novela con aroma). Típicamente, emplear análisis no paramétricos para tener en cuenta la heterogeneidad de la varianza. Con el fin de analizar las diferencias en el tiempo dedicado olfateando ªbloque novela electrónico, así como el tiempo para acercarse a los bloques para los diferentes grupos experimentales, utilice la prueba U de Mann-Whitney. Utilice la prueba de Rango Firmado Wilcoxon para comparar el tiempo dedicado olfateando la novela bloque de tiempo dedicado a oler los bloques familiares.
- Para la prueba de habituación / deshabituación, conducta paramétrico análisis sobre ensayos 1, 6 y 7, similar a estudios previos 20. Si ratones muestran poco o ningún sniffing, utilice los análisis no paramétricos.
Representative Results
Los pellets, bloques, y las pruebas de habituación / deshabituación enterrados son evaluaciones altamente ventajosas del olfato en ratones. El uso de estas pruebas, hemos encontrado cambios significativos en el olfato en varios modelos de ratón genético de la enfermedad de Parkinson, incluyendo sobreexpresión de alfa-sinucleína (Thy1-Asyn) 18 y ratones knockout ATP13A2. Ambos ratones knockout Thy1-Asyn y ATP13A2 tardan más en encontrar el pellet enterrados que los controles 18. Figuras 1-3 muestran los datos recogidos de los ratones de tipo salvaje y ATP13A2 knockout. En la prueba de sedimento enterrado, ratones knockout muestran un aumento ATP13A2 latencia para encontrar el sedimento enterrado en comparación con los ratones de control de tipo salvaje (Figura 1). En la prueba de bloque, tanto de tipo salvaje y ratones knockout ATP13A2 olfatean la novela cuadra de la jaula de otro ratón en comparación con manzanas de su propia jaula (Figura 2). En los ratones de tipo salvaje prueba habituación / deshabituación mostrar habituación a un olor y luego aumentó oler cuando una novela olor se introduce (Figura 3).
Figura 1. Buried pellet de prueba. Latencia para encontrar el pellet en de tipo salvaje (n = 10) y ATP13A2 KO (n = 14) a 20-27 m de edad. * P <0,05, Mann-Whitney U.
Figura 2. prueba Tiempo entre calzos olfateando la novela bloque (E) en la prueba de bloque de tipo salvaje (n = 10) y ATP13A2 KO (n = 12) en ratones hembra a 20 -. 27m de edad. ΔΔ representa p <0,01 en comparación con los bloques A, B, y C de la misma genotipo. Mann-Whitney U.
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Figura 3. prueba de habituación / deshabituación. Tiempo olfateando un cartucho perfumado en ratones de tipo salvaje media (9 m edad, n = 7) a través de 6 pruebas y la introducción de un cartucho con una novela olor a juicio 7.
Discussion
Cada una de las pruebas que se describen en este estudio miden diferentes aspectos de la función olfativa en ratones. La prueba de pellets enterrado mide la motivación aspecto de alimentos del olfato, poniendo a prueba la capacidad de hambre (alimentos restringido, no privados de alimentos) ratones para detectar una pieza aceptable de cereal endulzada enterrado bajo la ropa de cama. La prueba mide el bloque más del aspecto social de la función olfativa, probando la capacidad de los ratones para discriminar entre su propio olor y la de una misma especie. La prueba de habituación / deshabituación evalúa la capacidad del ratón para discriminar entre olores inocuos conocidos y novedosos,. El uso de múltiples pruebas es importante la hora de caracterizar un nuevo modelo, ya que las anomalías en la motivación de alimentos o el miedo pueden contribuir a las diferencias observadas en los ratones mutantes en comparación con los controles. Por ejemplo, si sólo se realiza la prueba de bloque y la disminución de la inhalación del bloque que se ha observado es el olor de otro ratón, no está claro si hay una Olfactdéficit de memoria o una mejor respuesta de miedo a la misma especie que puede conducir a la evitación de ese bloque. Cuando se realizan varias pruebas y los déficits se observan en todas las pruebas, que apoya firmemente una interpretación de deterioro olfativo. Sin embargo, si se observan diferencias en una sola prueba, pero no los otros, entonces puede haber un deterioro olfativo más sutil pero será esencial para descartar otras explicaciones (por ejemplo, el miedo mayor o menor motivación de los alimentos). Factores importantes adicionales a tener en cuenta al probar ratones funciones olfativas incluyen la cepa de fondo y el sexo de los ratones. Diferentes cepas fondo genético (es decir, C57BL / 6, DBA, etc) pueden tener profundos efectos en el comportamiento del ratón, por lo tanto, se recomienda adaptar cada protocolo en ratones de tipo salvaje de la misma fondo antes de realizar todo el experimento. También se recomienda que los ratones macho y hembra comprobarse por separado el uno del otro porque el sistema olfativo masculino es altomente sensible a las hembras en la detección de celos y olfativa de una hembra en estro podría interferir con el rendimiento en las tres pruebas.
Algunos pasos son absolutamente críticos para seguir al probar el olfato en ratones. Es importante ser consciente de los olores el experimentador está introduciendo a los animales. El uso de guantes para los procedimientos es se requiere cambio esencial y frecuente de guantes entre los animales. Siempre es una buena práctica que el experimentador no usar colonia o perfume en días de exámenes olfato. Mientras que algunas partes del procedimiento son inflexibles, hay otras partes que pueden ser modificados y adaptados sin reducir la validez o la sensibilidad de la prueba. Por ejemplo, el número de ensayos de habituación puede aumentarse o disminuirse dependiendo de la cepa de ratones se está probando y la rapidez con que se habitúan a los estímulos. La principal limitación de estas pruebas es que todos ellos están impulsados por una cierta forma de motivación, ya sea comida o social, por lo quedifícil descartar por completo las anomalías en la motivación como una explicación cuando una alteración de la respuesta observada. Esto puede ser minimizado mediante el análisis de parámetros adicionales, tales como la actividad durante las pruebas y el tiempo de acercarse a los estímulos.
Una vez dominado, las pruebas se pueden utilizar fácilmente al examinar el fenotipo de modelos novedosos ratón de la enfermedad neurodegenerativa. Además, las pruebas que tienen la mayor potencia pueden ser incluidos en los estudios preclínicos de prueba posibles terapias (para un ejemplo véase la ref. 25).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cap'n Crunch | Quaker Oats | 30000065310 | |
| Wooden Blocks | Lara's Crafts | 10144 | |
| Almond Flavor Extract | Kroger | 011110664716 | |
| Anise Flavor Extract | Kroger | 011110615619 | |
| Banana Flavor Extract | Kroger | 011110669919 | |
| Coconut Flavor Extract | Kroger | 011110669889 | |
| Lemon Flavor Extract | Kroger | 011110669957 | |
| Orange Flavor Extract | Kroger | 0011110669964 | |
| Tissue Cartridges | Sigma-Aldrich | Z672122-500EA | Manufactured by Simport no: M490-2 |
| Cotton Balls | Kroger | 11110793119 | |
| Mouse Cages | Ancare | 19 x 29 x 12.7 cm | |
| Camcorder | Sony | HDR-HC9 | |
| MiniDV Tapes | Sony DVC premium | 27242523432 | 60 minute long play |
References
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