Summary
Voies de réparation d'ADN sont essentielles pour le maintien de l'intégrité du génome et la prévention de la mutation et le cancer. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique par l'observation directe des aberrations chromosomiques en métaphase se propage à partir de cellules B de souris en utilisant hybridation fluorescente in situ (FISH) pour les répétitions d'ADN télomérique dans.
Abstract
Réparation de l'ADN défectueux entraîne une augmentation de l'instabilité génomique, ce qui est la cause de mutations qui conduisent à la tumorigenèse. L'analyse de la fréquence et le type d'aberrations chromosomiques dans des types cellulaires différents permet défauts dans les voies de réparation d'ADN à être élucidés. Compréhension des mammifères réparation de l'ADN en biologie a été grandement aidé par la production de souris avec des coups de grâce dans les gènes spécifiques. L'objectif de ce protocole est de quantifier l'instabilité génomique dans les lymphocytes B de souris. Étiquetage des télomères en utilisant des sondes PNA-FISH (acide nucléique peptidique - hybridation fluorescente in situ) facilite l'analyse rapide de l'instabilité génomique des spreads métaphase chromosomiques. Les cellules B ont des avantages spécifiques par rapport à des fibroblastes, car ils ont une ploïdie normale et un indice mitotique élevé. Culture à court terme des cellules B permet donc une mesure précise de l'instabilité génomique dans une population de cellules primaires qui est susceptible d'avoir moins mutation génétique secondaires que ce que l'on trouve généralement dans les fibroblastes transformés ou des lignées cellulaires de patients.
Introduction
Le cancer est causé par l'accumulation de mutations affectant les gènes qui régulent la croissance cellulaire normale. Mutation est une conséquence de changements dans la structure et la séquence du génome causée par des dommages à l'ADN. lésions de l'ADN peut se faire par une variété de processus, y compris des agents exogènes tels que des rayonnements ionisants, et en tant que sous-produit du métabolisme cellulaire normal, comme la désamination spontanée de bases nucléotidiques ou des dommages survenus par contact avec des espèces réactives de l'oxygène 1.
Bien que les cellules de mammifères possèdent une gamme d'activités de réparation qui peuvent inverser les dommages de l'ADN ou de rétablir l'ordre sur les sites de coupure, les mutations s'accumulent néanmoins tout au long de la durée de vie d'une cellule. dommage de l'ADN peut en outre contribuer à la sénescence et la perte d'activité de cellules souches, deux processus qui sont associées à la maladie de vieillissement associée à deux. Comprendre la réparation des lésions de l'ADN est donc d'une importance capitale dans la lutte contre deux signequestions ificant en matière de santé publique. Plus de preuves suggère que les mammifères voies de réparation d'ADN peuvent contribuer à l'évolution du génome des cellules cancéreuses 3,4, ce qui rend encore plus impératif de comprendre les processus impliqués dans la répression de mutation au niveau moléculaire.
La visualisation directe des aberrations chromosomiques est un moyen puissant et quantitatifs de déterminer l'étendue de l'instabilité génomique dans un type cellulaire particulier. Chromosomes condensés à partir de cellules en métaphase peuvent être isolés et contrôlés en utilisant la microscopie à fluorescence ou la lumière. Ces approches cytogénétiques ont été dans la pratique depuis plusieurs décennies et peuvent être utilisés pour démontrer l'apparition des translocations spécifiques ou les types d'aberrations chromosomiques associées à la perte des activités de réparation d'ADN. Le protocole se prête à plusieurs extensions potentielles: les chromosomes peuvent être marquées avec des sondes pour caryotype spectral (SKY) ou multicolore fluorescent hybridation in situ(MFISH) pour identifier des translocations 5,6. Ces techniques permettent également la fréquence des translocations chromosomiques et la structure de translocations chromosomiques complexes à déterminer, qui fournit des informations supplémentaires au-delà de ce qui est possible avec ce protocole. En variante, des sondes spécifiques des séquences peuvent être produites et utilisées pour tester la fréquence de cassure de l'ADN génomique dans les sites sélectionnés 7.
Dans ce protocole, nous décrivons la préparation du chromosome métaphasique se propage à partir de lymphocytes B. Un acide nucléique peptidique (PNA) sonde marquée par fluorescence pour des répétitions télomériques est utilisé, qui marque de manière efficace les télomères se propage chromosome en métaphase Ce protocole présente plusieurs avantages. Les cellules B peuvent être amenés à se développer à l'index mitotique élevé de sorte que les écarts de haute qualité peuvent toujours être produites. Cellules B de souris génétiquement modifiées sont aussi beaucoup moins susceptibles de contenir des mutations génétiques secondaires qui peuvent fausser l'analyse de la contributionde gènes spécifiques à l'intégrité du génome. L'approche PNA-FISH peut être complété en une seule journée, et permet notation plus précise des cassures chromosomiques. En utilisant cette approche, en particulier en combinaison avec des équipements spécifiques décrites dans ce protocole, il est possible de produire de très cohérentes, les écarts de haute qualité et d'analyser rapidement le taux et le type d'instabilité génomique.
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Protocol
Cette procédure a été approuvée par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'université Rutgers, l'Université d'État du New Jersey. Les souris ont été traitées en conformité avec le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les scientifiques devraient consulter leurs organisations nationales et institutionnelles animaux de lignes directrices établis et approuvés.
Avant de commencer, préparer les solutions énumérées dans le tableau 1.
1. cellules B Isolement et activation
Euthanasier une souris à l'aide de CO 2 suivie d'une dislocation cervicale. Placez la souris de sorte que le côté gauche du corps est en pulvériser la souris avec 70% d'éthanol jusqu'à ce que la fourrure est humide. On dissèque la rate et le placer dans une boîte de culture tissulaire de 35 mm avec un tampon de lavage 2 ml. Dans une hotte à flux laminaire, casser doucement la rate dans la boîte de culture tissulaire en utilisant l'extrémité plate d'une seringue de 5 ml.
- Insérer un filet de nylon 70 um dans un 50ml tube et transférer l'échantillon de la rate dans 2 ml de tampon de lavage dans la maille de nylon. Perturber doucement la rate dans le maillage en utilisant la partie plate de la seringue.
- Rincer à l'arrière de la seringue et la plaque de 35 mm avec 8 ml de tampon de lavage et filtrer à travers la maille 70 um de nylon. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml de tampon de lyse ACK. Introduire à la pipette de haut en bas brièvement perturber bouquets et incuber pendant 5 min. Ajouter 10 ml de tampon de lavage et centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension le culot en appuyant sur le fond du tube, puis par pipetage dans 1 ml de tampon de lavage. Ajouter 50 ul d'anticorps anti-CD43 microbilles MACS et laisser incuber sur de la glace pendant 30 min. Ajouter 10 ml de tampon de lavage, mélanger délicatement et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Ajouter 10 ml de tampon de lavage, mélanger délicatement et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Mettre en place unMini-MACS colonne en plaçant une colonne sur l'aimant MACS. Placer un tube de 15 ml conique située sous la colonne. Ajouter 1 ml de tampon de lavage à colonne et le laisser courir à travers le tube de 15 ml.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de tampon de lavage. Chargez l'échantillon dans la colonne après le tampon de lavage a parcouru.
- Après que l'échantillon a parcourir la colonne, ajouter 1 ml de tampon de lavage pour laver la colonne. Ajouter 7 ml de tampon de lavage directement à l'échantillon prélevé dans le tube de 15 ml.
- Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Transférer le volume requis de cellules nécessaires pour 5.000.000 cellules / puits dans un tube de 50 ml. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Supplément milieu des cellules B avec des LPS à 1: 500 et IL4 1: 1000.
- Aspirer le surnageant et ajouter le volume approprié de milieu de lymphocytes B supplémenté nécessaire à la concentration finale de 1.000.000 cellules / ml.
- cellules de la plaque dans des plaques de 6 puits avec 5 ml de cellules à 1.000.000 cellules / ml et placer dans un humidified incubateur de culture cellulaire à 37 ° C, 5% CO 2.
2 cellules B Fixation
- Ajouter 50 ul de la colcémide pour le puits contenant 5 ml de cellules B (pour une concentration finale de 100 ng / ml) et incuber 1 h à 37 ° C. Préchauffer solution à 75 mM de KCl dans un bain-marie à 37 °. Transférer les cellules B à un 15 ml étiqueté tube. Couvrir l'étiquette avec un ruban et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre en suspension le culot par pipetage. Ajouter 5 ml de la baisse de KCl préchauffé à goutte tout en tapant ou pulsation sur un vortex.
- Ajouter 10 ml de KCl et mélanger en inversant. Incuber dans un bain d'eau à 37 ° pendant 15 min. Ajouter 5 gouttes de fixateur frais et mélange par inversion. Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre le culot par aspiration et refoulement.
- Ajouter 5 ml de baisse du fixateur frais à goutte tout en tapant ou pulsation sur une vortex. Ajouter 10 ml supplémentaires de fixateur et incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Centrifugeuse à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant en laissant 1 ml dans le tube et remettre en suspension par pipetage. Ajouter 14 ml de fixateur frais et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
- Répétez l'étape 2.7 fois plus.
- Ajouter 14 ml de fixateur frais. Sceller les bouchons avec du Parafilm et stocker la nuit à -20 ° C.
3 Préparation des étalements de chromosomes en métaphase
- Définir une chambre environnementale régulée à 22,9 ° C et 52% d'humidité.
- Centrifugeuse les cellules B fixé à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Aspirer fixateur laissant 70 pi dans le tube et remettre en suspension par pipetage.
- Placer les lames marquées dans la chambre d'humidité à un angle de 35 °. Baisse de 35 pi des cellules B remises en suspension sur une lame et déposer deux diapositives par échantillon. Laisser sécher les lames dans la chambre humide pendant 30 min, puis stocker les diapositivesdans une boîte, à 37 ° C.
4. télomères PNA FISH
- Préparation de la sonde
- Formamide désionisée pré-chaud à 37 ° C. Mélanger 2 pi de sonde de PNA avec des télomères formamide préchauffé 7 pi désionisée et incuber à 37 ° C sous agitation pendant 1 heure.
- Préchauffer maître FISH mélange à 37 ° C. Ajouter 7 pi préchauffé maître FISH mélange au mélange de l'étape 4.1.1 et incuber à 37 ° C pendant 1-3 heures.
- Dénaturer le mélange de la sonde pendant 8 min à 80 ° C. Pré-recuire la sonde pendant 1 heure à 37 ° C.
- Le prétraitement des diapositives chromosomiques
- Pré-réchauffer un bocal en verre coulissante coloration contenant 50 ml de HCl 0,01 M à 37 ° C dans un bain d'eau.
- Placer les lames dans un pot différent lame de verre-coloration contenant 2x SSC pendant 5 min à température ambiante.
- Ajouter 2 ul de la pepsine actions pour le verre préchauffé pot coulissant coloration et mélanger en inversant. Placer les lames dans ce sl de verrepot ide-coloration et incuber 90 secondes à 37 ° C.
- Laver les lames 2x dans un bocal en verre coulissant différente coloration contient 1x PBS pendant 5 min de chaque à la température ambiante en agitant. Ensuite, laver les lames pendant 5 min dans du PBS 1X / MgCl 2 à la température ambiante en agitant.
- Placer les lames dans un bocal en verre coulissante coloration fraîchement préparé contenant 1% de formaldéhyde / PBS 1x / MgCl 2 pendant 10 min à température ambiante.
- Laver les lames pendant 5 min dans un bocal en verre coulissant différente coloration contient 1x PBS à température ambiante en agitant.
- Préparer une série de déshydratation de l'éthanol en avoir séparé les bocaux en verre coulissante coloration contenant 70%, 90% et 100% d'éthanol.
- Placer les lames dans chaque pot pendant 3 minutes, en commençant avec 70% d'éthanol, puis 90% d'éthanol, puis 100% d'éthanol. Placez les pots d'éthanol à -20 ° C lorsque vous avez terminé.
- Laisser les lames sécher à l'air en appuyant sur un excès d'éthanol sur une serviette en papier et étaiement diapositives à un angle de 35 °. Une fois sec, maRK une zone de 18 x 18 mm pour l'hybridation sur le dos des lames à l'aide d'un stylet en diamant.
- La dénaturation des lames de FISH
- Appliquer formamide 120 ul 70% déminéralisée / 2X SSC à un 24 x 60 mm lamelle. Appuyez sur la diapositive à la lamelle. Dénaturer la lame à 80 ° C sur une plaque chaude pendant 90 secondes.
- Coulisser rapidement et soigneusement la lamelle couvre-objet et de placer la lame dans la glace froide éthanol à 70% pendant 3 min, suivie de 90% d'éthanol, et 100% d'éthanol pour chaque 3 min. Laisser les lames sécher à l'air.
- Préparer une chambre humide en alignant une boîte en plastique avec un couvercle étanche et papier de soie humide. Le papier doit être humide, mais pas saturé d'eau.
- Dans une chambre humide, appliquer le mélange de la sonde pré-recuit de l'étape 4.1.3 pour la zone marquée sur la lame, couvrir avec un couvercle de glissement mm 18 x 18 et incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
- Lavage post-incubation
- Préchauffer 50% de formamide / SSC 2x, 1x SSC et 4x SSC / 0,1% de Tween-20 à 45 °; Bain d'eau.
- Retirez délicatement les lamelles et laver les lames dans préchauffé 50% de formamide / 2x SSC 3xfor 5 min chacun dans l'obscurité et la secousse. Laver les lames dans préchauffé 1x SSC 3xfor 5 min chacun, secouant. Enfin, laver les lames dans préchauffé 4x SSC / 0,1% de Tween-20 3xfor 5 min chacun.
- Colorer les lames pendant 3 min dans DAPI dans un bocal en verre coulissant de coloration lumière protégée.
- Laver les lames pendant 5 min dans du SSC 2x, secouant. Appliquer 35 pi de milieu de montage Mowiol, couvrir avec 24 x 60 mm lamelles et stocker les lames à 4 ° C.
5 L'analyse microscopique des chromosomes
- Analyser les diapositives en métaphase l'aide d'un microscope à épifluorescence standard. Utilisez une plate-forme d'imagerie avec une étape automatisée telle que la plate-forme métasystèmes Metafer pour obtenir de meilleurs résultats. Pour chaque diffusion de la métaphase, de recueillir une image de fluorescence DAPI pour visualiser les chromosomes, et une image pour le signal fluorescent du télomère probe. (Par exemple, d'autres substances fluorescentes Cy3 sont disponibles et fonctionnent aussi bien.)
- Superposition des images avec un programme d'analyse d'image et d'analyser.
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Representative Results
Chromosomes métaphasiques dérivés d'une cellule doivent former un ensemble discret contenant 40 chromosomes (si l'on utilise des cellules de souris) (figure 1A). Chaque chromosome a un centromère, à une extrémité, qui est visible comme une sphère de lumière bleue. Dans chromosomes normaux, deux signaux de télomères sont observés à la fin des chromatides et deux signaux de chaque centromère. Les noyaux en interphase seront présents sur la lame ainsi. Ceux-ci seront visibles comme des sphères bleues, avec des signaux de télomères rouges, mais pas de chromosomes condensés (voir par exemple la figure 1B). Les noyaux en interphase peuvent être ignorés aux fins de la quantification de l'instabilité génomique.
Un certain nombre de différents types d'aberrations chromosomiques peut être observée. Pauses chromatides des ruptures dans l'un des deux chromatides sœurs qui composent chaque chromosome métaphasique. Ils peuvent être marqués si l'enquêteur voit une discontinuité dans une chromatide, ou la perte d'un signal de télomère unique d'un bout ofa chromosome (voir les exemples de la figure 1B). cassures chromosomiques sont identifiées par la recherche de la perte de signaux de télomères à partir de l'extrémité d'un chromosome (par exemple à la figure 1C). Dans certains cas, l'extrémité brisée du chromosome peut être observé sous forme de fragment avec des signaux de télomères de la même propagation de métaphase (comme c'est le cas sur la figure 1C). Dans d'autres cas, la fin de chromosome peut ne pas être présente.
Plusieurs types de réarrangements chromosomiques peuvent être observées. Chromosomes radiales prendre un certain nombre de formes, caractérisé par des réarrangements complexes impliquant deux chromosomes (trois exemples sont présentés avec des flèches rouges dans la figure 1D). Chromosomes radiales également réarrangements plus complexes, impliquant trois ou plusieurs chromosomes. Les chromosomes peuvent aussi devenir joints pour former chromosomes dicentriques, qui apparaissent comme une fusion bout-à-bout avec des centromères de chromosomes aux deux extrémités (représenté par une flèche sur la figure 1D blanc </ Strong>). Les translocations sont un type de translocation entre les centromères des deux chromosomes, qui apparaissent comme quatre bras de chromatides sœurs attachées à un seul centromère (voir la figure 1E).
Figure 1F montre une métaphase qui ne possède pas les signaux des télomères présents. Absence de signaux de télomères peut se produire des erreurs dans la préparation de la sonde ou de bulles d'air dans la lamelle lors de l'hybridation.
Figure 1: aberrations chromosomiques dans les cellules de souris B comme visualisées par PNA FISH télomères. A) La structure des chromosomes d'une cellule normale de la souris B à la métaphase. 40 chromosomes sont visibles, avec deux signaux de télomères à chaque extrémité. B) Une cellule présentant deux cassures de chromatides (flèches vertes). C) D) Une cellule affichant 3 chromosomes radiales (flèches rouges) et un chromosome dicentrique (flèche blanche). E) Une propagation de la métaphase avec un chromosome avec une translocation de Robertson (flèche jaune ). F) Un exemple d'une hybridation échoué, montrant chromosomes sans signaux télomériques. La barre d'échelle représente 10 um dans chaque image. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Alors que les lymphocytes B activés sont particulièrement adaptés à la préparation des étalements de chromosomes mitotiques, d'autres types de cellules peuvent également être utilisés. Lymphocytes T part un grand nombre des avantages de cellules B, comme elles peuvent être purifiées à partir de ganglions lymphatiques ou de la rate, et ont un indice mitotique élevé lorsqu'ils sont stimulés par la croissance dans un milieu contenant des mitogenes appropriés 8. Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont également adaptés pour l'analyse de métaphases chromosome 9. Si celles-ci ne sont pas disponibles, des cellules de fibroblastes peuvent être utilisés, bien qu'un traitement plus long avec colcémide (par exemple, 16 heures avec colcémide à une concentration finale de 10 ng / ml) est recommandé pour piéger davantage de cellules en métaphase avant fixation.
Nous constatons que la cohérence de la préparation du fuseau de confitures est grandement facilitée par l'abandon des chromosomes fixes dans une chambre à humidité contrôlée tels que les CDS-5 Thermotron cytogénétique chambre de séchage, mais il est possible d'obtenir de bons résultats while de travail à un banc en fonction de l'humidité et de la température de l'environnement de laboratoire. Pour obtenir des résultats fiables, il est conseillé de marquer des aberrations chromosomiques à partir d'au moins 100 métaphases par échantillon. Comme le processus de l'imagerie manuellement chaque métaphase dans chaque canal peut être laborieux, nous acquérons métaphases utilisant un système de microscopie automatisée métasystèmes Metafer4, ce qui peut rapidement trouver et précision numériser un grand nombre de chromosomes en métaphase.
L'analyse des chromosomes en métaphase sondes marquées avec des télomères est idéal pour la mesure de chromosomes et de chromatides pauses, et les signaux de télomères faciliter également l'identification des réarrangements chromosomiques complexes telles que des fusions et des structures radiales. La coloration des chromosomes en métaphase fixes avec la solution de Giemsa est également approprié pour la quantification des aberrations chromosomiques, et offre l'avantage de ne pas nécessiter la microscopie à fluorescence 10. Étiquetage des télomères avec une sonde PNA pantelomeric s'étend le range des aberrations chromosomiques qui peuvent être quantifiés, en permettant l'identification des fusions des télomères, qui se posent, par exemple, dans les cellules de souris knock-out pour DNAPKcs 11. PNA-FISH peut également être utilisé pour mesurer les fréquences des anomalies des télomères, y compris les chromosomes duplications des télomères et chromatides perte des télomères 12,13. La perte d'un signal de télomère peut être causé par le raccourcissement des télomères ainsi que par des cassures chromosomiques. PNA-FISH peut être utilisé pour mesurer la longueur des télomères sensibilité en utilisant Q-FISH (FISH quantitative) 14.
Les cellules dépourvues différentes activités de réparation d'ADN ont tendance à s'accumuler différents types d'aberrations chromosomiques. Par exemple, la carence en facteur 53BP1 dommages à l'ADN de réponse, conduit à l'accumulation du chromosome 15 se brise. En revanche, une forte proportion de structures chromosomiques radiale complexes sont observés dans les cellules dépourvues des gènes BRCA1 4. Ces réarrangements chromosomiques sont variés dans leur structure exacte,mais toujours impliquer la fusion de la matière à partir de deux ou plusieurs chromosomes. Lorsque les cellules ont des niveaux très élevés d'instabilité génomique, comme par exemple se produit après le traitement avec des doses élevées d'agents qui provoquent des cassures de l'ADN, il devient de plus en plus difficile de marquer des aberrations chromosomiques particuliers, ce qui place une limite sur la dynamique de l'expérience.
Quantification des cassures chromosomiques et des réarrangements des écarts de métaphase est utile pour tester si les gènes spécifiques ont un rôle dans la réparation d'ADN. Un problème potentiel en utilisant une analyse de chromosome en métaphase à cet effet est que les cellules qui n'ont pas les activités de réparation d'ADN peuvent ne pas se développer normalement. Si la réparation des cellules déficientes ne parviennent pas à la métaphase, l'importance d'un gène de la médiation de réparation de l'ADN peut être sous-estimée. Par exemple, RNF8 - / - cellules, qui sont soumis à p53-dépendante de la sénescence, montrent un niveau modeste de l'instabilité chromosomique, alors que RNF8 - / - p53 - / - cellules double-knockout montrent many aberrations chromosomiques plus, car la suppression de p53 permet une meilleure croissance de la cellule 16. Il est donc important de coupler les mesures de l'instabilité chromosomique avec un test du cycle cellulaire, de montrer que les populations de cellules knock-out peuvent se développer normalement et contenir une proportion significative de cellules en mitose.
L'observation d'une instabilité génomique n'est pas par lui-même donner un aperçu de la fonction exacte de l'activité de réparation fournie par un gène spécifique, mais seulement agit comme un point de départ pour des études mécanistiques plus. Enfin, bien que cette approche est utile pour mesurer cassures chromosomiques et des réarrangements complexes, l'utilisation de mFISH ou SKY est recommandé pour quantifier les translocations chromosomiques. Ces techniques commencent également à des écarts de chromosomes en métaphase, mais utilisent un cocktail de sondes "peinture" de chaque chromosome avec une combinaison spécifique de fluorophores. Chacune de ces techniques est recommandé de mesurer le spectre complet du chromosome Instabilité dans les cellules de réparation déficiente.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflits d'intérêts.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le NIH subvention R00 CA160574 (SFB) et par une bourse du Programme de formation en biotechnologie Rutgers (à SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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