Summary
DNA修復経路は、ゲノムの完全性の維持および変異および癌を予防するために必須である。このプロトコルの目的は、中期の染色体異常の直接観察によりゲノム不安定性を定量化することであるテロメアDNA反復のためのin situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光を使用して、マウスのB細胞から広がる。
Abstract
不良DNA修復は、腫瘍形成につながる変異の根本的な原因であるゲノム不安定性を増加につながる。異なる細胞型における染色体異常の頻度および種類の分析は、DNA修復経路に欠陥を解明することを可能にする。哺乳動物のDNA修復生物学を理解することは、大幅に特定の遺伝子におけるノックアウトとマウスの作製に助けられてきた。このプロトコルの目的は、マウスBリンパ球におけるゲノム不安定性を定量化することである。 PNA-FISHプローブ（ペプチド核酸-蛍光in situハイブリダイゼーション ）を使用してテロメアの標識は、中期染色体スプレッドのゲノム不安定性の迅速な分析を容易にします。彼らは、正常な倍数性及びより高い分裂指数を持っているので、B細胞は、線維芽細胞に対して特有の利点を有する。 B細胞の短期培養は、したがって、より少ない二次遺伝子突然変異を有する可能性がある一次細胞集団におけるゲノム不安定性の正確な測定を可能に一般的に変換された線維芽細胞または患者の細胞株に見られるものより秒。
Introduction
癌は、正常な細胞増殖を調節する遺伝子に影響を与える変異の蓄積によって引き起こされる。突然変異は、DNAの損傷によって引き起こされるゲノムの構造および配列の変化の結果である。 DNA損傷は、電離放射線のような外因性の薬剤を含む、プロセスのさまざまなを通して発生し、副生成物などのヌクレオチド塩基または反応性酸素種1との接触によって生じた損傷の自発的脱アミノ化などの通常の細胞代謝のようにすることができる。
哺乳動物の細胞がDNA損傷を逆転またはブレーク·サイトで順序を復元することができ、修復活動の範囲を有するが、変異は、それにもかかわらず、細胞の生涯を通じて蓄積する。 DNA損傷は、さらに、老化および老化関連疾患2に関連付けられた幹細胞を、2つの方法の効力の喪失に寄与することができる。 DNA損傷の修復を理解することは、2の符号に対処する上で、したがって、中央に重要である公衆衛生におけるificant問題。増加する証拠は、哺乳動物のDNA修復経路は、それが一層急務分子レベルでの突然変異の抑制に関与するプロセスを理解すること、癌細胞ゲノム3,4の進化に寄与し得ることを示唆している。
染色体異常の直接可視化は、特定の細胞型においてゲノム不安定性の程度を決定するための強力かつ定量的な手段である。分裂中期の細胞からの凝縮染色体を単離し、光または蛍光顕微鏡を用いて検査することができる。このような細胞遺伝学的アプローチは、数十年間実際にされており、転座またはDNA修復活性の喪失に関連する染色体異常の特定のタイプの外観を示すために使用することができる。プロトコルは、いくつかの潜在的な機能拡張に適しています：染色体は、in situハイブリダイゼーションスペクトル核型分析のためのプローブ（SKY）または多色の蛍光で標識することができる（mFISH）が転座5,6を識別します。これらの技術はまた、染色体転座の頻度と、このプロトコルで可能なものを超えて、追加情報を提供して決定することが、複雑な染色体転座の構造を、有効にします。代替的に、配列特異的なプローブが生成され、選択されたゲノム部位7においてDNA切断の頻度を試験するために用いることができる。
このプロトコルでは、中期染色体の調製は、Bリンパ球から広がる記述する。テロメア反復のための蛍光標識されたペプチド核酸（PNA）プローブを効率的に分裂中期染色体テロメアマークが使用されるが、このプロトコルはいくつかの利点を有する広がる。 B細胞は、高品質のスプレッドは一貫して製造することができるように、高い分裂指数で成長するように誘導することができる。遺伝的に改変されたマウス由来のB細胞は、はるかに少ない寄与度の分析を混乱させる可能な二遺伝的変異を含む可能性が高いゲノムの完全性の特異的な遺伝子。 PNA-FISH法は、1日で完了し、染色体切断のより正確なスコアリングを可能にすることができます。特に、このプロトコルに記載されている特定の装置と組み合わせて、このアプローチを用いることにより、非常に一貫した、高品質のスプレッドを生成し、急速に速度およびゲノム不安定性のタイプを分析することが可能である。
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Protocol
この手順は、ラトガース、ニュージャージー州の州立大学で動物実験委員会によって承認された。マウスは、実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って処理した。科学者たちは、確立され、承認されたガイドラインについては、彼らの国や機関投資家、動物の組織に相談してください。
開始前に、 表1に列挙溶液を調製する。
1 B細胞の単離とアクティベーション
頸椎脱臼に続いてCO 2を使用して、マウスを安楽死させる。体の左側がアップしているので、マウスを置き、毛皮が湿っているまで、70％エタノールでマウスをスプレー。 2mLの洗浄緩衝液で35mm組織培養皿に脾臓および場所を解剖。層流フードでは、静かに5ミリリットルの注射器の平らな先端を使って組織培養皿に脾臓を壊す。
- 50に70μmのナイロンメッシュを挿入mlチューブとナイロンメッシュに2ミリリットルの洗浄緩衝液で脾臓サンプルを転送する。静かにシリンジの平らな端を使用してメッシュに脾臓を混乱させる。
- 70μmのナイロンメッシュを通して洗浄バッファーとフィルタ8mlで注射器の背面に35mmのプレートをすすぐ。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。
- 吸引し、上清を廃棄し、ACK溶解バッファー3mlにペレットを再懸濁します。塊を破壊し、5分間インキュベートするようにピペット上下簡潔に。 4℃で10分間300×gでの洗浄緩衝液および遠心の10ミリリットルを追加します。
- 吸引し、上清を廃棄し、洗浄緩衝液1ミリリットル中にピペット操作により、次にチューブの底をタップしてペレットを再懸濁すること。抗CD43 MACSマイクロビーズを50μlを加え、30分間氷上でインキュベートする。 4℃で10分間300×gで、洗浄緩衝液10ミリリットルを追加し、穏やかに混合し、遠心。 4℃で10分間300×gで、洗浄緩衝液10ミリリットルを追加し、穏やかに混合し、遠心。
- セットアップするMACS磁石に列を配置することによってミニMACSカラム。コラム下のラベル15ミリリットルコニカルチューブを配置します。カラムに洗浄緩衝液1ミリリットルを加え、15 mlチューブに通すことができます。
- 洗浄バッファー1mlに再懸濁上清を吸引。洗浄バッファーが通過実行された後、列にサンプルをロードします。
- 試料がカラムに流した後、カラムを洗浄する1ミリリットルの洗浄緩衝液を加える。 15mlチューブにおける収集されたサンプルを直接洗浄バッファー7mlのを追加します。
- 血球計数器を用いて細胞を数える。 50ミリリットルチューブに/ウェル500万細胞のために必要な細胞の必要量を転送します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。 500およびIL4 1：LPS 1サプリメントB細胞培地1,000
- 上清を吸引1,000,000細胞/ mlの最終濃度のために必要な補充したB細胞培地の適切なボリュームを追加する。
- humidifi 1,000,000細胞/ mlの場所で細胞を5 mlの6ウェルプレート中の細胞をプレート37°C、5％CO 2での細胞培養インキュベーターエド。
2のB細胞固定
- ウエル（100 ngの/ mlの最終濃度のために）B細胞の5ミリリットルを含有し、37℃で1時間インキュベートするコルセミドを50μl加える。 37℃の水浴中でPrewarm 75mMのKCl溶液。ラベルされた15mlチューブにB細胞を移す。 4℃で10分間300×gでテープと遠心分離機を持つラベルをカバー。
- チューブ内の1ミリリットルを残して上清を吸引し、ピペッティングによりペレットを再懸濁。タッピングあるいはボルテックスに脈動しながら降下によって予め温め塩化カリウム降下の5ミリリットルを追加します。
- KClを10ミリリットルを加え、転倒混和する。 15分間37℃の水浴中でインキュベートする。反転させ、新鮮な固定液とミックスの5滴を追加します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。ピペッティングによりチューブ再懸濁ペレット中の1ミリリットルを残して上清を吸引。
- VORをタップまたは脈動しながら降下によって新鮮な固定降下の5ミリリットルを追加します。TEX。固定液をさらに10 mlを加え、室温で30分間インキュベートする。
- 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。ピペッティングによりチューブに再懸濁に1ミリリットルを残して上清を吸引。 4℃で10分間300×gで、新鮮な固定液と遠心の14ミリリットルを追加します。
- 繰り返し手順2.7倍以上である。
- 新鮮な固定液14ミリリットルを追加します。パラフィルムでキャップを密封し、-20℃で一晩保管してください。
中期染色体スプレッドの調製
- 22.9℃、52％の湿度に調整された環境室を設定します。
- 遠心分離し、4℃で10分間300×gでB細胞を固定。吸引し固定液は、ピペッティングによりチューブに再懸濁に70μLを残す。
- 35°の角度で湿度室中の標識スライドを配置します。スライド上に再懸濁したB細胞の35μlのを削除し、サンプルあたり2スライドをドロップします。その後、スライドを保存するスライドは30分間湿度室で乾燥することができます37℃でスライドボックス中。
4。テロメアのPNA FISH
- プローブの調製
- 37℃に予備温脱イオンホルムアミド。 7μlの脱イオン予め温めホルムアミドとテロメアPNAプローブ2μlのを混合し、1時間振とうしながら37℃でインキュベートする。
- 37℃に予備暖かいFISHマスターミックス。ステップ4.1.1からの混合物に7μlを予め温めFISHマスターミックスを追加し、1〜3時間、37℃でインキュベートする。
- 80℃で8分間のプローブ混合物を変性させる。 37°Cで1時間プローブをあらかじめアニールする。
- 染色体スライドの前処理
- 水浴中で37℃に0.01 MのHClを50mlの入ったガラス製スライド染色ジャーを予め温める。
- 室温で5分間、2×SSCを含む別のスライドガラス染色ジャー内の場所スライド。
- 予め温めたスライドガラス染色ジャーにペプシン株式の2μLを加え転倒混和する。このガラスSLにスライドを移し、IDE-染色ジャー、37℃で90秒間インキュベートする。
- スライドが揺れ、室温で5分間ずつ1×PBSを含む別のガラススライド染色ジャー中で2倍洗う。そして揺れ、室温で1×PBS / MgCl 2を 5分間スライドを洗浄します。
- 室温で10分間、新たに調製した1％ホルムアルデヒド/ 1×PBS / MgCl 2を含むガラススライド染色ジャーにスライドを移す。
- 揺れ、室温で1×PBSを含む別のガラススライド染色ジャー中で5分間スライドを洗浄する。
- 70％、90％、および100％エタノールを含有する別個のスライドガラス染色ジャーを有することにより、エタノール脱水シリーズを調製する。
- その後、70％エタノール、90％エタノール、次いで100％エタノールから出発し、3分間、各ジャーにスライドを移す。終了したら、-20℃でのエタノールの瓶を置きます。
- ペーパータオルの上に過剰のエタノールをタップし、35°の角度でスライドを支えて空気の乾燥にスライドを許可します。乾燥したら、マダイヤモンドペンを使用して、スライドの背面にあるハイブリダイゼーションのために18×18ミリメートルの領域をRK。
- FISH用のスライドの変性
- 24×60ミリメートルのカバースリップに120μlの70％脱イオン化ホルムアミド/ 2×SSCを適用します。カバーガラススライドをタッチします。 90秒間、ホットプレート上で80℃でスライドを変性さ。
- 迅速かつ丁寧にカバースリップをオフにスライドさせ、90％エタノールに続いて3分間の氷冷70％エタノール、および3分間、100％エタノール各スライドに配置します。スライドを空気乾燥させます。
- タイトな蓋とウェットティッシュペーパーでプラスチックの箱を並べて湿潤チャンバーを準備します。論文は湿ってもよいが、水で飽和しないようにしてください。
- 湿度の高い室では、18×18ミリメートルのカバースリップでカバーし、1時間、37℃でインキュベート、スライド上のマークされた領域へのステップ4.1.3からプレアニールプローブミックスを適用します。
- ポストインキュベーションウォッシュ
- 前の温かい50％ホルムアミド/ 2×SSC、1×SSC、および4×SSC / 0.1％Tween-20を45°における; Cの水浴。
- 慎重にカバースリップを除去し、暗いし、振盪に予め温めておいた50％ホルムアミド/ 2×SSC 3xfor 5分で、それぞれのスライドを洗う。揺れ、予め温めた1×SSC 3xfor 5分ごとにスライドを洗浄します。最後に、予め温めておいた4×SSC中でスライドを洗浄/ 0.1％のTween-20 3xfor 5分の各。
- 光保護されたガラススライド染色ジャー中DAPIでの3分間のスライドを染色する。
- 揺れ、2×SSC中で5分間スライドを洗浄する。 24×60ミリメートルのカバースリップで覆い、モヴィオール封入剤35μlのを適用し、4℃でスライドを保存します。
染色体の顕微鏡分析5。
- 標準落射蛍光顕微鏡を用いて中期スライドを分析します。最良の結果を得るために、そのようなメタシステムMetaferプラットフォームとして自動化されたステージとイメージングプラットフォームを使用してください。テロメアpから各中期スプレッドは、染色体を可視化するためにDAPI蛍光のために一つの画像を収集し、蛍光シグナルのための一つの画像ローブ。 （ 例えば 、Cy3標識他の蛍光体が利用可能であり、同様に良好に動作します。）
- 画像解析プログラムで画像をオーバーレイして分析する。
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Representative Results
一つの細胞から誘導された分裂中期染色体は、染色体40（マウス細胞を用いた場合）（ 図1A）を含む別個のクラスタを形成すべきである。各染色体は、水色の球として表示されている、一方の端部に動原体を持っています。正常な染色体では、2つのテロメア信号は、各セントロメアによって染色し、二つの信号の最後に見られる。間期核は同様に、スライド上に存在することになる。これらは、赤テロメア信号と青の球、、ない凝縮された染色体（例えば、 図1Bを参照のこと）として表示されます。間期核のゲノム不安定性を定量化する目的のために無視することができる。
染色体異常の異なる種類の数を観察することができる。染色分体ブレークは、各中期染色体を構成する2つの姉妹染色分のいずれかで休憩です。研究者は、一方の端Oから単一のテロメア信号の一染色分の不連続、または損失を見れば彼らは得点することができますFA染色体（ 図1（b）の例を参照）。染色体切断は、染色体（ 図1Cの例）の一端からテロメアシグナルの損失を探すことによって同定される。いくつかのケースでは、染色体の切断端は、（ 図1Cの場合のように）同じ中期スプレッドにおけるテロメア信号とフラグメントとして観察することができる。他の場合には、染色体末端が存在しなくてもよい。
染色体再配列のいくつかのタイプを観察することができる。ラジアル染色体が2つの染色体が関与する複雑な再配列によって特徴付けられるフォームの数を取ること（3つの例は、 図1Dの赤い矢印で示されている）。ラジアル染色体は、3つ以上の染色体を含む、より複雑な再配列が含まれる。染色体はまた、 図1D中の白矢印で示される両末端に動原体を有する染色体のエンドツーエンドの融合（<ように見える二動原体染色体を、形成してなる ことがある/強い>）。ロバートソン転座（ 図1Eに見られる）は、単一の動原体に付着し4姉妹染色分体アームとして表示される2つの染色体の動原体間の転座の一種である。
図1Fは、テロメア信号が存在していません中期を示しています。テロメアシグナルの欠如は、ハイブリダイゼーションの間にカバーガラスにおけるプローブ準備や気泡中のエラーから発生することがあります。
マウスB細胞における、図1染色体異常は、PNAテロメアFISHにより可視化。 A）中期における正常マウスB細胞の染色体構造。 40染色体は、細胞が2分体切断（緑の矢印）。C）を表示するいずれかの端。B）二つのテロメア信号と、表示されている。D）セル3ラジアル染色体（赤矢印）と1二動原体染色体（白い矢印）を表示。E）分裂中期スプレッド（黄色の矢印）。F）テロメア信号なしで染色体を示す失敗したハイブリダイゼーションの例。スケールバーは、各画像が10μmを表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
一方、活性化Bリンパ球は、他の細胞型も使用することができ、有糸分裂染色体スプレッドの調製に特に適している。 Tリンパ球は脾臓またはリンパ節から精製することができるように、B細胞の利点の多くを共有し、そして適切なマイトジェン8を含む培地中での増殖によって刺激された場合、高い有糸分裂指数を有する。胚性幹細胞（ES細胞）は、中期染色体分析9に適している。これらが入手できない場合コルセミド、より長い治療（ 例えば 、10ngの/ mlの最終濃度でのコルセミドで16時間）を固定する前中期でトラップする複数のセルを推奨しているが、線維芽細胞を用いることができる。
中期の調製の整合性が大幅にそのようなサーモCDS-5細胞遺伝乾燥チャンバーなどの制御された湿度チャンバ内に固定された染色体をドロップすることによって促進されるスプレッドが、それはWH良好な結果を得ることが可能であることを私たちは発見ラボ環境の湿度や温度に応じて、ベンチで働くILE。信頼性の高い結果を得るためには、サンプル当たり少なくとも100中期から染色体異常をスコアリングすることをお勧めします。手動で各チャネル内の各中期を画像化する工程が面倒であることができるように、私たちは迅速かつ正確に見つける中期染色体の大多数をスキャンすることができメタシステムMetafer4自動顕微鏡システムを用いて分裂中期を取得する。
テロメアプローブで標識された中期染色体の分析は、染色体と染色分休憩を測定するための理想的であり、テロメアシグナルはまた、融合および放射状の構造などの複雑な染色体再配列の識別を支援する。ギムザ溶液で固定中期染色体の染色はまた、染色体異常を定量化するのに適しており、蛍光顕微鏡10を必要としないという利点を提供しています。 pantelomeric PNAプローブとテロメアのラベリング鳴ったを拡張DNAPKcs-11ノックアウトマウス由来の細胞は、例えば、生じるテロメア融合の同定を可能にすることによって、定量することができる染色体異常の電子。 PNA-FISHはまた、染色体のテロメアの複製および染色テロメア損失12,13を含むテロメア異常の周波数を測定するために使用することができる。テロメア信号の損失は、テロメアの短縮によって、ならびに染色体切断によって引き起こされ得る。 PNA-FISH敏感Q-FISH（定量的FISH）14を使用して、テロメア長を測定するために使用することができる。
異なるDNA修復活性を欠く細胞は、染色体異常の異なるタイプを蓄積する傾向がある。例えば、DNA損傷応答因子53BP1の欠乏は、第15染色体を破壊の蓄積をもたらす。対照的に、複雑な放射状の染色体構造の割合が高いBRCA1 4を欠く細胞で観察される。これらの染色体再配列は、その正確な構造に変化させて、常に二つ以上の染色体からの材料の融合を含む。例は、DNA切断を引き起こす薬剤の高用量で処理した後に発生に関しては、細胞が、ゲノムの不安定性の非常に高いレベルを有する場合、それは実験のダイナミックレンジに制限を置く個別の染色体異常をスコアすることがますます困難になる。
中期スプレッドにおける染色体切断と再配列の定量化は、特定の遺伝子がDNA修復に関与しているかどうかをテストする場合に便利です。この目的のために、中期染色体分析を使用する一つの潜在的問題は、DNA修復活性を欠く細胞は正常に成長しない可能性があることである。修復欠損細胞が分裂中期に到達していない場合は、DNA修復を媒介する遺伝子の重要性を過小評価してもよい。 - / - p53の- / -二重ノックアウト細胞MAを示したとえば、RNF8 - / - RNF8が、一方、p53依存性の老化を受ける細胞は、染色体不安定性の適度なレベルを表示nyともっと染色体異常、p53の欠失がより良い細胞増殖16を可能にするからである。それは、そのノックアウト細胞集団は正常に成長し、有糸分裂細胞の意味の割合で含有することができる表示するために、細胞周期のアッセイを用いて染色体不安定性の測定値を対にすることが重要である。
ゲノム不安定性の観察は、特定の遺伝子が提供する修復活性の正確な機能への洞察を与えるそれ自体ではありませんが、単により多くの機構的な研究のための出発点として機能します。このアプローチは染色体切断や複雑な再構成を測定するのに有用であるが、最終的に、mFISHまたはSKYの使用は、染色体転座を定量化することをお勧めします。これらの技術はまた、中期染色体スプレッドで始まりますが、フルオロフォアの特定の組み合わせで「ペイント」というそれぞれの染色体をプローブのカクテルを使用しています。これらの技術のいずれかが染色体の完全なスペクトルを測定することをお勧めしますinstab修復欠損細胞ではility。
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Disclosures
著者らは、競合する利害を有していない。
Acknowledgments
この作品は、NIHの助成金R00 CA160574（SFB）でと（SMM）はラトガースバイオテクノロジートレーニングプログラムの交わりによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
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