Summary
DNA-reparasjonsbaner er avgjørende for opprettholdelse av genomisk integritet og hindre mutasjon og kreft. Målet med denne protokollen er å kvantifisere genomisk ustabilitet ved direkte observasjon av kromosomavvik i metafase sprer seg fra mus B-celler ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering (FISH) for telomeric DNA gjentar.
Abstract
Defekt DNA-reparasjon fører til økt genomisk ustabilitet, som er roten årsaken til mutasjoner som fører til tumorigenesis. Analyse av frekvensen og typen av kromosomale aberrasjoner i forskjellige celletyper gjør det mulig defekter i DNA-reparasjonsbaner som skal belyses. Forståelse pattedyr DNA-reparasjon biologi har vært sterkt hjulpet av produksjonen av mus med knockouts i bestemte gener. Målet med denne protokollen er å kvantifisere genomisk ustabilitet i mus B-lymfocytter. Merking av telomerer bruker PNA-FISH prober (peptid nukleinsyre - fluorescerende in situ hybridisering) forenkler rask analyse av genomisk ustabilitet i metafase kromosommarginer. B-celler har bestemte fordeler i forhold til fibroblaster, fordi de har normalt ploiditet og en høyere mitotiske indeksen. Kortsiktig kultur av B-celler gjør derfor nøyaktig måling av genomisk ustabilitet i en primær cellepopulasjon som er sannsynlig å ha færre sekundære genetisk mutasjons enn det som typisk finnes i transformerte fibroblaster eller pasientcellelinjer.
Introduction
Kreft er forårsaket av akkumulering av mutasjoner som påvirker gener som regulerer normal cellevekst. Mutasjon er en konsekvens av endringer i strukturen og sekvensen av genomet forårsaket av skade på DNA. DNA-skade kan forekomme gjennom en rekke prosess, inkludert eksogene midler slik som ioniserende stråling, og som et biprodukt av normal cellulær metabolisme, slik som spontan deaminering av nukleotid-basene eller skader som oppstår ved kontakt med reaktive oksygenforbindelser en.
Selv om pattedyrceller har en rekke reparasjonsvirksomhet som kan reversere DNA skade eller gjenopprette sekvensen ved bruddsteder, mutasjoner likevel akkumuleres i løpet av levetiden til en celle. DNA-skade kan videre bidra til å senescens og tap av potens av stamceller, to prosesser som er forbundet med aldring-assosiert sykdom 2. Forstå reparasjon av DNA-skader er derfor av sentral betydning i møte to significant problemstillinger i folkehelsen. Økende bevis tyder på at pattedyr DNA-reparasjonsbaner kan bidra til utviklingen av kreftcellen genomet 3,4, noe som gjør det enda mer viktig å forstå prosessene som er involvert i å undertrykke mutasjon på molekylært nivå.
Direkte synliggjøring av kromosomale aberrasjoner er en kraftig og kvantitative middel for å bestemme omfanget av genomisk instabilitet i en bestemt celletype. Kondenserte kromosomer fra celler i metafase kan isoleres og inspiseres ved hjelp av lys eller fluoriserende mikroskopi. Slike cytogenetisk tilnærminger har vært praktisert i flere tiår, og kan brukes til å påvise forekomsten av translokasjoner eller bestemte typer av kromosomforstyrrelser assosiert med tap av DNA-reparasjonsvirksomhet. Protokollen gir seg til flere potensielle utvidelser: kromosomer kan merkes med prober for spektral karyotyping (SKY) eller flerfarget fluorescerende in situ hybridisering(MFISH) for å identifisere trans 5,6. Disse teknikkene også aktivere hyppigheten av kromosomtranslokasjoner og strukturen i komplekse kromosomtranslokasjoner som skal bestemmes, noe som gir ytterligere informasjon utover det som er mulig med denne protokollen. Alternativt, kan sekvensspesifikke prober bli generert og anvendt for å teste forekomsten av DNA-brudd ved utvalgte genomiske områder 7.
I denne protokollen beskriver vi utarbeidelse av meta kromosom sprer seg fra B-lymfocytter. En fluorescensmerket-merkede peptid-nukleinsyre (PNA) probe for telomeric gjentakelser er brukt, noe som effektivt markerer telomerer i metafase-kromosomer sprer Denne protokollen har flere fordeler. B-celler kan induseres til å vokse på høy mitotisk indeks, slik at høy-kvalitets sprer konsekvent kan bli produsert. B-celler fra genmodifiserte mus er også mye mindre sannsynlighet for å inneholde sekundære genetiske mutasjoner som kan skamme analysen av bidragetav spesifikke gener til genomisk integritet. PNA-FISH tilnærming kan gjennomføres på en dag, og tillater mer nøyaktig scoring av kromosom pauser. Ved å bruke denne metoden, spesielt i kombinasjon med spesielle utstyr som er beskrevet i denne protokollen, er det mulig å fremstille meget jevn og høy kvalitet og sprer seg raskt å analysere frekvensen og typen av genomisk instabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne prosedyren ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Rutgers, State University of New Jersey. Mus ble behandlet i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Forskere bør konsultere sine nasjonale og institusjonelle dyrevernorganisasjoner for etablerte og vedtatte retningslinjer.
Før du begynner, forberede de løsningene som er oppført i tabell 1.
1. B celleisolasjon og aktivering
Avlive en mus ved hjelp av CO 2 etterfulgt ved halshugging. Sett musen slik at venstre side av kroppen er opp og spray mus med 70% etanol før pelsen er fuktig. Dissekere milt og plasser i en 35 mm vev kultur tallerken med 2 ml vaskebuffer. I en laminær strømningshette, forsiktig bryte opp milten i vevskultur fatet ved hjelp av den flate ende av en 5 ml sprøyte.
- Sett inn en 70 mikrometer nylon mesh til en 50ml rør og overføre milten prøven i 2 ml vaskebuffer i nylonmesh. Forsiktig forstyrre milten i nettingen ved hjelp av den flate enden av sprøyten.
- Skyll baksiden av sprøyte og 35 mm plate med 8 ml vaskebuffer, og filtrerer gjennom 70 mikrometer nylonmesh. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Aspirer og kast supernatant og resuspender pelleten i 3 ml ACK lysis buffer. Pipettere opp og ned en kort stund for å forstyrre klumper og inkuberes i 5 min. Tilsett 10 ml vaskebuffer, og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Aspirer og kast supernatant og resuspender pelleten ved å trykke på bunnen av røret og deretter ved pipettering i 1 ml vaskebuffer. Tilsett 50 ul av anti-CD43 MACS mikro-perler, og inkuber på is i 30 min. Tilsett 10 ml vaskebuffer, bland forsiktig og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Tilsett 10 ml vaskebuffer, bland forsiktig og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Sett opp enMini-MACS kolonne ved å plassere en kolonne på MACS magnet. Posisjonering av et merket 15 ml konisk rør under kolonnen. Tilsett 1 ml vaskebuffer til kolonnen og la den gå gjennom til 15 ml røret.
- Aspirer supernatanten og resuspender i 1 ml vaskebuffer. Load prøven i kolonnen etter at vaskebuffer har rent gjennom.
- Etter at prøven har gått gjennom kolonnen, tilsett 1 ml vaskebuffer for å vaske kolonnen. Legg 7 ml vaskebuffer direkte til den oppsamlede prøven i 15 ml tube.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer. Overfør det nødvendige volum av celler som trengs til 5.000.000 celler / brønn i en 50 ml rør. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Supplement B-celle-medium med LPS 1: 500 og IL4 1: 1000.
- Aspirer supernatanten og legge det passende volumet av B-celle-medium supplert som er nødvendig for sluttkonsentrasjon på 1.000.000 celler / ml.
- Plate celler i 6-brønners plater med 5 ml av cellene ved million celler / ml, og plasser i en humidified cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
2. B Cell Fixation
- Tilsett 50 pl av colcemid til brønnen inneholdende 5 ml av B-celler (for en endelig konsentrasjon på 100 ng / ml) og inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Prewarm 75 mM KCl-løsning i et 37 ° C vannbad. Overføring av B-celler til en merket 15 ml rør. Dekk etiketten med tape og sentrifugert ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Aspirer supernatanten forlater 1 ml i røret og resuspender pelleten ved pipettering. Tilsett 5 ml av prewarmed KCl dråpe for dråpe mens peke eller pulserende på en vortex.
- Tilsett 10 ml KCl og bland ved å snu. Inkuber i et 37 ° C vannbad i 15 min. Tilsett 5 dråper frisk fiksativ og Bland ved å snu. Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten forlater 1 ml i røret og resuspender pelleten ved å pipettere opp og ned.
- Tilsett 5 ml av fersk fiksativ dråpe for dråpe mens peke eller pulserende på en vortex. Legg ytterligere 10 ml fiksativ og inkuberes i 30 min ved romtemperatur.
- Sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Aspirer supernatanten forlate en ml i tube og resuspender ved pipettering. Legg 14 ml friskt fiksativ og sentrifuger ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Gjenta trinn 2.7 ganger mer.
- Legg 14 ml frisk fiksativ. Forsegle caps med Parafilm og lagre over natten ved -20 ° C.
3. Utarbeidelse av metaKromosom Spreads
- Still et regulert miljø-kammer til 22,9 ° C og 52% luftfuktighet.
- Sentrifuger den faste B-celler ved 300 xg i 10 min ved 4 ° C. Aspirer bindemiddel forlater 70 mikroliter i røret og resuspender ved pipettering.
- Legg merket lysbildene i fuktighetskammeret med en 35 ° vinkel. Drop 35 mL av resuspendert B-celler på et lysbilde og slippe to lysbilder per prøve. Tillat lysbildene tørke i fuktigheten kammeret i 30 min deretter lagre lysbildenei en lysbilde boksen ved 37 ° C.
4. telomere PNA FISH
- Fremstilling av probe
- Pre-varm deionisert formamid til 37 ° C. Bland 2 pl av telomere PNA probe med 7 mL deionisert forvarmet formamid og inkuberes ved 37 ° C med risting i 1 time.
- Forvarm FISH mester mix til 37 ° C. Legg 7 ul forvarmes FISH konsentrat-blanding til blandingen fra trinn 4.1.1 og inkuberes ved 37 ° C i 1-3 timer.
- Denaturere sonden blandingen i 8 min ved 80 ° C. Pre-anneal sonden i 1 time ved 37 ° C.
- Forbehandling av kromosom Slides
- Pre-oppvarmes en glass-slide-farging krukke inneholdende 50 ml av 0,01 M HCl til 37 ° C i et vannbad.
- Plasser lysbilder i et annet glass slide-flekker krukke som inneholder 2x SSC i 5 min ved romtemperatur.
- Tilsett 2 mL av pepsin lager til forvarmet glass slide-flekker krukke og bland ved å snu. Overfør lysbilder til dette glasset slide-flekker krukke og inkuber 90 sek ved 37 ° C.
- Vask objektglassene 2x i en annen glass-slide-farging krukke inneholdende 1 x PBS i 5 minutter hver ved romtemperatur, risting. Deretter vaskes lysbildene i 5 min i 1x PBS / MgCl2 ved romtemperatur, risting.
- Overfør lysbildene på en glass-slide-farging krukke innehold nylaget 1% formaldehyd / 1 x PBS / MgCl 2 i 10 min ved romtemperatur.
- Vask objektglassene i 5 min i en annen glass-slide-farging krukke inneholdende 1 x PBS i romtemperatur, risting.
- Forbered en etanol dehydrering serien ved å ha eget glass slide-Fargetrau inneholder minst 70%, 90% og 100% etanol.
- Overfør lysbildene på hvert glass i 3 min, og starter med 70% etanol, deretter 90% etanol, og deretter 100% etanol. Plasser etanol krukker ved -20 ° C når fullført.
- Tillat lysbildene lufttørke ved å tappe overflødig etanol på et papirhåndkle og propping lysbilder på en 35 ° vinkel. Når tørr, mark et 18 x 18 mm-området for hybridisering på baksiden av skinnene ved hjelp av en diamant penn.
- Denaturering av Slides for FISH
- Påfør 120 mL 70% avionisert formamide / 2X SSC til en 24 x 60 mm dekkglass. Trykk på lysbildet til dekkglass. Denaturere lysbildet ved 80 ° C på en varm plate til 90 sek.
- Raskt og forsiktig gli av dekkglass og plasser lysbilde i iskald 70% etanol i 3 minutter, etterfulgt av 90% etanol og 100% etanol, hver i 3 min. Tillat lysbildene lufttørke.
- Forbered en fuktig kammer ved å stille en plastboks med tett lokk og vått silkepapir. Papiret skal være fuktig, men ikke mettet med vann.
- I et fuktighetskammer, bruke pre-glødet probe mix fra trinn 4.1.3 til det markerte området på lysbildet, dekk med en 18 x 18 mm dekkglass og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Post-ruge Vasker
- Forvarm 50% formamide / 2x SSC, 1x SSC, og 4x SSC / 0,1% Tween-20 i en 45 °, C vannbad.
- Fjern forsiktig Dekkglass og vaske lysbildene i forvarmet 50% formamide / 2x SSC 3xfor 5 min hver i mørket og risting. Vask lysbildene i forvarmet 1x SSC 3xfor 5 min hver, risting. Til slutt, vaske lysbildene i forvarmet 4x SSC / 0,1% Tween-20 3xfor 5 min hver.
- Flekk lysbildene for 3 min i DAPI i en lys beskyttet glass slide-flekker jar.
- Vask lysbildene i 5 min i 2x SSC, risting. Påfør 35 mL av Mowiol montering medium, dekk med 24 x 60 mm dekkglass og lagre lysbildene ved 4 ° C.
5. mikroskopisk analyse av kromosomer
- Analyser metafase lysbilder ved hjelp av en standard epi-fluorescens mikroskop. Bruk en avbildning plattform med en automatisert trinn slik som MetaSystems Metafer plattformen for å oppnå de beste resultater. For hver metafase-spredning, samle ett bilde for DAPI fluorescens for å visualisere kromosomer, og ett bilde for det fluorescerende signalet fra telomere pkappe. (F.eks Cy3- andre Fluors er tilgjengelig og fungerer like godt.)
- Overlappe bildene med en bildeanalyseprogram og analysere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metafasekromosomer avledet fra en celle bør danne en diskret klynge inneholdende 40 kromosomer (ved bruk av museceller) (figur 1A). Hver kromosom har en cent i den ene enden, som er synlig som en lys blå kule. I normale kromosomer, er to telomere signaler sett på slutten av kromatider og to signaler ved hver cent. Fase kjerner vil være til stede på lysbildet også. Disse vil være synlig som blå kuler, med røde telomere signaler, men ingen kondenserte kromosomer (se for eksempel figur 1B). Er mellom kjerner kan ignoreres i forbindelse med kvantifisering genomisk ustabilitet.
En rekke ulike typer kromosomavvik kan observeres. Kromatid pauser er brudd i en av de to søsterkromatider som utgjør hvert metafase kromosom. De kan mottok hvis undersøkeren ser en diskontinuitet i en kromatid, eller tap av en enkelt telomere signal fra den ene ende ofa kromosom (se eksempler i figur 1B). Kromosom pauser blir identifisert ved å se etter tap av telomere signaler fra den ene ende av en kromosom (eksempelet i figur 1C). I noen tilfeller, kan den brutte ende av kromosom observeres som et fragment med telomere signaler i samme metafase spredning (som tilfellet er i figur 1C). I andre tilfeller kan det kromosom ende ikke være til stede.
Flere typer kromosom rearrangementer kan observeres. Radial kromosomer ta en rekke former, preget av komplekse rearrangementer involverer to kromosomer (tre eksempler er vist med røde piler i figur 1D). Radial kromosomer inkluderer også mer komplekse rearrangementer, som involverer tre eller flere kromosomer. Kromosomer kan også bli sluttet å danne disentrisk kromosomer, som vises som en ende-til-ende-fusjon av kromosomer med sentromerer i begge ender (vist med en hvit pil i figur 1D </ Strong>). Robertsonske trans er en type translokasjon mellom sentromerer av to kromosomer, som vises som fire søsterkromatidutveksling armer festet til en enkelt cent (sett i figur 1E).
Figur 1F viser en metafase som ikke har telomere signalene tilstede. Fravær av telomere signaler kan forekomme feil i sonde forberedelse eller luftbobler i dekkglass under hybridiseringen.
Figur 1. kromosomavvik i mus B-celler som visualiseres ved PNA telomerer FISH. A) Den kromosomstruktur av en normal mus B-celle ved metafase. 40 kromosomer er synlige, med to telomere signaler i begge ender. B) En celle viser to kromatid pauser (grønne piler). C) D) En celle viser 3 radiale kromosomer (røde piler) og ett disentrisk kromosom (hvit pil). E) En meta spres med ett kromosom med en Robertsonske translokasjon (gul pil ). F) Et eksempel på en mislykket hybridisering, som viser kromosomer uten telomere signaler. Målestokk representerer 10 mikrometer i hvert bilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens aktiverte B-lymfocytter er spesielt egnet til fremstilling av mitotiske kromosom sprer seg, kan andre celletyper kan også brukes. T-lymfocytter har mange av fordelene til B-celler, som de kan bli renset fra milt eller lymfeknuter, og har en høy mitotisk indeks ved stimulering av vekst i medium inneholdende egnede mitogener 8. Embryonale stamceller (ES-celler) er også egnet for metakromosomanalyse 9. Dersom disse ikke er tilgjengelige, kan fibroblastceller brukes, selv om en lengre behandling med colcemid (f.eks, i 16 timer med colcemid ved en endelig konsentrasjon på 10 ng / ml), er det anbefalt å felle flere celler i metafase før fiksering.
Vi finner at konsistensen for fremstilling av metafasemarginer, gjøres meget lettere ved å slippe de faste kromosomer i en kontrollert fuktighetskammeret slik som Thermo CDS-5 cytogenetisk tørkekammeret, men det er mulig å oppnå gode resultater while arbeider på en benk avhengig av luftfuktigheten og temperaturen til laboratoriemiljøet. For å oppnå pålitelige resultater, er det tilrådelig å score kromosomavvik fra minst 100 metafaser per prøve. Ettersom prosessen for manuelt å avbilde hver metafase i hver kanal kan være arbeidskrevende, vi skaffe metafaser ved hjelp av en Metasystems Metafer4 automatisert mikros system som raskt og nøyaktig kan finne skanne et stort antall metafase-kromosomer.
Analyse av metafase kromosomer merket med telomere prober er ideell for å måle kromosom og kromatid pauser, og telomere signaler også hjelpe identifisering av komplekse kromosom rearrangementer som fusjoner og radial strukturer. Farging av faste metafase kromosomer med Giemsa løsning er også egnet for å kvantifisere kromosomavvik, og har fordelen av å ikke krever fluorescerende mikros 10. Merking telomerer med en pantelomeric PNA sonde utvider range av kromosomale aberrasjoner som kan kvantifiseres ved å tillate identifisering av telomere fusjoner, som oppstår, for eksempel i celler fra DNAPKcs-11 knockout mus. PNA-fisk kan også brukes til å måle frekvensen av telomere avvik, inkludert kromosom telomere duplikasjoner og kromatid telomere tap 12,13. Tap av telomere signal kan være forårsaket av telomerer forkortes så vel som av kromosombrudd. PNA-FISH kan brukes til å måle følsomt telomerlengde ved hjelp av Q-FISH (kvantitativt FISH) 14.
Celler mangler ulike DNA reparasjonsvirksomhet har en tendens til å hope seg opp ulike typer kromosomavvik. For eksempel mangel på DNA-skade responsfaktor 53BP1, fører til akkumulering av kromosom bryter 15.. I motsetning til dette, er en høy andel av komplekse radial kromosom strukturer observert i celler som mangler BRCA1 4. Disse kromosom rearrangementer er varierte i deres nøyaktige struktur,men alltid innebære blanding av materiale fra to eller flere kromosomer. Når cellene har svært høye nivåer av genomisk ustabilitet, som for eksempel oppstår etter behandling med høye doser av stoffer som forårsaker DNA pauser, blir det stadig vanskeligere å score individuelle kromosomavvik, noe som setter en grense på det dynamiske spekteret av forsøket.
Kvantifisering av kromosom pauser og rearrangements i metafase spreads er nyttig for å teste om spesifikke gener har en rolle i DNA-reparasjon. Et potensielt problem i å bruke metakromosomanalyse for dette formålet er at celler som mangler DNA reparasjonsvirksomhet ikke kan vokse normalt. Hvis reparasjons-mangel celler ikke når meta, kan betydningen av et gen for formidling av DNA-reparasjon undervurderes. For eksempel RNF8 - / - celler, som er gjenstand for p53-avhengige senescence, viser en beskjeden grad av kromosom ustabilitet, mens RNF8 - / - p53 - / - dobbel-knockout celler viser maNY mer kromosomavvik, fordi sletting av p53 gir bedre cellevekst 16. Det er derfor viktig å sammenkoble målinger av kromosom ustabilitet med en cellecyklus-analysen, for å vise at knockout cellepopulasjoner kan vokse normalt, og inneholder en meningsfull andel av mitotiske celler.
Observasjonen av genomisk instabilitet ikke i seg selv gi innsikt i den nøyaktige funksjon av en reparasjonsaktivitet gitt av et bestemt gen, men kun fungerer som et startpunkt for flere mekanistiske undersøkelser. Til slutt, selv om denne tilnærmingen er nyttig for måling av kromosombrudd og kompliserte rearrangementer, er bruken av mFISH eller SKY anbefales for å kvantifisere kromosomtranslokasjoner. Disse teknikkene også begynne med metakromosom sprer seg, men bruke en cocktail av sonder som "maling" hver kromosom med en bestemt kombinasjon av fluorophores. Hver av disse teknikkene er anbefalt for måling av hele spekteret av kromosom instability reparasjonsfattige celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av NIH stipend R00 CA160574 (SFB) og av et fellesskap av Rutgers Bioteknologi Training Program (til SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5 g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100 mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5 μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, Curr Protoc Hum Genet. (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, Curr Protoc Cell Biol. (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
