Abstract
Renal iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) hastalarda ve böbrek kan akımının tıkanması akut böbrek hasarı (ABH) ortak bir nedenidir böbrek nakli sırasında kaçınılmazdır. , Doğru ve tekrarlanabilir renal IRI özetlemek deneysel modeller AKI patofizyolojisi ve yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi diseksiyon çok önemlidir. Tekrarlanabilir AKI sonuçlanan böbrek IRI bir fare modeli burada sundu. Bu bir kesi kontrol dokusu ve sol böbrek iskemi ikna etmek için sol renal pedikül kenetlenmesini sağlayan bir sağ nefrektomi hem izin ile ameliyat için bir orta hat laparotomi yaklaşımı ile elde edilir. Iskemi döneminde kelepçe pozisyonu ve vücut sıcaklığının dikkatli izleyerek bu modeli tekrarlanabilir işlevsel ve yapısal hasarı ulaşır. Fareler, serum veya plazma kreatinin seviyesinin yüksekliği hem de böbrek fonksiyon kaybı gösteren ameliyattan sonra 24 saat kurban yapılarbelirgin akut tübüler nekroz ile sal böbrek hasarı. Böbrek fonksiyonu artırır ve akut doku hasarı bu model böbrek rejenerasyon çalışması için kullanılabilir şekilde böbrek IRI izleyen 7 gün süresince giderir. Renal IRI Bu model, moleküler ve hücresel AKI patofizyolojisi hem de daha sonraki böbrek rejenerasyon analiz incelemek için kullanılmıştır.
Introduction
Iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) böbrek, kalp ve beyin dahil olmak üzere birden organları için yaralanma yaygın biçimidir. Böbrek IRI hastalarda akut böbrek hasarı (ABH) yol açabilir ve hiçbir spesifik tedavi mevcuttur. IRI sonucu AKI doğal ve adaptif immün yanıtı 1 hem de içeren karmaşık bir patogenezi. Böbrek IRI bir deneysel model anahtar hücreleri ve AKI patogenezinde hem de sonraki günlerde gelişir sonraki böbrek rejenerasyon yer arabulucular incelemek için potansiyel sunmaktadır. Bundan başka hastalık süreçleri üzerine yeni terapötik maddelerin etkisi değerlendirilebilir.
Böbrek IRI deneysel modelinin genel amacı burada tarif hem akut fonksiyonel ve yapısal böbrek hasara yol etmektir. Bazı araştırmacılar bilateral IRI 2'nin uyarılmasını içeren bir modeli kullanmışlardır. Bilateral renal IRI modeli, kullanım tek taraflı ren olmasına rağmenal IRI modeli cerrahi anda yapılmakta olan bir sağ nefrektomi avantajına sahiptir. Sağ nefrektomi doku ya da yol açma ya da bir gen ya da proteinin ekspresyonunu bastıran bir ön-muamele aşamasını içeren çalışmalarda olduğu gibi değerli kontrol doku vermektedir. Örneğin, biz 24 saat böbrek IRI 3 önce heme arjinatın önşartlama etkilerini (HA) enjeksiyonu değerlendirmek için bu modeli kullandık. IRI önce HA ile sitokoruyucu enzim heme oksijenaz-1-(HO-1) başarılı bir şekilde indüksiyon doğru nefrektomi kontrol dokusu 4 doğrulanmıştır. HA bir HO-1 bağımlı mekanizma yoluyla kısmen yaşlı farelerde böbrek IRI azalttı. Benzer şekilde, böbrek IRI 5 makrofajların rolünü incelemek için makrofaj tükenmesi çalışmalarda modelini kullandık. Sağ nefrektomi dokusunun immünohistokimyasal analizi, ablasyon metodoloji etkinliğini teyit etmek için kullanılabilir. Sağ nefrektomi doku hem de bu nedenle onaylamak için kullanılan ve seviyesini ölçmek edilebilirnduction ya da her bir deneysel hayvan içinde, ilgi konusu moleküle inhibisyonu. Bu model önce renal IRI indüklenmesine genlerin veya proteinlerin vs ekspresyonunu modüle etmek için ilaçlar veya diğer bileşikler kullanan araştırmacılar, ilgi çekici olacaktır.
Diğer çalışmalar böbrekleri erişmek için yan kesiler kullandık. Burada açıklanan model sağ nefrektomi hem gerçekleştirmek ve sol böbrek iskemi reperfüzyon ikna etmek için tek bir orta hat karın ameliyatı kullanır. Bu cerrahi yaklaşım böbrek pedikül sıkılmasına takip böbrek pediküller ve renk değişiklikleri de dahil olmak üzere, cerrahi alanında mükemmel görselleştirme sağlar. Modeli 4-6 ile yayınlanan deneyim fareler hızlı bir şekilde neredeyse% 100 hayatta kalma oranı ile cerrahi kurtarmak olduğunu gösterir.
Son olarak, 7 günlük bir süre boyunca, modelin kinetik analizi, bu model, renal fonksiyon ve boru bütünlüğü hem de geri yükleme sergiler gösterir, ileönemli ölçüde boru şeklinde bir hücre çoğalması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT:. Hayvan deneyleri Hayvanlar (Scientific Procedures) Act 1986 dayattığı kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı Prosedürleri steril (otoklav) cerrahi aletler ve sarf malzemeleri kullanılarak yapılmıştır. Uygun yaş olmak üzere, 15 hafta - renal IRI murin modeli Burada yer iken, bir 8-haftalık, erkek yeniden üretilebilir, tipik olarak 7 arasında değişen bir cinsiyet ya murin soylarının çeşitli gerçekleştirilebilir Balb / c fare üzerinde gerçekleştirilmiştir 8 hafta. Temsilcisi sonuç bölümünde sunulan veriler, Balb / c ve FVB farelerinin hem de elde edilmiştir. Isıtılmış salin uygulaması nemli bağırsak ve cerrahi alanda tutmak için kullanılır ama dikkatle izlenir ve sıvıların aşırı uygulama olarak, bir minimumda tutulması gereken önemli olan serum veya plazma kreatinin, düşürücü bir suni yol açabilir deneysel okuma.
1.. Hayvan Hazırlama ve Laparotomi
<ol>2.. Üreter Bölümü ve Sağ nefrektomi
- Yavaşça sağ böbrek ve üreter maruz serum ile nemlendirilmiş otoklava sterilize pamuklu çubuklarla karın boşluğunun sol tarafına doğru bağırsakları itin. Kurumayı önlemek için nemli örtüler ile bağırsakları örtün.
- Açılı forseps ile sağ üreter kaldırın. Iki kez, 6/0 sil kullanarak sağ üreter ligatek-örgülü sütür. Uzun süreli deneyler için, tüm abdominal ameliyatlar için emilebilir dikişlerle kullanın.
- Sütür arasındaki üreter bölün. Vezikoüretral kavşak mesane periton içine sızmasını idrar önlemek gerekir iken üreter uzun süreli deneyler sırasında ameliyat sonrası herhangi bir sızıntıya karşı bir koruma olarak bağlandı.
- Sağ nefrektomi yapılırken kolay erişim sağlamak için, hafifçe nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanarak karaciğer yukarı ve sağa doğru itin ve sağ renal arter ve ven maruz nemlendirilmiş gazlı bez kullanılarak yerinde tutun.
- Açık açık kadarıyla sağ renal arter ve ven olarak sağ böbreğin medial boyunca bağ dokusu ve yağ teşrih.
- Dikkatli kan damarlarının altında açılı forseps kaydırarak renal arter ve ven altında bir kanal oluşturun. Uçları kapalı ve yavaşça kanalın oluşumunu kolaylaştırmak amacıyla, açık uçları ile çıkarın ile alt kılavuz forseps.
- Forseps ipuçları sadece renal arter ve ven yukarıda bağ dokuları yoluyla görünene kadar adımı 2.6 tekrarlayın. Bir kez görünür hafifçe aşağı bağ dokusu kırmak için açılı forseps başka bir dizi ipuçları karşı forseps ipuçları ovalayın.
- Renal arter ve ven açıkça erişilebilir ile onlar artık tıkalı olabilir. Dikkatle renal arter altına açılı forseps slayt ve ipuçları kapalı damar. Bir kez yerinde forseps ipuçları açın ve uçları arasındaki hemostatik klip aplikatör rehberlik ve sıkıca renal arter üzerine hemostatik klip uygulamak ve yakın böbrek ven. Alternatif olarak, renal arter ve ven 6/0 örgülü ipek sütür kullanılarak bağlanabilir.
- Şimdi kalan yapışık bağ dokusu ile kaldırılabilir tıkalı renal arter ve böbrek yakın ven, bölün.
- Karaciğer tutun ve pamuklu bağırsakları değiştirmek için kullanılan herhangi bir gazlı bez çıkarın.
- Yavaşça sol böbrek ve üreter maruz ve nemli örtüler ile karşılamak için pamuklu karın boşluğunun sağ tarafına doğru bağırsakları itin. Gerekirse, pankreas daha kolay erişim sağlamak için nemli bir gazlı bez ile saptırılır edilebilir.
- Yavaşça bağ dokuları sol renal arter ve ven anterior ve posterior kırmak için künt diseksiyon kullanın, ve sonra 2.4 Üreter Bölümü ve Sağ Nefrektominin adım tarif edilene benzer bir şekilde gemilerin altında bir kanal oluşturmak.
- Renal arter ve ven üzerine bir mikro serrafine klip uygulayarak sol böbrek iskemi Induce. Başarılı iskemi görsel olarak böbrek kademeli bir muntazam koyulaşması ile teyit edilebilir. Sol renal arter ve ven ek olarak kan damarları bazen böbrek kaynağı olabilir. Eğer varsa, bu ek kan damarları da başarıyla amacıyla mikro serrafine klipleri kullanılarak tıkalı gerekirtüm böbrek iskemi neden olur.
- Bağırsak değiştirin ve dikkatle bağırsak iskemi ödün sonuçlara yol açabilir ani bükülme olmadığından emin olmak. Geçici olarak tek sütür ile periton kapatın.
- Iskemi indüksiyon sonrasında hemen iskemisi gereken süre boyunca 37 ° C 'de, vücut ısısını muhafaza edecek bir kontrol birimine bağlı bir rektal direnç ile bir eşit sıcaklık battaniyesi üzerine fare. Böbrek hasarı ve böbrek yetmezliğinin istenen derecede uyarılması için gerekli iskemisi uygun uzunluğu tanımlamak için bir titrasyon, her bir suş ve cerrahi operatör için yapılması önerilir.
- Kısa bir süre iskemik sürenin bitiminden önce periton yeniden açın ve dikkatle kelepçe erişim izin ve böbrek görüntülemek için bağırsakları yerleştirin. Ekartörün yerleştirilmesi, video gösterildiği gibi, gerekli değildir ve sadece sunum amaçlı olarak uygulandı.
- Cl çıkarıniskemi süre sonra amfi sonucuna varmıştır. Hemen çıkarılmasından sonra böbrek hızla başarılı reperfüzyon gösteren sağlıklı bir koyu pembe bir koyu kestane gelen rengi değişecektir.
- Yine bağırsak önceki 6/0 örgü ipek sütür kullanılarak bir battaniye dikiş ile peritonunu kapanış bükülmüş değil emin olun. Sonra metalik deri klipleri kullanarak cilt kapatın.
- , Ameliyat sonrası enfeksiyon riskini en aza indirmek gibi cerrahi bölgeye iyot / alkol çözeltisi gibi bir antiseptik uygulayın.
4. Post-operatif Kurtarma ve Bakım
- Atipamezol hidroklorür ile kısmen geri anestezi (2 mg / kg) deri altından ve 1 ml lik bir deri altından enjeksiyon ile tatbik sıvıları ameliyattan sonra su kaybını önlemek için tuz ısıtıldı.
- Onlar bilinç iyileşene kadar dikkatlice fareleri izlemek, uyarı görünür ve kendilerini sağa edebiliyoruz.
- Isıtılmış bir kutuya kurtarmak için fareler 29 ° C, loc muhafaza izin ver24 saat boyunca, sessiz bir ortamda ated. Fareler nedeniyle anesteziye thermoregulate için zarar görmüş bir yeteneğine sahip olacak ve bu da etkin bir iyileşme sağlamak için yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilir bu nedenle çok önemlidir. Nemlendirilmiş gıda da sıvı ve besin alımını teşvik sağlanabilir.
- Uzun vadeli kurtarma deneyleri devam eden analjezik sağlamak ve ameliyat sonrasında 7 gün cilt klipleri kaldırmak için.
5.. Fonksiyonel ve Yapısal Böbrek Yaralanma ve Rejenerasyon değerlendirilmesi
- Kan deney sonunda ötenazi sırasında deneyler sırasında ya da kardiyak ponksiyonu ile kuyruk damarından toplanabilir. Önce 7 açıklandığı gibi bir biyokimyasal santrifüj analizörü bir creatinase tabanlı bir yöntem ve kan üre azotu (BUN) kullanılarak, serum kreatinin böbrek fonksiyonunu ölçün. Normal sağlıklı farelerin renal fonksiyonu, bu böbrek yetmezliği modeli oluşturmak önce tespit edilmesi gerekmektedir dependi ölçüde değişebilirJaffe reaksiyonu ve kreatinin ölçümü için creatinase dayalı yöntemler, örneğin kullanılan analiz metodu üzerinde ng farklı sonuçlar verir.
- Hematoksilen ve Eosin (H & E) veya Periyodik Asit Schiff (PAS) ile boyandı parafin böbrek doku kesitlerinde histopatolojik tarafından böbrek yapısını inceleyelim. Her bir fare için, dış medulla (Osom) dış şerit içinde 200x büyütmede 10 görüntü - 5 arasında yakalar. Bu bölgede bu modelde yaralı gibi hipoksi derece savunmasız olduğundan Osom yaralanma düzeyini değerlendirin.
- Akut tübüler nekroz (ATN) veya rejenerasyon ölçmek için aşağıda ayrıntılı iki skorlama sistemlerinin birini kullanın. Bu sistemlerde kullanılan sınıflandırmaların Örnek morfolojisi, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
- ATN skoru basit bir ikili sistemi kullanın. Hücresel bütünlük ve morfolojisi işareti temelinde ve canlı (sağlam hücre morfoloji) ya da nekrotik (tehlikeye hücre inte olarak ya tübüller saymakgrity, anormal hücre morfolojisi ve hücre kaybı).
- Tübül toplam sayısı (nekrotik tübüller%) bir yüzdesi olarak nekrotik tübül sayısını ifade eder.
- Hücre bütünlüğü, morfolojisi ve çekirdekler sayısına dayalı bir sistemi kullanılarak rejenerasyon sınıflandırır. Mark ve saymak tübüller gibi, sağlıklı nekrotik, yaralı ya da aşağıdaki adımlarda listelenen kriterlere göre kurtarma.
- (Adım 5.4 ayrıntılı) ATN skorlama sistemi olduğu gibi tehlikeye hücre bütünlüğünü gösteren tübüllerine iken sağlıklı olarak bozulmamış, normal hücreler ile işareti tübüller, anormal hücre morfolojisi veya aşikar hücre kaybı nekrotik olarak atılır gerekir.
- Yaralı olarak onlar birkaç çekirdek içeren bir inceltilmiş sitoplazmasını varsa tübüllerini sınıflandırır. Bunun aksine, geri kazanılması üzerine daha fazla Normal hücre ile daha fazla çekirdek ihtiva eden tübüller işaret etmektedir.
- Tübül toplam sayısının bir yüzdesi olarak, her borucuk sınıflandırma ifade eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Borulu yaralanma ve kurtarma H & E tarafından değerlendirilecek veya böbrek IRI aşağıdaki doku kesitlerinin PAS boyama olabilir. Osom içinde bulunan Tübüller hücre morfolojisi, bütünlük ve çekirdekler numarası (Şekil 1) göre, sağlıklı yaralı, nekrotik veya kurtarma olarak sınıflandırılır. Bu modelde fonksiyonel ve yapısal hasarı, iskemi süresine bağlıdır. Iskemi süresi (Şekil 2), 2 dakika artışlarla arttırılır plazma kreatinin ve BUN ile değerlendirilen renal disfonksiyon şiddetinde bir progresif artış, belirgindir. ATN skoru anlaşıldığı yapısal böbrek hasarının derecesi, daha ağır ATN fazla uzamış iskemi (Şekil 3) eşlik benzer bir trend izlemektedir. Iskemi değişik sürelerde bir başlangıç titrasyonu takiben, böbrek IRI bu model surger aşağıdaki fonksiyonel ve yapısal hem de yaralanma gelişen tüm fareler, neredeyse% 100 başarı oranı elde edilmelidiry. Renal IRI Bu model aynı zamanda hayvanlar (Şekil 2 ve 3) arasında gözlemlenen sınırlı varyasyon ile yaralanma derecesi üzerinde kontrol iyi bir düzeyde sağlar. Iskemi farklı süreli kullanım hasarı şiddeti farklı seviyelerini modüle etme kabiliyetleri açısından incelenmesi gereken tedavi edici müdahaleler sağlar. Örneğin iskemi uzunluğuna dayanarak elde edilen hasarı (22 dakika) veya yüksek (24 dakika), (20 dakika) hafif, orta olarak kabul edilebilir. Erkek Balb / c fareleri, 8 hafta arası ve sadece bilgi olarak dahil edilir için bu değerlerdir. Bu fare zorlanma, yaş, cinsiyet ve böbrek fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılan biyokimyasal tahlil göre farklılık gibi Müfettişler kendi deneysel koşulları oluşturmalıdır.
Bu model, başarılı bir renal fonksiyon ve yapı hem de takip eden gün boyunca geri kazanılması ile renal IRI aşağıdaki rejenerasyon incelemek için kullanılmıştır. Bir kademeli plazma kreatinin düşüş ve BUN düzeyleri atıl olankazanır 'mantığıyla, plazma kreatinin günde 7 (Şekil 4) ile bazal düzeylere geri dönmesi ile. H & E boyanmış doku bölümlerinin bir değerlendirme tübül artan sayıda sağlıklı ya da doku yenilenmesi (Şekil 5) söz konusu olduğu gösteren, 4. günde kıyasla 7. günde iyileşme olarak sınıflandırılır olduğunu gösterir. 5-bromo-2'-deoksiüridin idaresi (BrdU), kesilmeden önce BrdU için böbrek dokusunun immünohistokimyasal ve boru şeklindeki hücre çoğalması sonraki ölçümü kolaylaştırır. Dramatik nükleer BrdU ifade tübül tübül bütünlüğünü ve fonksiyonunu (Şekil 6) geri yüklemek için işaretlenmiş hücre çoğalmasını geçirmekte belirten böbrek IRI aşağıdaki 4 gün görülmektedir. Yapısal iyileştirme ve BrdU immün için böbrek fonksiyon değerlendirme, puanlama kombinasyonu renal IRI Aşağıdaki rejenerasyon çalışması için kullanılacak bu modeli sağlar. Bu terapötik müdahalelerin uzun vadeli etkileri olmasını sağlararaştırılmadıkça.
Son olarak, bu modelin programı tüm böbrek global iskemi endüksiyonu bağlıdır ve bu ana sol renal arter ek olarak, böbrek besleyen kan damarlarının varlığı ile işgal edilebilir. Bu ek kaplar kenetlenmiş değildir sonra böbrek parçası iskemik hasarı (Şekil 7) tabi olmayacaktır.
Şekil 1 boru biçimindeki yapı hasarı ve yenilenme Puanlama -.. Sağlıklı Örnek morfolojisi, kurtarma yaralı ve nekrotik tübüller böbrek doku, renal IRI takip eden 4 gün çıkarılır değerlendirilmesi için PAS ile boyanır. Osom içinde bulunan Tübüller göre, sağlıklı yaralı, nekrotik veya kurtarma olarak sınıflandırılırtemsili örneklerle hücre morfolojisi, bütünlük ve çekirdekler numarası vurgulanır. Sağlıklı tübüller normal hücresel morfoloji ile bozulmamış. Nekrotik tübüller belirgin hücre kaybı ve hücre morfolojisi kaybı ile bir tehlikeye tek tabaka gösterirler. Yaralı tübüller, inceltilmiş bir hücresel mono-katman sergiler ve daha az çekirdek içerir. Bunun aksine, geri kazanılması tübülleri sağlıklı tübüller daha normal bir hücre morfolojisi ve çekirdeklerin benzer sayıda sergiler. Büyütme:. 400x bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Yaralanma -. Renal iskemi böbrek fonksiyonunu bozar Erkek Balb / c fareleri 8 hafta sağ nefrektomi yaşlı ve.Sol böbrek pedikül 20, 22 veya 24 dakika boyunca (her grupta n = 4) için kenetlendi. Fareler renal IRI takip eden 24 saat sonra kurban edilmiştir. Plazma kreatinin ve kan üre azotu artan iskemisi uzunluğu olarak şiddeti giderek artan bir eğilim göstermektedir. Kesikli çizgi, normal kontrol farelerinde bulunan plazma kreatinin ve kan üre azot düzeylerini temsil eder. Ortalama ± SEM olarak sunulan ve tek yönlü ANOVA ile analiz verileri. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
. Şekil 3 Yaralanma - Böbrek iskemi önemli akut tübüler nekroz neden 8 hafta, erkek Balb / c fareleri sağ nefrektomi ve sol renal pedikül cl oldu.20, 22 veya 24 dakika boyunca (grup başına n = 4) için yükseltti. Fareler renal IRI takip eden 24 saat sonra kurban edilmiştir. Temsilci fotomikrografları: kontrolü ve yaralı böbreklerde H & E boyalı böbrek bölümlerde Osom ait (Büyütme 200x) ATN göstermektedir. (Nekrotik tübüller oranı olarak ifade edilir) ATN Formal skorlama iskemi artan süresi yaralanma yüksek düzeyini teyit etmektedir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur ve tek yönlü ANOVA (**** = P ≤ 0.0001) ile analiz. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
. Şekil 4 Rejenerasyon - Böbrek fonksiyonu böbrek iskemi aşağıdaki kurtarır Erkek FVB fareler ag.ed: 8 - 10 hafta sol böbrek önce iskemi 25 dakika sağ nefrektomi yapıldı. Fareler 4 gün (n = 10) ya da 7 gün (n = 6) renal IRI takiben, 1 gün (n = 10) kurban edilmiştir. Plazma kreatinin ve kan üre azotu hem de giderek plazma kreatinin böbrek fonksiyonlarında bir iyileşme gösteren, bazal düzeylere geri dönmesi ile, 7 gün boyunca düşüş. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur ve tek yönlü ANOVA (*** = P ≤ 0.001, * = P ≤ 0.05) ile analiz. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 Rejenerasyon -. Renal doku rena aşağıdaki iyileşme belirtileri gösterir . l iskemi Erkek FVB fareler yaşları 8-10 hafta sol böbrek önce iskemi 25 dakika sağ nefrektomi yapıldı. Fareler feda 4 gün (n = 10) ya da 7 gün (n = 6) renal IRI takip edilmiştir. Temsil edici fotomikrografikler: iskemisi indüksiyonundan sonra Osom of (200x büyütme) gösterilmiştir. Yaralı kurtarma sağlıklı sayısı, ya Osom içindeki nekrotik Tübüllerin resmi puanlama PAS boyanmış parafin bölümlerde değerlendirildi. Hala yaralı görünen Osom içindeki tübüllerin büyük bir kısmı böbrek IRI aşağıdaki 4. günde. Ancak 7 gün sağlıklı veya böbrek rejenerasyon göstergesi kurtarma olarak sınıflandırılır tübüllerinin oranında önemli bir artış var. Ortalama ± SEM olarak sunulan veriler. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
. Şekil 6 Rejenerasyon - Dram boru şeklinde yayılması böbrek iskemi aşağıdaki bariz 4 gün 8 yaşındaki erkek FVB fareler -. 10. hafta sol böbrek önce iskemi 25 dakika sağ nefrektomi yapıldı. BrdU (50 mg / kg) feda 24 saat önce intraperitonal enjeksiyon ile tatbik edilmiştir. Fareler feda 4 gün (n = 10) ya da 7 gün (n = 6) renal IRI takip edilmiştir. Temsil edici fotomikrografikler: farelerden Osom of (200x büyütme) Gün 4 ve iskemi indüksiyonundan sonra 7. günde kurban gösterilmiştir. Tübüler hücre çoğalması parafin böbrek bölümlerinde BrdU için immünohistokimyasal boyama ile değerlendirildi. Boru hücre proliferasyon artan hücre çoğalmasıyla Osom olarak BrdU pozitif çekirdeklerin sayısını sayarak ölçülmüştür4. günde belirgindir. Veriler ortalama ± SEM sundu ve öğrencilerin t-testi (*** = P ≤ 0.001) tarafından analiz. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 7. Olmayan tıkalı ek böbrek kan damarları ile iskemik böbrek Sol. Böbreği besleyen kan damarlarını tıkamak ek Başarısızlık tutarsız iskemi yol açar. Mikro serrafine klip konumda olduğunda (A) genel böbrek iskemi yokluğu düzgün olmayan bir renk değişimi (beyaz ok) ile gösterilir. (B) mikro serrafine klibin ayrılmasından sonra, ana renal arter ve ven temin ilave damarıyla, birlikte (beyaz ok) görebilirböbrek (siyah ok) orta ve alt kutup. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Böbrek IRI hiçbir spesifik tedavi ile AKI önemli bir nedenidir. Renal IRI deneysel çalışma makrofajlar, dendritik hücreler, lenfositler, düzenleyici T-hücreleri ve aynı zamanda başka hücreler ve akut yaralanma ve faz 5,8 iyileşme her iki indüklenmesinde aracılar rolünü gösteren önceki çalışma ile, son derece bilgilendirici olmuştur - 16. Buna ek olarak, deneysel renal IRI çeşitli terapötik maddelerin 4,17-19 etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır.
Burada ayrıntılı böbrek IRI modeli sağ nefrektomi yapmak ve kelepçeler kullanarak sol böbrekte iskemi ikna etmek için bir orta hat laparotomi yaklaşım kullanır. Iskemi süresini değiştirerek, temsili sonuçlar ile gösterildiği gibi, yaralanma şiddetini kontrol edebilir. Bu nedenle, bu modeli ortaya deneysel söz gerektirdiği gibi, hafif, orta ya da böbrek hasarı yüksek düzeyde bir indükleme ayarlanabilir. Ancak, bu modelin bir sınırlama olduğunu daUzun süreli böbrek iskemi ile çok şiddetli böbrek hasarı endüksiyonu için uygun değildir. Çıkan şiddetli akut böbrek fonksiyon bozukluğu anlamlı mortaliteye neden olabilir.
Öngörülebilir ve tekrarlanabilir böbrek hasarı elde etmek için çok önemli olan bu modelin çeşitli yönleri vardır. Bu model ile değişkenliğin önemli bir kaynak iskemik periyot süresince 20 vücut sıcaklığına kaynaklı olabilir. Bu, vücut ısısı sabit bir seviyede tutulur ve iskemik dönem boyunca izlenir bu nedenle önemlidir. Bu protokolde sıcaklık probları ve homoeothermic battaniye ile bir kontrol birimi, 37 ° C'de oto-regüle vücut sıcaklığı için kullanılmıştır Iskemik yaralanmaya böbreğin duyarlılık vücut sıcaklığının etkisi de tarif edilmektedir. Önceki çalışma vücut ısısı renal IRI 20 ile farelerin vücut sıcaklığında değişim potansiyel bir karıştırıcı olan şiddetini etkilediğini göstermiştirsonuçların yorumlanmasını etkileyebilecek faktör. Diğer bir önemli husus farenin sol böbrek kaynağı ilave kan damarları ile anatomik bir çeşitlilik ortaya olmasıdır. Bu tür ek kan damarları tespit ve sağ nefrektomi yapmak ve sol böbrekte küresel iskemi uyaran zaman tıkalı olması önemlidir. Aksi takdirde böbrek boyunca tutarsız iskemi neden olur. Benzer bir şekilde, sol renal pedikül sol böbrek aşağıdaki sıkma renk değişikliği başlangıçta dikkatli bir şekilde tespit edilmemiş olan ek bir renal arter varlığı genel bir renk değişiklik yokluğu olarak göstermektedir incelenmelidir.
Iki taraflı böbrek iskemi kullanmak modellerinin aksine, bu model genlerin ekspresyonunu modüle etmek için ilaçlar ya da diğer ajanlar profilaktik uygulama kullanan araştırmacılar için ilgi çekici olacaktır, protein vs önce renal yaralanması. Teçhizatht nefrektomi doku hem de teyit etmek için kullanılır ve endüktif veya her bir deneysel hayvan içinde, ilgi konusu moleküle inhibisyonu seviyesini ölçmek edilebilir. Akut yaralanma faz belirgin tübüler çoğalması tarafından takip edilir Bu model aynı zamanda böbrek rejenerasyon okuyan araştırmacılar için ilgi olacaktır.
Belirgin hastalık sadece farelerin belirli türlerinde indüklenebilir böbrek iltihabı bazı deneysel modellerde sınırlıdır. Bunun aksine, renal IRI modeli, burada açıklanan çok yönlü ve 5 erkek ve dişi fareler 4, farelerin farklı suşları hem de yaşlı farelerde 4 hem de uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue scissors | Fine Science Tools | 14072 - 10 | |
| Micro-Adson forceps (Rat toothed) | Fine Science Tools | 11019 - 12 | |
| S&T JFA-5bTC Forceps - SuperGrip Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Colibri retractor | Fine Science Tools | 17000 - 04 | |
| Micro clip applicator | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| Micro serrafines | Fine Science Tools | 18055-04 | |
| Olsen-Hegar needle holder | Fine Science Tools | 12002 - 12 | |
| Hemoclip Plus Ligating Clips Small | Weck | 533837 | |
| Autoclip Wound Clip System, 9mm | Harvard Apparatus | PY2 52-3748 | |
| Silk Black Braided Suture, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Standard Heat Matt | |||
| Homeothermic Blanket & Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| Lacri-Lube | Allergan | ||
| Vetasept Chlorhexidine | AnimalCare | ||
| Vetalar : Ketamine hydrochloride | 100 mg/ml solution | ||
| Domitor : medetomidine hydrochloride | 1 mg/ml | ||
| Vetergesic : Buprenorphine hydrochloride | 0.3 mg/ml | ||
| Antisedan : Atipamezole hydrochoride | 5 mg/ml |
References
- Kinsey, G. R., Li, L., Okusa, M. D. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol. 109, (2008).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303, (2012).
- Ferenbach, D. A., Kluth, D. C., Hughes, J. Hemeoxygenase-1 and renal ischaemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol. 115, (2010).
- Ferenbach, D. A., et al. The induction of macrophage hemeoxygenase-1 is protective during acute kidney injury in aging mice. Kidney Int. 79, 966-976 (2011).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophage/monocyte depletion by clodronate, but not diphtheria toxin, improves renal ischemia/reperfusion injury in mice. Kidney Int. 82, 928-933 (2012).
- Ferenbach, D. A., et al. Macrophages expressing heme oxygenase-1 improve renal function in ischemia/reperfusion injury. Mol Ther. 18, 1706-1713 (2010).
- Keppler, A., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, 74-78 (2007).
- Vinuesa, E., et al. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. J Pathol. 214, 104-113 (2008).
- Friedewald, J. J., Rabb, H. Inflammatory cells in ischemic acute renal failure. Kidney Int. 66, 486-491 (2004).
- Gandolfo, M. T., et al. Foxp3+ regulatory T cells participate in repair of ischemic acute kidney injury. Kidney Int. 76, 717-729 (2009).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4+ T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. , 1283-1290 (2001).
- Burne-Taney, M. J., et al. B cell deficiency confers protection from renal ischemia reperfusion injury. J Immunol. 171, 3210-3215 (2003).
- Kinsey, G. R., et al. Regulatory T cells suppress innate immunity in kidney ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 1744-1753 (2009).
- Li, L., Okusa, M. D. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 30, 268-277 (2010).
- Lin, S. L., et al. Macrophage Wnt7b is critical for kidney repair and regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 4194-4199 (2010).
- Lee, S., et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair. J Am Soc Nephrol. 22, 317-326 (2011).
- Kumar, S., et al. Dexamethasone ameliorates renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 20, 2412-2425 (2009).
- Sharples, E. J., et al. Erythropoietin protects the kidney against the injury and dysfunction caused by ischemia-reperfusion. J Am Soc Nephrol. 15, 2115-2124 (2004).
- Gueler, F., et al. Statins attenuate ischemia-reperfusion injury by inducing heme oxygenase-1 in infiltrating macrophages. Am J Pathol. 170, 1192-1199 (2007).
- Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., ElNahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39, 2983-2985 (2007).
