Introduction
Selvom der er mange almindeligt anvendte metoder til frembringelse af moderat til svær traumatisk hjerneskade (TBI), har meget få teknikker blevet udviklet til at inducere milde, lukkede hovedskader hos gnavere. På grund af det faktum, at mild traumatisk hjerneskade (MTBI) er tre gange hyppigere end moderat og svær hjerneskade kombineret 1, skal der en pålidelig model for MTBI at lette forskning vedrørende patofysiologi, neurobiologiske og adfærdsmæssige resultater, og terapeutiske strategier. For eksempel, delvist på grund af de begrænsninger, den nuværende dyremodeller 2, i det seneste årti har der været over 200 mislykkedes kliniske lægemiddelforsøg til behandling af TBI 3. Når modelsystemer genereres for translationelle forskningsundersøgelser, anvendeligheden af resultaterne er afhængige af gyldigheden af modellen gennemføres. Til undersøgelse af MTBI / hjernerystelse, ville en pålidelig dyremodel ikke kun efterligne den biomekaniske kræfter Responlige for personskade ætiologi, men ville også fremkalde symptomer forenelige med dem, der rapporteres af klinisk relevant befolkning. Desuden fordi børn har en særlig høj risiko for MTBI ville optimale modelsystemer gælde for unge og unge gnavere, ud over deres voksne ækvivalenter.
Biomekaniske analyser af omstændigheder, hvor atleter har lidt mTBIs eller concussive hjerneskader tyder på, at de mest kritiske prædiktive faktorer for personskade er hurtig acceleration af hovedet og hastighed påvirkninger høje 4. Størstedelen af gnavermodeller øjeblikket anvendes til induktion af TBI tillader ringe eller ingen bevægelse af hovedet 5 (for review se 2). Modellen er skitseret her, leverer en høj hastighed indvirkning på hovedet af en fysisk uhæmmet unge rotte, der er ledsaget af en 180 ° rotation og frit fald, der gælder acceleration / deceleration kræfter til emnet hoved og krop. Ther er to store fordele forbundet med denne modificerede vægt drop teknik til induktion af MTBI. Først modellen producerer klinisk relevant concussive ligesom symptomologi uden at forårsage nogen åbenlys skade på hjernen (for udførlig beskrivelse af adfærdsmæssige resultater se 6). Også i overensstemmelse med kliniske rapporter om post-concussive syndrom, denne modificerede vægt-drop teknik producerer heterogene resultater. Selv om virkningerne fra MTBI er betydelige, er der en betydelig variation mellem gnavere, der har oplevet en MTBI når undersøgt på flere resultatmål. For det andet, den metode tillader studiet af gentagne MTBI 7. Da størstedelen af de eksisterende TBI modeller påfører sådanne alvorlige skader, er det ofte vanskeligt at fremkalde en anden skade, og næsten umuligt at studere gentagne TBI uden omfattende skader på hele cortex.
Derfor er det primære rationale for anvendelse af den modificerede vægt drop teknik til induktion af MTBI er at producere en skade, der i højere grad repræsenterer patofysiologi og symptomologi af hjernerystelse og gentagne TBI hos unge befolkninger. Med den stigende forekomst af MTBI relateret til sport, falder, og bil ulykker, især i barndommen, denne unikke gnaver model af MTBI giver forskerne et værdifuldt redskab for studiet af concussive-lignende hjerneskade, der let kan anvendes på flere hit paradigmer.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med den canadiske Rådet for Animal Care og blev godkendt af University of Calgary, Animal Care etiske komité.
1. Avl og Animal Forberedelse
- Bestil gravide rotter fra standard laboratoriedyr leverandører eller race hvalpe i huset ifølge standard avl protokoller.
- Hus alle dyr med ad libitum adgang til mad og vand, i et temperaturstyret rotte boliger værelse (21 ° C), er der opretholdes en 12:12 timers lys: mørke-cyklus.
- Når hvalpe nå postnatal dag 21 (P21), afvænne hvalpe fra deres mødre og hus i grupper på 3 eller 4 af samme køn.
2. Opsætning af Mild traumatisk hjerneskade (MTBI) Apparatur
- Før påbegyndelse af proceduren, mill vægte til den ønskede masse (f.eks 150 g). Fastgør et metal sløjfe til den øverste ende af vægten tillader snøren være fiXED til vægten.
- Score tin folie med en skarp barberblad. Sørg for, at scoret sølvpapir understøtter kropsvægten af rotte men vil ikke forstyrre acceleration af rotte efter hovedhøjde med vægten.
- Tape den ridsede tin folie til den U-formede fase fremstillet af klar plast (38 x 27 x 27 cm3), der indeholder en samling svamp (38 x 25 x 15 cm3) (figur 1), således at den er stram.
- Anbring den U-formede plast fase i den korrekte position under styrerøret fremstillet af klar plast.
- Hold plast styrerøret (2,2 cm diameter x 1,5 m) på plads med en klemme stativ og placere styrerøret, så det er 3,5 cm over scoret tin folie.
- Fastgør snøren gennem metal loop til vægten sikre, at bunden af vægten hænger frit 2,5 cm over scoret tin folie.
- Fastgør snøren til klemmen stativet.
BEMÆRK: tethering vægten til clamp stativ i en højde af 2,5 cm over sølvpapir forhindrer re-hits, mens rotten falder fra virkningen til samlingen svamp). - Træk vægten op gennem plastik føringsrør med snøren og holde det på plads med en unbrakonøgle stift på 1,0 m.
3. Induktion af MTBI
- Når rotter nå P30 flytte bure ind i proceduremæssige værelse.
- Placer rotter i en isofluran kammer og let bedøve rotte indtil den er ikke-responsive for en pote eller hale knivspids.
- Hurtigt placere rotte bryst nedad på scoret sølvpapir med hovedet direkte i vejen for den faldende vægt. Se figur 2. Hvis rotten begynder at bevæge sig eller wake-up, inden den kan placeres på scoret sølvpapir, vende tilbage til isofluran kammeret, indtil der ikke reagerer på en pote eller hale knibe og begynde forfra.
- Træk unbrakonøglen pin, tillader vægten at falde lodret gennem plast styrerøret og slå rotte på hovedet. The rotte vil hurtigt gennemgå en 180 ° rotation og jord i liggende stilling.
- Fjern omgående rotten fra indsamling svamp og anvende aktuel lidokain på rottens hoved med en bomuld tippes applikator.
- Placer rotte i rygleje i et rent bur, der er opvarmet ved at indstille det på en kommercielt tilgængelig varmepude.
- Ved hjælp af et stopur og digital timer erhverve "time-to-højre". Time-to-højre er den tid, rotten til at vågne fra bedøvelsen og flip fra liggende stilling til bugleje eller begynde at gå.
- Retur rotten til sit hjem-bur, når den har genvundet normal adfærd (grooming, gåture, udforskning, etc.).
- Gentag trin 3,2-3,8 for hver ekstra rotte kræver en MTBI.
- Gentag proceduren på den samme rotte på forskellige tidspunkter for gentagne MTBI eksperimenter.
4. Induktion af Sham Skade
- Let Anesthetize rotte med isofluran, indtil den er ikke-responsive for en pote eller hale knivspids.
- Hurtigt placere rotte bryst nedad på scoret sølvpapir med hovedet direkte i vejen for den faldende vægt.
- Fjern rotte fra sølvpapir uden at trække unbrakonøglen pin fra plast føringsrør og anvende aktuel lidokain i hovedet på rotten med en bomuld tippes applikator.
- Placer rotte i rygleje i et rent bur, der er opvarmet ved at indstille det på en kommercielt tilgængelig varmepude.
- Brug et stopur eller digital timer til at erhverve den "time-to-højre".
- Retur rotten til sit hjem-bur, når den har genvundet normal adfærd (grooming, gåture, udforskning, etc.).
5. Kontrol af MTBI med Beam Gåture Test 8
- 24 timer efter induktion af MTBI eller fingeret skade retur dyr til den proceduremæssige værelse.
- Overfør rotterne til en ren bedrift burog placere rottens home-bur i smallere ende af 165 cm koniske stråle, således at den åbne del af hjemme-bur vender smallere ende af bjælken.
BEMÆRK: Den tilspidsede stråle er 165 cm lang. Centret platform af strålen har en bredde på 6 cm i den brede ende og 1,75 cm i smalle ende. Centret stråle har afsatser (2 cm bredt og 2 cm under midten stråle), som giver sikkerhed, når rotten fod glider. Placer skum polstring under bjælken for at reducere risikoen for skade på rotter, der kan falde af strålen under testen. - Anbring et videokamera i den brede ende af den tilspidsede stråle og position / zoom videokamera til at sikre, at investigator se videoen tydeligt kan se bevægelser rotte for hele længden af den tilspidsede stråle.
- Placer rotte i den brede ende af den tilspidsede stråle og tilskynde den til at gå på tværs af strålen til sit hjem-bur. Når rotten krydser tilspidsede stråle, forlade rotte i sit hjem-bur i mindst 60 sek til reinForce målet placering. Dette er Trial # 1 og ikke medtaget i analysen.
- Tænd for videokameraet, og lade rotten at fuldføre stråle-walking opgave 4 ekstra gange (opretholdelse af 60 sek forstærkning perioder i hjemmet bur). Når rotten har afsluttet alle forsøg tilbage rotten til sit hjem-bur.
- For at score, registrere antallet af bagben mund-sedler, der opstår, og den tid / varighed at krydse bjælken, for hver enkelt forsøg. Bruge disse data til at beregne den gennemsnitlige antal bagben mund-glider og tid til at krydse stråle for hver rotte.
Representative Results
Den modificerede vægt-drop ovenfor beskrevne teknik er en pålidelig metode til induktion af mild traumatisk hjerneskade (MTBI) i unge rotter. Ved hjælp af en vægt på 150 g anslag har denne teknik blevet anvendt med succes til unge rotter, der spænder fra 50 til 120 g. Desuden kan fremgangsmåden let gentages i de samme dyr til undersøgelse af gentagne MTBI. Selvom dyr, der oplever en enkelt MTBI udviser en stigning i tid-til-højre (Figur 3), og synes bedøvet når man vågner, de hurtigt genoptage normale aktiviteter og er visuelt skelnes fra skin-tilskadekomne dyr. Da skaden er mild, aktuel lidocain som eliminerer enhver smerter forbundet med den kigger virkning, er den eneste smertestillende påkrævet. Dette er vigtigt for forskning som smertestillende medicin er kendt for at interferere med typiske inflammatoriske og oprensningsprocesser. På grund af mangel på åbenlys symptomologi, strålen walking opgave er en pålidelig tilol, der kan bruges til at validere induktion af MTBI. Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle dyr, der oplever en MTBI udstiller underskud på bjælken walking opgave, men som en gruppe, unge rotter med en MTBI demonstrere betydeligt mere bagben mund-sedler i forhold til unge rotter med en fingeret skade (figur 4).
Et andet centralt kendetegn ved denne modificerede vægt-drop teknik er den manglende tilbageholdenhed anvendes på juvenile rotter i skade induktion. Ved at levere en forbigående slag i hovedet efterfulgt af hurtig roterende acceleration og deceleration, denne model tættere repræsenterer de biomekaniske kræfter tilskrives MTBI og hjernerystelse. Når denne procedure anvendes på unge rotter eller voksne mus, dødeligheden er meget lav (7/202 ungdyr ~ 3,4% dødelighed), og kraniebrud og intrakraniel blødning er usædvanligt sjældne 6,7. Derudover modellen producerer klinisk relevant symptomology. Juvenile gnavere, der har oplevet en enkelt MTBI demonstrerede underskud i balance og motoriske adfærd, sammen med underskud på udøvende funktion, forhøjet depressive-lignende adfærd og ændrede sociale interaktioner 6,9. Tilsvarende viser voksne mus også milde balance og koordinering underskud, der genvinder med tiden 7. Endelig induktion af MTBI bruge denne model kræver minimal bedøvelse og ikke indebærer kirurgisk forberedelse eller gravende ind i kraniet. Resultaterne er derfor ikke påvirket af confounding inflammatoriske eller immunologiske virkninger udløst af kirurgi eller anæstesi. Desuden hurtig genopretning tid og mangel på åbne sår muliggør påbegyndelse af yderligere test paradigmer at forekomme kort efter gnavere oplever MTBI.
Figur 1: > C Artoon repræsentation af den U-formede plast fase og indsamling svamp med alle relevante dimensioner. En afstand på 10 cm skal opretholdes mellem tapning svamp og toppen af plast fase for at sikre den unge rotte har tilstrækkelig tid til at fuldføre 180 ° rotation.
Figur 2: (A) fotografisk gengivelse af skaden induktion platform. Juvenile rotte placeres bryst nedad på scoret tin folie, så at hovedet er direkte under den faldende vægt. (B) fra siden af skade induktion platformen. (C) Fotografisk demonstration af vægten anvendes i induktion af MTBI .
upload / 51820 / 51820fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3: Grafisk fremstilling af de gennemsnitlige forskelle i tid-til-højre mellem unge rotter, der har oplevet en enkelt MTBI og unge rotter, der har oplevet en fingeret skade (* p <0,01) Rotter, der har modtaget en MTBI udviser en betydelig stigning i. varighed af tid er nødvendig for at rette sig fra liggende stilling.
Figur 4: Grafisk fremstilling af det gennemsnitlige antal bagben mund-sedler udstillet på Beam Gå opgave af unge rotter, der har oplevet en enkelt MTBI og unge rotter, der har oplevet en fingeret skade (* p <0,05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass Weights | Ginsberg Scientific | 7-2500-2 | Need to have metal loop attached to base |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Masking Tape | Commercially available | ||
| U-Shaped Plastic Stand | Constructed by Laboratory | ||
| Clamp Stand | Sigma-Aldrich | Z190357 | |
| Plastic Guide Tube | Could be constructed or purchased at a hardware store | ||
| Fishing Line | Angler 10lb | Purchased from a sporting goods retailer | |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02237518 | Inhalation Anesthetic |
| Topical Lidocaine (30ml) | Astra Zeneca | DIN 0001694 | Xylocaine Jelly 2% |
| Cotton Swabs | Commercially available | ||
| Heating Pad - 3 heat setting | Commercially available | ||
| Stop Watch | Sportline | L303 | Purchased from a sporting goods retailer |
| Video Camera | Sony | HDR-CX260V | |
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house |
| Balance Beam | Constructed by Laboratory |
References
- DeWitt, D., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C., Dash, P., Robertson, C. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30, 688-701 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
- Zhang, Z., Lerner, S., Kobiessy, F., Hayes, R., Wang, K. Systems biology and the anostic approach to drug discovery and development to treat traumatic brain injury. Systems Biology in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Yan, Q. , Springer Science. Forthcoming.
- Viano, D., Casson, I., Pellmen, E. Concussion in profession football: Biomechanics of the struck player - Part 14. Neurosurgery. 61, 313-327 (2007).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats: Part 1 - Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80, 291-300 (1994).
- Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), (2014).
- Kane, M., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Schallert, T., Woodlee, M., Fleming, S. Disentangling multiple types of recovery from brain injury. Pharmacology of Cerebral Ischemia. Krieglstein, J., Klumpp, S. , Medpharm Scientific Publishers. Stuttgart. (2002).
- Mychasiuk, R., Hehar, H., Farran, A., Esser, M. J. Mean Girls: Sex differences in the effects of mild traumatic brain injury on the social dynamics of juvenile rat play behaviour. Behavioural Brain Research. 259, (2014).
- Centers for Disease Control and Prevention. Report to congress on mild traumatic brain injury in the United States: Steps to prevent a serious public health problem. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. 1-47 (2003).
