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Bioengineering

Análise da Membrana Tubular Networks em Cardiac Miócitos de átrios e ventrículos

Published: October 15, 2014 doi: 10.3791/51823
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Heart Research Center Goettingen, 2Clinic of Cardiology & Pulmonology, University Medical Center Goettingen, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK) partner site Goettingen, 4BioMET, Center for Biomedical Engineering & Technology, University of Maryland School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Em miócitos cardíacos, estruturas de membrana tubular formar redes intracelulares. Descrevemos os protocolos para i) isolamento de miócitos de coração do rato, incluindo controle de qualidade, ii) coloração de células vivas para a microscopia de fluorescência state-of-the-art otimizado, e iii) a análise de imagens direto para quantificar a complexidade do componente ea plasticidade de membrana intracelular redes.

Introduction

Nas células do músculo estriado saudáveis, estruturas de membranas tubulares com orientações "transversal" (túbulos T) perpendiculares aos eixos principais de células são abundantes. Consequentemente, túbulos T têm sido caracterizados como extensões contínuas da célula muscular principal "laterais" de membrana da superfície (sarcolema), que penetram profundamente no citosol para o centro da célula. O papel fisiológico de túbulos T contínuas com a superfície externa da membrana é o acoplamento eléctrico rápido de compartimentos intracelulares remotas formadas por domínios de contacto SER organelos toda a quantidade relativamente grande de células do músculo cardíaco por nanométrica acoplamento de proximidade de tipo-L activada por Ca2 + tensão canais (Cav1.2) para dentro de corrente (I Ca) a ativação do receptor rianodina adjacente (RyR2) SER Ca2 + lançamentos. Em miócitos ventriculares (VMs), os contatos de membrana não-contínuas ("junções") entre os domínios juncional Ser e T-tubules são pensados ​​para controlar milhares de nanodomains Ca2 + intracelulares libertação individuais em cada célula 1.

Para qualquer dado domínio de contacto, as porções de cada membrana justapostas do túbulo T e do (juncional) SER periférica são de aproximadamente 15 nm, próximos uns dos outros, portanto, definidos como nanodomain. Assim, muito pequenas subespaços citoplasmáticos individuais são segregados que permitem quase comportamentos compartimento de células-autônoma. Quando um potencial de ação recebida ativa canais Cav1.2 nos túbulos T de VMs, um grupo relativamente pequeno de Ca2 + para dentro atual vai aumentar rapidamente o subespaço concentração de Ca2 + [Ca 2 +] S no attoliter nanodomain porte 1. Em seguida, o S aumento [2 + Ca] ativa Ca2 + receptores rianodina -gated (RyR2) dentro da proximidade nanômetros na junção da membrana SER justapostos, e este processo de acoplamento ocorre ao longo de todo casal eletricamented miócitos nanodomains. RyR2s ocorrer agrupamentos de vários canais como densas com uma estequiometria estimada de 1 canal Cav1.2 por 5-10 RyR2 canais 2. Desde o SER-a-cytosol [Ca 2 +] gradiente é muito íngreme (proporção 10 4: 1) e RyR2s funcionar como de alta condutância Ca2 + canais de libertação em clusters funcionalmente acoplados, RyR2 resultados de ativação em um quantitativo grande de Ca2 + A versão atual do T-túbulos juntamente domínios SER juncional crescentes subespaço local [Ca 2 +] S para 100 M ou superior dentro de 1-2 ms 3,4. Este comportamento amplificação do sinal cardíaco também é referido como Ca2 + induzida Ca2 + release (CICV). Tomados em conjunto, túbulos T são estruturas essenciais membrana que rapidamente ativar os sinais de libertação de Ca2 + através de junção contatos nanodomain Ser e em toda a célula CICR ​​durante acoplamento excitação-contração (CE).

Além túbulos T, tubular axials (A-túbulos) com uma orientação muito diferente paralelo ao principal eixo de células (longitudinal) foram documentados por meio de microscopia eletrônica (ME), e os estudos de microscopia confocal dois fótons. Por exemplo, uma ampla estrutura celular contínua de uma túbulos entre myofibrils interligados com túbulos T perto de linhas-Z do sarcômero foi mostrado por marcadores extracelulares e EM imagem de cobaia fixo VMs 5. Usando fluoresceína coloração ligada ao dextrano extracelular e viver dois fótons de imagem de rato VMs, uma rede de túbulos 3D reticular complexo foi visualizado consistindo de ~ 60% túbulos T e ~ 40% A-túbulos 6. Este estudo não só levou a visualização 3D de abundantes A-túbulos, mas também para a percepção de que o corte para visualização EM é inerentemente limitado para a análise de redes de membrana complexos e dinâmicos, como o sistema tubular transverso-axial (TATS). Consequentemente, imagens de células vivas confocal de membranas Tats diretamente manchada com di-8-ANNEPS foi desenvolvido. Se a célula vivaRedes tatuagens são analisadas por transformada de Fourier, a aparição regular de componentes túbulo T no espaço perto de linhas-Z do sarcômero é refletida pelo espectro de potência conjunto de uma região de sinais estriados 7. Esta estratégia de análise indirecta foi utilizado para detectar a largura da célula mudanças regionais nas TATS regularidade componente em modelos de doença 7. Por exemplo, shRNA mediada junctophilin-2 knock-down causou insuficiência cardíaca e deficiência de proteína específica isoforma resultou na reorganização túbulo T com nanodomain Ca2 + disfunção versão 8. Nós estendemos recentemente, a análise de redes de membrana tatuagens através de abordagens quantitativas diretas e ainda por microscopia de Super células vivas dos componentes individuais em tatuagens rato VMs usando esgotamento emissão estimulada (STED) Nanoscopia 9. Resolução da imagem nanométrica permitiu a análise directa dos componentes menores Tats individual, que se aproximam de uma distribuição de transversal 50:50contra orientações do túbulo axiais, confirmando quantitativamente dois componentes Tats abundantes ainda orientados diferencialmente individuais em corações do rato saudáveis ​​9. Estas estratégias serão mais delineado na seção de protocolo a seguir.

Embora o papel fisiológico dos abundantes componentes A-dos túbulos no coração adulto permaneceu enigmática, estudos têm documentado EM SER estruturas de membrana associada a uma túbulos sugerindo Ca 2 + endógeno nanodomains libertação em cobaia e do rato VMs 5,10. Análise confocal de Cav1.2 e RyR2 encontrado um alto grau de co-localização nos cruzamentos A-túbulo 10. Desde ~ 20% do espontâneas de Ca2 + faíscas em ratos VMs originaram relativamente longe estrias Z-line, onde túbulos T ocorrem tipicamente, um argumento foi que nanodomains A-túbulo associados podem de fato existir e funcionar como Ca 2 + soltura 11,12. Curiosamente, a formação de t-túbulo e maturação occurs somente após o nascimento e acompanha o crescimento de células cardíacas, por exemplo, através de surgimento de invaginações precursor sarcolemais a P5 e imaturo ramificada assembléias rede TATS no P10 em camundongos 13. Parece que Junctophilin-2 é particularmente importante para a maturação pós-natal de rede TATS desde shRNA knock-down impediu a ancoragem das membranas tubulares de T-junções SER levando a libertação retardada de Ca2 + e organização TATS patológico consistente com arquitecturas A-imaturo túbulo dominados em VMs 13. Estas observações podem levar a prova-de-conceito que a T-túbulos formam através de processos de invaginação da membrana enquanto que uma túbulos podem se transformar através de mecanismos intracelulares adicionais ou mesmo alternativos 14.

Caracterização de tatuagens alterações de membrana em doenças do coração tornou-se uma importante área de pesquisa para questões fisiopatológicas. Os relatórios iniciais em um modelo de cão de induzida por estimulação cardíaca failure mostrou uma perda de túbulos T e Cav1.2 corrente (I Ca) 15. A modelo suíno de miocardiopatia isquêmica mostraram redução densidades túbulo T e uma sincronia reduzido de Ca2 + intracelular liberar 16. Usando um modelo de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) de insuficiência cardíaca, uma perda de túbulos T foi associado à redução do acoplamento nanodomain de Cav1.2 e RyR2 pelo mecanismo proposto de "RyR2 orfandade" 7. A perda de túbulos T também foi mostrado em VMs humano a partir de amostras de cardiomiopatia isquêmica, dilatada, hipertrófica e 17. Além disso, um aumento da A-túbulos foi relatado em secções de tecido humano de cardiomiopatia dilatada 18. Após o infarto do miocárdio, mostramos um mecanismo diferencial de TATS reorganização do mouse VMs com reduções significativas de túbulos T, em contraste com o aumento de componentes A-9 do túbulo. Importante, melhor contraste local, obtida por meio de membrana de células vivas superremicroscopia STED solução permitiu a análise de componentes quantitativa detalhada através de medições diretas, que mostraram proliferação significativa dos A-túbulos com aumentos globais da extensão da rede TATS e ramificação complexidade 9. Além disso, foi demonstrado que o treinamento físico pode reverter remodelação túbulo T em ratos após infarto do miocárdio 19 e que a terapia de ressincronização cardíaca pode levar a remodelamento reverso de túbulos T em cães com tachypacing induzida falha atrial coração 20. Tomados em conjunto, os estudos, tanto no humano doente e animal VMs, bem como intervenções terapêuticas potenciais beneficiará, sem dúvida, de alta qualidade procedimentos de isolamento de células e estratégias de análise quantitativas detalhadas, conforme descrito no protocolo e resulta seções abaixo.

Além disso, como demonstrado recentemente por superfície lateral contra o tráfico de membrana TATS canal KATP isoformas 21, é importante considerar m fibrilaçãoyocytes (AMS) como biologicamente distintos, bem como o modelo de célula cardíaca comparativa contra VMs. T-túbulos foram recentemente documentada em ovinos e humanos AMs 22. A evidência atual sugere que alguns túbulos T existem em células AM e normalmente em mamíferos maiores, como ovelhas e seres humanos, mas não em pequenos roedores 23. Em contraste com MV, em MAs intracelular de Ca 2 + de libertação parece ocorrer a partir da propagação da superfície da célula por difusão para o centro da célula que resulta numa marcada espacial e temporal de Ca 2 + 23 gradientes. Dentro deste quadro parece importante para elucidar os mecanismos de Ca 2 + intracelular sinalização instabilidade para as formas de doenças comuns, como a fibrilação atrial 24. Em resumo, ambos PM e VM o isolamento de células e para cada corações normais e doentes são geralmente empregues protocolos. Só se o isolamento de células é feito corretamente, a julgar pela documentação microscópica de qualidade suficiente de células, as amostras AM e VM deve ser carried para a frente para a análise quantitativa TATS. Assim, as seções de protocolo a seguir são extremamente dependente de células de alta qualidade isolados de rato ou de outras espécies, seguido por microscopia de células vivas para analisar membranas tatuagens intactas. Como apontado anteriormente, caracterização de membranas tatuagens é uma área de pesquisa desafiador, com uma propensão para a fixação e preparação de artefatos 6, alterações da membrana devido a alterações osmóticas, e as limitações de resolução de microscopia de luz convencional 9. Notamos que os recentes protocolos de state-of-the-art para isolamento de AMs humanos para Ca2 + imagem e patch-clamp e de rato VMs para cultura de células foram previamente publicados nesta revista 25,26.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram analisados ​​e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do Centro Médico da Universidade de Goettingen animal Institucional em conformidade com o cuidado humano e uso de animais de laboratório.

1. Isolamento de atriais e ventriculares miócitos do coração mouse

  1. Lidar com os animais o mais suavemente possível e de acordo com protocolos aprovados para minimizar o estresse em geral e, especificamente, para evitar potenciais efeitos involuntários poderosos de excessos neuro-hormonais em células cardíacas isoladas. Além disso, injectar cada rato com heparina (500 IU / kg de peso corporal, sc), pelo menos, 20 minutos antes da extracção do coração para evitar a coagulação do sangue e micro êmbolos que podem comprometer significativamente o rendimento e integridade das células cardíacas durante o isolamento.
  2. Anestesiar ratos com 12 semanas ou mais velhos por inalação de isoflurano, confirmar a ausência de reflexos de retirada da dor, e os animais a eutanásia por deslocamento cervical.
    1. Extraia o coração rapidamente seguindo protocolos de especialistas previamente estabelecidos (por exemplo, ver Kaestner et al. 26 e Louch et al. 27). Evitar qualquer dano acidental para os átrios por compressão desnecessária ou alongamento.
    2. Cuidadosamente preservar o tecido da aorta ascendente proximal usando um par de fórceps e tesouras coto rectas para estabelecer um bordo de corte transversal contínuo, através da parede do vaso da aorta, que é importante para o sucesso e a canulação de perfusão do coração.
  3. Transferir o coração retirado imediatamente em gelo frio nominalmente Ca2 + livre tampão de perfusão (para soluções ver Tabela 1). Mantenha os grandes vasos apertados durante a transferência através do ar em buffer para evitar embolia aérea inadvertida até que o coração está totalmente submerso. Use BDM nas soluções tampão e com gelo para inibir a contracção cardíaca.
  4. Use um microscópio binocular com zoom suficiente illum 3Dinação.
    1. Canular da aorta sob stereovision panorâmica do coração com uma superfície lisa e polida 21 G cânula (diâmetro externo 0,81 milímetros, pois o peso do coração do rato normal), que deve ser completamente cheio com buffer. Certifique-se de que não há bolhas de ar na cânula, ligando uma solução reservatório proximal (por exemplo, uma seringa) através de uma válvula Luer 2 vias permitindo o controle de fluxo de solução rápida.
    2. Confirme sob ampliação binocular que a cânula está posicionada corretamente no interior da aorta, que é de aproximadamente 1 mm acima da valva aórtica e ramos da artéria coronária. Absolutamente evitar qualquer passagem ou perfuração inadvertida das valvas aórtica com a cânula (isso vai perturbar permanentemente fechamento da válvula aórtica e, conseqüentemente, interromper a perfusão cardíaca).
  5. Amarre a aorta suavemente para ranhuras anti-derrapantes feitos sob medida, orientada circunferencialmente perto do final da cânula usando duas suturas de seda. Não descarregar o arteri coronáriaes com força em qualquer ponto. Ligue a solução cheia cânula ligada à aorta eo coração a um conector de saída firmemente própria de um sistema de perfusão personalizado e pré-calibrado, também conhecido como a configuração Langendorff modificado (ou usando uma pressão constante ou fluxo constante, ver também seção de discussão abaixo).
  6. Perfundir o coração tão rapidamente quanto possível durante 4 min utilizando tampão de perfusão oxigenado a 37 ° C (taxa de perfusão de destino: 4 ml / min). Iniciar a digestão por interrupção da perfusão de colagenase contendo tampão de digestão (600 U / mL de colagenase tipo II) por 8-10 minutos a 37 ° C. Monitorar o progresso da digestão do tecido, confirmando as alterações teciduais semelhantes, incluindo aumento da opacidade, suavidade e flacidez em toda a superfície do coração aparente.
  7. Dissecar as câmaras cardíacas como após digestão necessário. Coloque o coração canulada sob um microscópio binocular e visualizar a parede posterior do coração. Dissecar residual, por exemplo um tecido não cardíaco, pulmonar umnd partes dos vasos para evitar a contaminação de células no buffer de digestão utilizando tesoura micro (por exemplo, tesoura primavera com 8 mm de lâminas em linha reta), como mostrado na Figura 1.
  8. Siga a lista de verificação que especial as câmaras, regiões e / ou células da colagenase digerido coração deve ser colhida (Figura 1): à esquerda e / ou átrio direito, livre de esquerda e / ou na parede do ventrículo direito e / ou o septo ventricular.
    1. Para dissecção dos tecidos cardíacos específicos, use um banho de dissecção relativamente largo e plano revestido com um várias mm espessa camada de elastômero de silicone plástico. Corrigir o vértice do coração com um pino de aço fino de insectos para a camada de elastómero de base.
    2. Desviar a aurícula direita e dissecar o átrio direito logo acima das válvulas atrioventriculares. Continue a dissecção com o átrio esquerdo. Dissecar e descartar o aparelho valvar fibroso. Finalmente, dissecar as paredes do ventrículo esquerdo e direito livre e do septo e / ou pequenoer as partes de tecido, conforme necessário.
    3. Nota apenas para trainees: para ganhar prática, comece com corações não-digeridos do mouse. Para facilitar a orientação anatômica, praticar a manipulação de tecidos, incluindo todas as etapas de dissecção consecutivos sob visão binocular, como mostrado na Figura 1. Uma vez que a anatomia 3D, movimentação manual sob visão binocular, e as etapas de dissecação estão suficientemente familiarizados, continue com os corações do rato colagenase digerido como descrito acima.
  9. Para miócitos ventricular (VM) de isolamento de células: transferir o tecido ventricular em 2,5 ml de tampão de digestão fresco. Se isolamentos celulares simultâneos de várias partes de órgãos, por exemplo, átrios e ventrículos é tentada, uma segunda pessoa pode demorar mais de uma perna do processo de dissociação de células, tanto para reduzir e otimizar o uso de ratos através da manipulação coordenada de vários tecidos cardíacos. Continue com os passos 1.9.1-1.9.4, a partir daí 1.10.
    1. Dissecar quer o tecido ventricular inteiroou partes específicas do mesmo (por exemplo, VE, VD, paredes livres, e / ou septo) em cerca de um milímetro em 3 partes de 2,5 ml de tampão de digestão, utilizando uma tesoura afiada (por exemplo, uma tesoura de mola com 8 mm de lâminas retas) em uma placa de Petri de 60 milímetros .
    2. Suavemente dissociar VMs em suspensão de células por trituração lenta dos pedaços de tecido com uma pipeta. Evite qualquer borbulhamento em suspensão de células.
    3. Adicionar 8 mL de tampão de paragem para a suspensão de células de VM e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml. Permitir que os pedaços de tecido restantes para se depositam no fundo por cerca de 15 segundos, mas curto o suficiente para células isoladas de permanecer em suspensão. Em seguida, recolher o VM suspensão através de transferência do volume de sobrenadante para um novo tubo de 15 ml. Se as peças de tecido em excesso estão presentes, em alternativa, usar uma malha de nylon de 200 um minimamente espaçadas para separar os pedaços de tecido a partir da suspensão de células.
    4. Deixe que a suspensão de células MV assentar no fundo de um 15 ml de cotubo nical por gravidade para 8 min.
    5. Lavar passo: remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento VM restante em 10 ml de tampão de perfusão. Repetir o passo de lavagem 1.9.5 (opcional: adicionar passos de lavagem adicionais para aumentar gradualmente a concentração de Ca2 +, conforme necessário).
    6. Ressuspender o sedimento em tampão de VM resolvido perfusão de 10 ml e distribuir o volume de suspensão de células remanescente em 1,5 mL de microtubos (cerca de 50.000 células por tubo) VM.
  10. Para atrial miócitos (AM) o isolamento de células: transferir o tecido atrial digerido / dissecado em 1 ml de tampão de digestão fresco.
    1. Cortar o tecido atrial parcialmente digerido em aproximadamente 1 mm3 peças em 1 ml de tampão de digestão com micro tesouras, uma pequena placa de Petri (por exemplo, 60 mm de diâmetro). Gentilmente dissociar células estou fora dos pedaços de tecido digeridos em suspensão de células usando trituração com uma pipeta de plástico de 1 ml com uma ponta de corte para evitar jatos de fluidos prejudiciais. Durantetrituração estritamente evitar qualquer borbulhamento de ar na suspensão de células. Após a agitação mecânica, adicionar 4 ml de tampão de paragem (50 uM de CaCl 2; BCS a 10%) para prender qualquer actividade de colagenase no restante suspensão de células.
    2. Transferência da suspensão de células em AM de um tubo cónico de 15 ml. Permitir que os pedaços de tecido restantes para se depositam no fundo por cerca de 15 segundos, mas curto o suficiente para que as células isoladas para permanecer em suspensão. Colheita do volume de sobrenadante contendo as células AM livres através de transferência de solução para um novo tubo de 15 ml.
    3. Centrifugar a suspensão de células AM, por exemplo, 2 min a 20 xg à temperatura ambiente ou - de preferência para os estudos de membrana - permitir que as células se estabelecer lentamente por gravidade para 20 min em um tubo de 15 ml.
    4. LAVAGEM: desprezar o sobrenadante e gentilmente colocar o agregado AM em 5 ml de tampão de perfusão. Repita 1.10.4.
    5. Ressuspender as células AM suavemente em tampão de perfusão de 5 ml. Distribuir o volume de suspensão de células em 1,5 mL de microcentrífuga de banheiraes (cerca de 1.000 células por tubo AM).
  11. Analisar e documentar o isolado qualidade população de células para cada coração, incluindo a produção de células utilizando a coloração azul de tripan.
    1. Para isso, diluir 500 uL da suspensão de células como 1: 1 vol / vol, com solução de azul de tripano (concentração final 0,02%), usando uma pipeta ml dicas corte. Misture as células eo azul de tripan suavemente por muito lento até pipetagem / baixo. Aplica-se imediatamente a suspensão contendo azul de tripano de células de um tipo de Neubauer melhorada citómetro e contar os miócitos intactas utilizando um microscópio invertido.
    2. Excluir quaisquer células com danos evidentes, vesículas membranares, estrias, com rupturas, contraturas, e as células que se acumulam azul tripano intracelular (Figura 2). Também excluem contrair espontaneamente células, que são suscetíveis a conseqüente morte celular. Para avaliar a contagem de células intactas em suspensão, utilize somente os miócitos cardíacos com estrias regulares que excluem azul de tripano em todoo volume da célula.
  12. Julgue a integridade dos miócitos atriais e ventriculares individuais por microscopia de luz transmitida. Salve a imagem de campo claro como um arquivo TIF para documentação e análise posterior.
    1. Utilize os seguintes critérios para a análise da integridade de células cardíacas:
      1. confirmar a presença de estrias regulares durante todo o volume da célula visível;
      2. confirmar a integridade da membrana contínua de superfície lateral em ambos os lados das células paralelas às miofilamentos;
      3. visualizar serrilhas afiadas nas discos intercalados de ambos os lados das células que refletem a integridade das estruturas de membrana de superfície específicos; e
      4. visualizar os sinais fluorescentes de membranas Tats (ou immunolabeled caveolin-3 proteína ou outros marcadores de membrana), conforme descrito na seção 3 para a correlação de localização ao lado do campo específico da célula brilhante imagem morfologia subjacente (por exemplo, combinar as duas imagens com ImageJ como imag composto sobreposiçãoe).
      5. Determine o comprimento do sarcômero a partir das imagens de campo claro. Para comprimento médio dos sarcômeros, medir a distância de sequencialmente alinhados estrias sarcômero, e divida a distância pelo número de sarcômeros. Medir pelo menos dois locais por célula. Realizar a análise com software comercial ou offline com ImageJ.
        NOTA: Se tratada com agentes de desacoplamento, intacta VMs relaxado do coração do rato mostram um comprimento de sarcômero média de ~ 1,9 mM 28.
  13. Quantificar a morfologia e as dimensões de miócitos atriais e ventriculares individuais a partir da imagem de microscopia de luz transmitida. Considere que as células AM e VM diferem significativamente de tamanho. Medir o comprimento da célula, a largura, e a área, e calcular a relação comprimento: largura.
    1. Analisar as dimensões celulares 2D a partir da imagem de luz transmitida em ImageJ usando a ferramenta de seleção comandos polígono e adicionar a gerente de ROI, análoga à Figura 3. Se morfológica cHanges são esperados dentro de contextos de estudo específicos, além de documento para todas as células da cepa específica do mouse, idade, sexo, tamanho do coração, e quaisquer intervenções para classificação de dados subseqüente.

2 Coloração de tatuagens Membranas em Viver atriais e ventriculares Miócitos

  1. Carregar a câmara de imagem (por exemplo, POC-R2) com uma lamela de vidro 42 mm. Para a fixação estável de miócitos para a lamela, preparar 20 ml de solução de laminina de diluição 1:10 do stock de laminina em tampão de perfusão fisiológico (concentração final de 0,2 mg / ml). Espalhe 20 ul da solução de laminina de maneira uniforme sobre a lamela de vidro.
  2. Preparar 800 ul de uma solução de di-8-ANEPPS 50 uM em tampão de perfusão. Para isso, diluir 20 ml de solução de di-8-ANEPPS 2 mM em 780 ul de tampão fisiológico.
  3. Para manchar VMs, permitir que as células se contentar por gravidade por 8 minutos em um tubo de 1,5 ml reação. Para manchar AMs, use sedimentação gravidade ou spna suspensão de células durante 2 min (consulte 1.10.3). Para tanto AMs e MV, remover o sobrenadante cuidadosamente, evitando a agitação desnecessária do sedimento de células e ressuspender cuidadosamente a pelete de células em 800 ul de di-8-ANEPPS solução contendo (50 uM). Transfira imediatamente o ANEPPS di-8 suspensão / miócitos na lamela revestido de laminina na câmara de imagem.
  4. Manchar a suspensão VM durante 15 min a RT no escuro.
  5. Lentamente, remover o excesso de volume através do menisco de fluido para cima nos lados da câmara de imagem com uma pipeta manual. Confirme que os miócitos a maioria dos di-8-ANEPPS manchadas permanece firmemente ligado à lamela revestido de laminina e não ficar exposto ao ar. Em seguida, lavar a suspensão de miócitos em anexo, uma vez por adição lenta de 1 ml de tampão de perfusão, seguido por remoção de qualquer excesso de líquido, incluindo as células não aderentes.
  6. Sobrepor cuidadosamente os miócitos e coradas superfície ligados com 1 ml de tampão de perfusão lentamente a partir do lado de tele imaginando câmara. Coloque a câmara de imagem no palco microscópio.

3 Imagem de Estruturas TATS Membrana em Viver atriais e ventriculares Miócitos

  1. Em geral, escolher com cuidado a melhor opção possível microscópio de fluorescência (s) disponível para imagens de membrana TATS. Para imagem confocal, considere geração recente, microscópios de fluorescência modernos com detectores de matriz PMT otimizados e vias de reciclagem de fótons que maximizam a intensidade do sinal fluorescente. Para imagem confocal de pequenos detalhes de TATS estruturas de membrana usar uma objetiva 63X óleo 1.4 NA ou - dependendo da disponibilidade - usar um microscópio de Super STED para pequenos detalhes como tatuagens revisada para aplicações específicas de miócitos por Kohl et al 34 para os princípios gerais de alta. microscopia de fluorescência resolução, consulte a seção de discussão.
  2. Defina os parâmetros de imagem para detectar a maioria, idealmente todos os mem intracelular di-8-ANEPPS manchadomembranas no interior de um dado plano de imagem de miócitos. Usar os seguintes parâmetros como ponto de partida para a microscopia confocal de varrimento laser: 458 nm de excitação, por exemplo, em 3% do máximo de potência do laser; detectar o sinal emitido entre 550 nm e 740 nm; ganho de detector (por exemplo, de comando mestre 800); e pinhole 1 UA para uma espessura de corte óptica de 900 nm. Ajustar estes parâmetros para optimizar a relação sinal-ruído.
  3. Use o modo de campo claro para selecionar uma AM intacto ou célula VM conforme o caso (Figuras 4A e 4B). Ver ponto 1.12 por critérios relevantes como julgar a integridade das células para selecionar células como resumido: estrias regulares em toda a célula e espaçamento igual sarcômero, arestas afiadas de superfície e serrilhas em todos os quatro lados celulares, integridade contínua da membrana superfície lateral e ausência de quaisquer bolhas de membrana.
  4. Pegue uma imagem de amostra de uma seção de miócitos intracelular central. Para ajustar o ROI usar a "colheita" função →; Ajustar a janela de colheita → o tamanho final do pixel mede 100 nm x 100 nm. Ajustar o eixo x da janela de colheita para corresponder com o maior (axial / longitudinal) do eixo do miócito.
  5. Escolha do plano de imagem final. Use quadros de imagem individuais para selecionar manualmente o plano de imagem adequada na direção z. Confirme se as membranas tatuagens, incluindo T-túbulos e componentes de um túbulo, são claramente visíveis no plano focal. Note-se que um avião típico imagem intracelular pode incluir um núcleo como ponto de referência intracelular. Consulte os exemplos nas Figuras 4A e 4B.
    NOTA: De um modo geral, a exposição de células a manter a luz laser tão curto quanto possível. Se possível, use quadros de imagem individuais para determinar o plano focal ideal em miócitos cardíacos.
  6. Ajuste o tempo de permanência de pixels a cerca de 0,5 ms. Selecione 16x média e grave a imagem como instantâneo. Repita o passo imagem instantânea para estabelecer a imagem apropriados avião ums delineada para estruturas de membrana tatuagens em 3,5, conforme necessário.
  7. Salve a imagem final e confirmar que o arquivo foi salvo na sua pasta de destino. Em geral, salvar todos os arquivos de imagem no mesmo formato (por exemplo, o LSM) para a aplicação uniforme do software de análise. Antes de qualquer análise de imagem, mais uma vez confirmar a integridade das células suficiente off-line (considerar critérios referidos no passo 1.12.1) e excluir todas as células danificadas da análise. Consulte os exemplos das Figuras 4C e 4D.

4 Análise da membrana de rede e seus componentes TATS

As seguintes etapas de processamento de imagem para análise direta de componentes da membrana tatuagens são resumidas como top-down diagrama de fluxo de trabalho nas Figuras 5A e 5B.

  1. Abra o arquivo de imagem de um dos miócitos manchado di-8-ANEPPS em Fiji (http://fiji.sc/), uma variante disponível gratuitamente de ImageJ que contém plugins essencial para a análiseprocessamento de imagem. Para mais informações por favor consulte o Schindelin et al 29.
  2. Salve a imagem → Arquivo → Salvar como → Tif.
  3. Para a análise dos componentes da membrana Tats, selecione o ROI adequado excluindo o sinal de superfície de membrana externa, em seguida, use a ferramenta "polígono de seleção" para delinear a fronteira ROI excluindo a superfície da membrana externa (sarcolema) e incluindo as porções intracelulares de membranas tatuagens, como mostrado na Figura 5A (ROI). Adicione o ROI selecionado para o "Gerenciador de ROI", aplicando Analisar → Ferramentas → ROI Manager.
    1. Para seleccionar um ROI específico para a análise de componentes de orientação Tats, alinhar o eixo principal longitudinal da célula e o eixo x da imagem em paralelo. Se a célula é ligeiramente curvo, selecione vários ROIs e alinhar cada ROI individualmente. Exclua todos os núcleos da análise. Excluir todas as células excessivamente curvas da análise porque o alinhamento preciso de RIOs vai se tornar cada vez mais difícil e aumentar os erros de orientação durante a análise.
  4. Exclua qualquer informação do sinal indesejado da superfície da membrana externa: Editar → Limpar Outside para gerar o "ROI selecionado" (Figura 5A). Certifique-se de que o ROI selecionada contém apenas as porções de membrana intracelular, que correspondem com a rede TATS.
  5. Realize a seguinte cadeia de etapas de processamento de imagem (comandos) antes da análise quantitativa posterior, conforme documentado na Figura 5A.
    1. Clique em → Processo → Background Subtrair. Defina o raio da esfera de rolamento para 5 pixels.
      NOTA: Defina o raio bola rolar para 5 pixels, se a imagem a ser analisado tem um tamanho de pixel de 100 nm x 100 nm. Para outros tamanhos de pixel definir o raio da esfera de rolamento para o número de pixels, que corresponde, aproximadamente, a um raio de 500 nm física.
    2. Clique em → Processo → melhorar o contraste local (ClahE). Defina o tamanho do bloco para 49, as barras do histograma a 256, a inclinação máxima para 3, ea máscara de "none".
    3. Clique em → Processo → Suave.
    4. Clique em → Plugins → Segmentação → região estatística Fusão. Defina os parâmetros de Q100 → clique em Mostrar Médias.
    5. Confirme processamento completo da região estatística Mesclando indicado pela apresentação automática de um novo quadro de imagem e confirmar que o rótulo "SRM Q = 100" é exibida. Continue as etapas a seguir com este arquivo de imagem. Clique em → Imagem → Tipo → 8-bit.
    6. Clique em → Imagem → Ajuste → Threshold. Escolha o limiar suficientemente baixo para detectar a maioria, idealmente, todos os Tats estruturas, em particular a exclusão de componentes, evitar tatuagens com uma baixa intensidade de sinal (use um limite de 40 como ponto de partida). Consulte a seção "Resultados representativos" para saída de dados detalhada e os exemplos na Figura 6(Limite superior de 255). Documentar a escolha final dos parâmetros de limites. Note-se que a escolha correta do limiar deve produzir estruturas de membrana TATS só específicas, mas não sinais falsos positivos devido ao ruído de fundo.
    7. Confirme correta sobreposição de tatuagens detalhes da imagem em função dos dados extraídos do esqueleto, em particular para os níveis de sinal de fluorescência média e alta, que deve coincidir com a (des) continuidade da estrutura de esqueleto. Uma vez que um limiar adequado foi identificado, aplicar esse mesmo limite a todas as imagens durante a análise e repetir a comparação sobreposição do sinal original em função dos dados de esqueleto para minimizar de forma consistente esta fonte potencial de viés.
    8. Clique sobre → Aplicar: os dados de imagem binária torna-se, como mostrado na Figura 5, em "Limiar".
    9. Clique em → Plugins → Skeleton → esqueletizar (2D / 3D). Salve a imagem em 2D skeletonized (como mostrado na Figura 5) como arquivo Tif porclicar em → Arquivo → Salvar como → Tif. Analisar o arquivo de imagem esqueletizada para a saída de dados quantitativos clicando → Plugins → Analisar Skeleton (2D / 3D). Escolha forma de ciclo Prune: nenhum. Confirme geração automática da tabela de dados resultante.
    10. Salve a tabela de dados gerada automaticamente como um arquivo txt. Selecione os parâmetros quantitativos relevantes, por exemplo, o número total de pontos de ramificação ou a duração média do ramo, como mostrado pelos dados de exemplares na Figura 7. Considere ainda a análise de dados com ferramentas de apoio complementares / software como o Excel e, conforme o caso.
  6. Considere usar rotinas automatizadas de processamento de imagem, sempre que possível, incluindo todos os passos necessários descritos no ponto 4.5 para harmonizar a análise entre as imagens individuais e / ou grupos da imagem. Use o exemplo de arquivo de código complementar que contenha uma macro de processamento de imagem programada para Fiji (ajustar a programação, se necessário).
  7. Analisar o emorientações dividual de todos os componentes de rede ou selecione TATS dos dados de imagem esqueletizadas pela Fiji plugin "direcionalidade". Gerar um histograma em que a respectiva direccionalidade Um túbulo orientado axialmente ou componentes T-túbulo orientadas transversalmente são representados pelas 0 ° ou 90 ° lixeiras. Note-se a referência correcta orientação de imagem e que é importante para o eixo x da imagem para corresponder intimamente com os principais longitudinais () 0 ° eixo da célula VM conforme mostrado na Figura 8, e resultados representativos.
    1. Clique em Analisar → → → Directionality especificar Método: componentes de Fourier, Nbins 180, Histograma começar -45 → clique na mesa Display.
    2. Salve a tabela de resultados recém-gerado e exibido, incluindo dados de histograma associados como arquivo txt. Considere uma análise mais aprofundada dos dados do arquivo txt por ferramentas de software complementares, como Excel e como necessário.
  8. Para gerar subclassesdados como conjuntos de dados agrupados por exemplo, para todas as células tratadas sob a mesma condição (e, potencialmente, outras condições), repetir a análise passos 4,1-4,7 para todas as imagens que se afigurem adequadas. Importe os parâmetros de dados esqueletizadas de todas as imagens em um arquivo combinado Excel a fim de obter valores médios. Além disso, importar todos os dados direcionalidade do histograma do mesmo conjunto de dados agrupados em um arquivo combinado Excel para calcular e gerar o histograma média direcionalidade. Considere ainda o processamento de conjuntos de dados agrupados para analisar parâmetros de rede TATS adicionais de interesse para diferentes grupos de tratamento individuais ou entre conforme necessário.

Representative Results

Além disso, para a análise de rede membrana TATS uma série de técnicas de biologia de células comumente usados ​​como intracelular de Ca2 + imagem, patch-clamp eletrofisiologia, ou estudos de dose-resposta farmacológica dependem criticamente de alta qualidade de isolamento de células primárias dos átrios ou ventrículos ou selecione Peças de tecido cardíaco para permitir a caracterização de miócitos cardíacos intactas diferenciadas, estruturalmente e fisiológicas maduros. Assim, a avaliação de isolamento e de qualidade para as células AM e VM descritos na seção 1 são, em última análise útil para muitas questões diferentes, incluindo a análise de rede TATS aqui descrito, que depende fundamentalmente da membrana intacta e integridade celular.

A Figura 1 apresenta um manual passo a passo de imagens como proceder com a dissecção do tecido cardíaco começando com as câmaras atriais em coração mouse. Subsequentemente, as câmaras ventriculares e o septo é preparado umd dissecado conforme necessário. Seleção precisa e preparação das peças de tecidos corretos é importante estabelecer de forma confiável AM e VM isolamentos com pureza de células suficientes. Após a digestão de colagenase pode ser relativamente difícil de identificar a linha de esvaziamento correcto entre a fibrilação ventricular e tecido, mas uma vez que as células de AM e VM são misturados em suspensão de células não controlado, é impossível reverter a população celular mista. Portanto, a orientação anatômica, a visualização do tecido 3D, experiência suficiente com a manipulação de tecido digerido, a correta identificação das peças de tecidos específicos e suas linhas de dissecação irá contribuir para o sucesso do isolamento de células.

Figura 1
Figura 1.Dissection de tecido atrial. (A) virado para a parte anterior do coração, dois s cirúrgicosutures fixar a aorta proximal até o fim toco de uma cânula 21 G aço. (B) Vista para a base do coração mostra restantes tecido pulmonar obstruindo a visão da câmara atrial durante a dissecção. LA, átrio esquerdo; RA, átrio direito. (C) Restante lungtissue e grandes vasos foram removidos para aceder às câmaras atriais. Cheio triângulo preto, artéria pulmonar; triângulo estriado, veias pulmonares; preenchido triângulo branco, veia cava superior; triângulo em caixa, veia cava inferior. (D) Em primeiro lugar, a parede do átrio direito é dissecado enquanto a pinça segure o apêndice atrial. (E) Ver na cavidade direita câmara atrial. O triângulo preto marca o septo interatrial íntegro. (F) A dissecção é continuou a entrar na cavidade da câmara atrial esquerda. (G) Após a dissecção completa dos átrios direito e esquerdo, as válvulas atrioventriculares se tornam visíveis. O aparelho valvar fibroso é dissecado e descartado para subsequently colher apenas o tecido do músculo ventricular. vista (H) Posterior dos átrios direito e esquerdo isoladas. LA, átrio esquerdo; RA, barras atrium.Scale direita: 700 uM.

Para determinar a qualidade de isolamento de células, a Figura 2 apresenta exemplos típicos de células durante a avaliação do rendimento e a viabilidade de haste ou em forma de tijolo miócitos intactas estriados típico, tanto para AMs e MV. Pouco danificado, visualmente imperceptíveis, bem como células gravemente danificadas com morfologias anormais excessivamente curvos, em forma esférica ou de células anormais, podem ser facilmente identificados, incluindo a exclusão de azul de tripano, tal como descrito na secção 1.11. Enquanto miócitos intactas permanecem brilhantes e homogeneamente estriado quando expostos a tripan extracelular azul, células danificadas normalmente apresentam múltiplas bolhas de membrana e / ou acumular rapidamente dano à membrana intracelular indicando azul tripano. Contudo, o azul de tripano por si só, pode danificar as células por meio de unnecessarily longa incubação e avaliação imediata da qualidade celular é, portanto, obrigatório. Exemplos de formas mais óbvias de danos celulares como contratura miofilamentos ou danos na superfície comprometer a integridade celular bruto são mostrados nas Figuras 4C e 4D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Trypan coloração de células de exclusão de azul. Isolado (A) e células SOU (B) VM são misturados em suspensão com azul de tripano e visualizadas em microscópio de luz invertida mostrado na 40Xmagnification. Nota thatabnormal células esféricas em (A) e (B), tendo-se azul de tripan, que indicatesmembrane leakage e danos estruturais. Em contraste, as células centralAM e VM com membranas intactas excluir azul de tripano como mostrado. Além disso, note que AM intacto e células VM apresentam estrias sarcômero em todo o seu volume celular, bolhas nomembrane e bordas afiadas nas duas faces laterais e os dois discos intercalares. Barras de escala: 20 ^ m.

Após rendimentos isolamento, celulares bem sucedidas de VMs a partir de 5 x 10 maio - 10 junho pode ser esperado de um único digestão coração mouse. O rendimento de MAs é significativamente inferior na ordem de 3 x 03-3 outubro 4 x 10 em forma de haste, com exclusão do azul de tripano de células. Em contraste com a VM, SOU isolamentos ocasionalmente falhar, mesmo em mãos experientes. Passo 1.11 resume os procedimentos como estimar o rendimento de células isoladas saudáveis ​​em suspensão. Adicionalmente, determinar as dimensões médias de célula através passo 1.13, como mostrado na Figura 3 para AM individuais ou isolados de células VM ou para comparar AM contra populações de células VM side-by-side (quando necessário). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3.Bright análise de campo de morfometria de miócitos cardíacos. Contorno A VM foi detectado pelas ferramentas de análise de imagem descritos no passo 1.13. Use a ferramenta de seleção polígono para marcar visualmente e definir a fronteira extracelular de células definido pela membrana superfície externa para análise. Anúncio da região selecionada de interesse (ROI) com o gerente de ROI seguido por medidas de distância 1D. Para os estudos comparativos de AM versus dimensões VM, é útil para documentar o comprimento da célula, a largura, e a área, e para calcular a relação comprimento: largura.

nt "> Para membranas fluorescente Tats mancha, quer em células de AM ou de VM, o corante de membrana integral di-8-ANEPPS é utilizado tal como descrito na secção 2, seguido por microscopia confocal, o que resultou nas imagens representativas de redes Tats mostrados nas Figuras 4A e 4B. Além disso, a Figura 4A mostra a correspondente imagem transmitida luz de um AM intacta lado-a-lado da imagem confocal com TATS (para aquisição de imagem ver secção 3). Conforme descrito por passo 1.12, a integridade da membrana e a superfície morfológica de vida miócitos é julgado por meio das imagens de luz transmitida. A região ampliada do sinal di-8-ANEPPS destaca a morfologia da rede subjacente TATS em AMs, caracterizado por axiais abundante (longitudinais) de membranas tubulares. Em contraste, a morfologia de TATS saudável VMs como mostrado na Figura 4B é caracterizada por números semelhantes de aproximadamente um axiald componentes transversais. Em contraste, as Figuras 4C e 4D mostram exemplos de miócitos cardíacos danificados que devem ser excluídos da análise posterior. Em particular, a célula de AM na Figura 4C é contraída, como evidenciado por um comprimento sarcómero anormalmente curto de 1,2 um e uma rede TATS irregular, ao passo que a célula distorcida VM na Figura 4D apresenta várias bolhas de membrana (cerca de destaque por triângulos vermelhos) indicando rupturas de membranas , que pode ocorrer na superfície externa da membrana, mas também nas membranas tatuagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Coloração da membrana Figura 4.Live de fibrilação ventricular e mio intactacitos. correspondentes transmitidos luz e imagens confocal de vida di-8-ANEPPS manchado intacto (A) AM e células (B) da VM. Em contraste, um PM parcialmente contraído e potencialmente danificados com um comprimento de 1,2 um sarcómero é mostrado em (C). Miócitos contratadas normalmente mostram anormalmente encurtados e estruturas Tats distorcidas, portanto, excluídos da análise posterior. Outro indicador importante para os defeitos da membrana celular são bolhas de membrana (triângulos vermelhos) como mostrado em uma máquina virtual em (D). Bolhas de membrana representam estruturas de membrana de superfície danificadas e células com bolhas devem ser excluídos da análise posterior TATS. Além disso, o VM mostra dano bruto aparentemente faltando uma parte inteira de sua porção inferior esquerda (marcado com asterisco). Em resumo, por meio da comparação da luz transmitida e imagens confocais, células de morfologia e intacto superfície é documentada e combinadas com a informação do sinal fluorescente. Marcas 'N' nuclei omitidos da análise da mancha da membrana TATS. Barras amarelas indicam ampliada ROIs da mesma imagem confocal apresentado acima. Barras de escala:. 10 m Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Imagens confocais de membranas Tats com uma relação sinal-para-ruído suficiente, como mostrado nas Figuras 4A e 4B são aceites para análise quantitativa. A análise da membrana TATS baseia-se em dados obtidos a partir de skeletonized os componentes de sinal rectilíneos fluorescentes. Figura 5 mostra o diagrama de fluxo dos passos de processamento de imagem, que são descritos em detalhe por passos 4,3 a 4,5. Estes passos produzir imagens que representam skeletonized TATS rectilíneas redes de membrana, como mostrado para cada isolado VM (Figura 5A) e AM células (Fifigura 5B).

Figura 5
Figura 5.Workflow para esqueletizações de imagens fluorescentes Tats. Etapas de processamento de imagem, que levam a uma imagem esqueletonizada da rede estão representados por TATS exemplos individuais passo-a-passo da imagem, tanto a um di-8-ANEPPS coradas VM (A) e AM (B). Para a etapa de processamento de imagem individual, por favor, consulte a secção 4. Nota diferenças na barra de escala:. 20Hm (A) e 10 um (B) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um passo crítico durante o processamento de imagem, determinar o limiar apropriado para binarização dados como descrito na seção 4.5.6. A imagem binária resultante deve incluir apenas sinais de membrana verdadeiros da rede TATS mas não falsas estruturas derivadas por thresholding errônea do barulho sinal de fundo. No entanto, é importante que o limite é baixo o suficiente para detectar todas as estruturas Tats verdadeiros componentes de tal modo que não são verdadeiros Tats erroneamente perdidos durante a análise de imagem. Figura 6 ilustra o processo como para seleccionar o limiar durante binarizao de dados. Enquanto um valor de 40, como mostrado nas Figuras 6B e 6C parece adequado para detectar todas as estruturas Tats verdadeiros individualmente, a escolha de um limite superior, por exemplo, de 60, como mostrado na Figura 6A não detecta mais fracas estruturas de membrana axial (ATS), tal como indicado por triângulos amarelos . Em contraste, a escolha de um limite inferior, por exemplo, de 20, como mostrado na Figura 6D conduz a detecção errónea de ruído de fundo estruturas tats como falsos-positivos, tal como indicado pelatriângulos amarelos.

Figura 6
Figura 6.How para determinar o limiar do sinal durante skeletonizing de dados de imagem Tats. Os exemplos mostram esqueletos Tats cada gerados para diferentes limites durante a binarizao de dados (descritos no passo 4.5). Imagens Superior: mostrar os ajustes de limite usando Fiji. Menores de imagens: sobreposição de imagens esqueletizadas a imagem de fluorescência de entrada correspondente com e regiões ampliadas, conforme indicado. Um exemplo de limiar elevado, 60 aplicado em (A) não é aparentemente adequado para detectar todas as estruturas Tats verdadeiros, tal como indicado por triângulos amarelas na secção ampliada. Um limiar de 40 aplicado em (B) e (C) detectar todas as estruturas e tats correctamente não detecta o ruído de fundo, enquanto que um baixo limiar eg., 20 em (D) erroneamente identifica o ruído de fundo como estruturas de tatuagens e, assim, produz sinais de falso-positivos de estruturas de membrana não-existentes. Sinais de falso-positivos são indicados por triângulos amarelos na inserção ampliada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O "Analisar Skeleton (2D / 3D)" plugin suporta a análise detalhada das estruturas Tats esqueletizadas. Uma vez executado, o plugin produz uma tabela de dados com os seguintes parâmetros: esqueleto #branches, #junctions, # ponto final de voxels, a duração média do ramo, pontos #triple, pontos #quadruple e comprimento máximo de ramo. Para uma descrição detalhada de todos os parâmetros de saída possíveis consulte tohttp: //fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton e artigos relacionados 29-31. Uma tabela típica de saída de dados é mostrado na Figura 7A.

Comprimento esqueleto total por ROI:

Σ (#branches x comprimento ramo média) = 5155 px = 515,5 uM

O comprimento total do esqueleto pode ser normalizada para a área da imagem. Para o exemplo mostrado na Figura 7, o comprimento normalizado de esqueleto 0.64μm / mM 2 e a soma de todas as junções são calculados como se mostra abaixo:

Normalizado comprimento esqueleto:

515,5 um / 803,6 mM 2 = 0,64 um / mM 2

Número normalizado de junções:

155 junções / 803,6 mM 2 2

Figura 7
Figura saída de dados a partir de imagens 7.Automated esqueletizadas. (A) uma folha de cálculo de dados típico gerado pela 'Analise esqueleto (2D / 3D)' de encaixe a partir da imagem esqueletonizada mostrado em (B). Para uma descrição detalhada de possíveis parâmetros de saída, consulte http://fiji.sc/wiki/index.php/AnalyzeSkeleton . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As etapas de processamento de imagem descritos em 4.5 e ilustrados na Figura 5 pode ser automatizada usando uma macro Fiji fornecida como ficheiro de código complementar 4.3 e 4.4. A macro pode ser vantajoso para a análise do conjunto de dados de grupos completos, por exemplo através da preparação de pilhas de imagens de entrada individuais para cada grupo de tratamento independente para análise automatizada usando os comandos de macro.

A estratégia delineada software permite ainda a análise de orientação rede TATS para todos os componentes. Para isso, use o "direcionalidade" plugin (http://fiji.sc/Directionality) 29,31 que produz dados de histograma mostrando a distribuição de orientação de todos os TATS orientações de componentes. Se o eixo x da imagem de entrada corresponde ao eixo principal de uma dada célula ou AM VM, axial (longitudinais) Tats componentes será representada por a 0 ° caixa, ao passo que os componentes transversais serão representados pela 90 &# 176; bin. figura 8 mostra direcionalidade exemplar histogramas de imagens Tats esqueletizadas para a VM (8A) contra um (8B) célula AM. Enquanto o histograma de uma direccionalidade VM típico mostra uma distribuição de pico duplo, a 0 ° e 90 °, o PM histograma mostra um único pico dominante a 0 °. Estes exemplos estão de acordo com observações anteriores de que os componentes individuais de tatuagens VMs são quase igualmente distribuídas pelos túbulos T e A-túbulos, enquanto que os componentes tatuagens em AMs podem ser predominantemente composto por uma túbulos.

Figura 8
Figura 8.Representative histograma direcionalidade das redes tatuagens de células individuais. Histogramas direcionalidade foram gerados a partir de imagens de VM esqueletizadas indivíduo (A) versus AM (B Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tampão de perfusão mM
NaCl 120,4
KCl 14.7
KH 2 PO 4 0,6
Na 2 HPO 4 0,6
MgSO4 1.2
HEPES 10
NaHCO3 4.6
Taurina 30
2,3-butanodiona-monoxime 10
Glicose 5.5
pH 7,4
Tampão de digestão mM (se não especificado)
NaCl 120,4
KCl 14.7
KH 2 PO 4 0,6
Na 2 HPO 4 0,6
MgSO4 1.2
HEPES 10
NaHCO3 4.6
Taurina 30
2,3-butanodiona-monoxime 10
Glicose 5.5
A colagenase do tipo II 600 U / ml
pH 7,4
Tampão de paragem mM (se não especificado)
NaCl 120,4
KCl 14.7
KH 2 PO 4 0,6
Na 2 HPO 4 0,6
MgSO4 1.2
HEPES 10
NaHCO3 4.6
Taurina 30
2,3-butanodiona-monoxime 10
Glicose 5.5
CaCl2 0,0125
de soro de vitelo 10%
pH 7,4

Tabela 1.Buffer solutiões. O conteúdo de três soluções tampão fisiológicas diferentes para o isolamento de células e de imagem encontram-se resumidos.

Discussion

Apesar de miócitos cardíacos foram isolados e estudados há décadas 32, uma revisão recente concluiu que de alta qualidade isolamentos miocélula consistentes continuam difíceis 27. Isso reflete protocolos relativamente complexas para isolamento de miócitos cardíacos primários vis-à-vis a falta de abordagens padrão comuns, metadados compartilhados, e documentação transparente qualidade celular. Protocolos de isolamento celular são geralmente personalizado por grupos individuais, produzir resultados variáveis ​​de células isoladas, dependem das definições do modelo individuais (por exemplo, espécie, idade, coexistem doenças do coração), e geralmente são ajustados para determinadas condições experimentais. Dentro do contexto da TATS quantitativa de membrana e protocolos de estudos aqui apresentados, um nível básico de avaliação da qualidade e documentação diz respeito a microscopia confocal ou SuperResolution de estruturas de membrana de células individuais propensas a metabólicas e alterações dependentes do protocolo de isolamento, tantoem AM ou VM. É importante ressaltar que, mesmo se altos rendimentos de isolados de células sugerem miócitos intactas saudáveis, os investigadores precisam documentar e criticamente julgar cada célula individual com cuidado em relação a critérios morfológicos da superfície e integridade da membrana TATS contra danos não específicos, devido a procedimentos de isolamento versus mudanças específicas devido a diferentes tipos de intervenções, em comparação com as condições de controle. Uma variável importante durante o isolamento de células cardíacas é a actividade específica de um determinado lote de colagenase. Para seleccionar um novo lote de colagenase, a actividade enzimática de colagenase várias amostras devem ser testados contra os outros por meio da avaliação de rendimento e qualidade dos miócitos cardíacos, e de acordo com as instruções do fabricante. Idealmente, um novo lote de colagenase é identificado com a atividade da colagenase semelhante aos lotes utilizados com sucesso anteriores (para a avaliação alargada de possíveis atividades enzimáticas referem-se a "ferramenta de seleção muito colagenase" na tabela de materiais e métodos). Taken juntos, abordagens quantitativas de visualização membrana TATS dependem criticamente da qualidade de isolamento de células e, vice-versa, isolamentos de células cardíacas que levam a danos na membrana inespecíficos como documentado por microscopia TATS deve provocar revisão crítica e correção dos procedimentos de isolamento. Como a qualidade do isolamento de células e visualização membrana TATS e quantificação estão intrinsecamente ligados, os protocolos mencionados neste artigo abrange todos os principais aspectos como estratégia contínua.

Um desafio adicional e emissão comum de estudos cardíacos, danos celulares e / ou perda de células ocorrer devido a intervenções metabolicamente comprometedoras por exemplo, após infarto do miocárdio 9, ainda precisa ser avaliada em função potencial dano acidental por exemplo, na sequência de embolia aérea despercebido durante o isolamento celular. Isolamento de miócitos cardíacos de corações doentes pode levar a, perda de células adicional significativo e diminuição da produtividade celulares. Portanto, comparison do número total de células intactas isoladas entre controle e corações doentes pode ser significativo se o isolamento de células e contagem são aplicadas de forma consistente através de protocolos padronizados. Em consequência, é crítico para julgar a integridade celular através de um grupo de controle apropriado, que reflecte o melhor possível o isolamento de células do miócito qualidade. É importante ressaltar que a qualidade cela individual e microscopia de células vivas de saudável relação doentia contra miócitos inadvertidamente danificado pelo processo de isolamento podem influenciar significativamente a análise das tatuagens redes de membrana. Os protocolos apresentados aqui, portanto, enfatizar a integridade e estabilidade de componentes da membrana fisiológicas durante o isolamento de células e microscopia de células vivas de membranas íntegras. Todo o fluxo de trabalho é concebido como uma estratégia contínua para alcançar e preservar componentes da membrana TATS intactas, excluindo as células danificadas, uma vez que estes apresentam isolamento artefatos de membrana dependentes como túbulos membranas rompidas, membrane bolhas, e as redes Tats alterados erroneamente sob condições de controle e comprometer a análise mais quantitativa. Vice-versa, as mesmas estratégias são fundamentais para estudos de intervenção com potencial para romper as membranas tatuagens, que dependem criticamente de controles comparação com sentido entre verdade saudável contra verdadeira célula doente com tatuagens alterações de membrana.

Além disso, abordamos os procedimentos para conseguir o isolamento tecnicamente muito mais difícil de células AM. Apesar do progresso e protocolos melhorados, é importante ressaltar que não é trivial para reproduzir isolamento de células de alta qualidade de VMs e ainda menos confiável para AMs. Isto é devido ao rendimento global mais baixo de células AM onde mesmo pequenos erros ou variações durante o isolamento das células pode levar à completa falha de isolamento AM celular, ao passo que um grau moderado de danos celulares VM pode ser menos aparente em suspensão de células, devido à relativamente elevada de células os números em comparação com AM. Como as células AM pode tornar-se curved após o isolamento, a análise através de vários ROI pode ser vantajosa, conforme descrito no passo 4.3. Seguindo um procedimento detalhado de medidas de isolamento de células, nós fornecemos um protocolo para a coloração direta integrante da membrana e confocal ou STED SuperResolution imagens das redes de tatuagens, tanto para VMs e AMs. Estes protocolos permitem tanto a análise quantitativa e diferenciação de selecionar componentes das membranas tatuagens através de parâmetros previamente estabelecidos. Em comparação com máquinas virtuais, a organização 3D e comportamentos funcionais da rede TATS fibrilação em MAs são actualmente menos compreendido.

Os procedimentos para membranas imagem tatuagens em células vivas (passos 3.1 a 3.7) foram desenvolvidos com confocal comercial (Tabela de Materiais / Equipamentos) e STED fluorescência microscópios feitos por 9. Para otimizar as configurações do microscópio para a geração de imagem fluorescente e análise TATS quantitativa, os seguintes pontos são de interesse geral:

  • Objetivo A fim de resolver pequenos detalhes de tatuagens estruturas de membrana, testar empiricamente que objetiva fornece a melhor qualidade de imagem enquanto se concentra vários micrômetro de profundidade na célula. Certos microscópios confocais podem ter um melhor desempenho com objectivos de água ou glicerol, em contraste com o objectivo de óleo 63X 1,4 NA usado aqui. Objetivos com aumento de 100X são utilizados para microscopia STED SuperResolution, trocando um campo de visão menor para resolução nanométrica 34.
  • Excitação e Ganho
    As configurações ideais da potência de excitação e ganho de detector depende do caminho da luz do microscópio, o desempenho do laser, e as propriedades da amostra. Idealmente, a potência do laser e ganho são ajustadas para explorar toda a gama do detector, ainda evitar a saturação de imagem. Pacotes de software de microscopia comerciais costumam fornecer tabelas de pesquisa que visualizam o limite inferior e superior do intervalo dinâmico. Além disso, para minimizar o corante branqueamento empregar o menor possível lpoder aser que ainda fornece suficientes estruturais detalhes membrana TATS. Além disso, a energia de excitação deve ser baixa o suficiente para evitar danos foto cumulativa levando a contraturas de miócitos e morte.
  • Tamanho do Pixel
    Usar um tamanho de pixel compatível com a amostragem de Nyquist, cerca de metade da resolução conseguida com as definições dadas. No caso da imagiologia confocal um tamanho de pixel de 100 nm x 100 nm é compatível, que também vai limitar o branqueamento. Para a microscopia de SuperResolution tamanhos de pixel significativamente menores são usadas, por exemplo, de 20 nm x 20 nm para a microscopia STED 9.
  • Dwell Time
    Microscópios confocais proporcionar uma função de média. Em geral, utilizar o menor tempo de permanência de pixel possível para evitar a descoloração em combinação com o sinal de média, por exemplo, ≥ 8 para melhorar a proporção sinal-ruído para-linha média.
  • Documente as configurações de Microscopia aplicada através de Meta-dados
    Uma vez que as configurações comodetalhes das estruturas de membrana tatuagens foram otimizadas em um microscópio confocal particular, seguro e / ou documentar as configurações (protocolo de meta-dados). Adquirir todas as imagens dentro de um grupo (ou entre) (s) de células com o mesmo objetivo, o poder de excitação, ganho, tamanho do pixel, pixel tempo de permanência e função média. Condições de imagem Igualdade de permitir a comparação direta e quantificação dentro de um grupo (ou entre) (s) de células.
  • Para orientação geral e mais detalhes sobre os princípios e aplicações de microscopia confocal consultar o Manual of Biological microscopia confocal (Pawley JB, 3 ª Edição, 2006, Springer Science + Business Media, LLC).

Em contraste com as estratégias de análise diretos aqui apresentados, publicações anteriores descrevendo membranas tatuagens e as mudanças relacionadas com a doença, têm usado leituras agregados regionais de densidade túbulo T como estratégia quantitativa 16,17, ou estratégias regionais indiretos com base em transf Fourieranálise ormação de sinais de membrana estriados, a fim de avaliar túbulo T componente regularidade 7. Em contraste, as abordagens quantitativas descritas aqui estão diretamente relacionados aos componentes tatuagens individuais e fornecer um número de parâmetros adicionais, incluindo propriedades de rede de membranas e componentes específicos, como a porcentagem de A-túbulos. Além disso, a densidade da rede TATS pode ser quantificada como o comprimento normalizado de todo o esqueleto, extraído por área da ROI. O número de junções triplas de três indivíduo, os componentes tubulares continuamente ligadas pode ser utilizada como uma medida da complexidade de ramificação da rede membrana TATS. Notamos que qualquer análise de menores componentes tatuagens depende dos procedimentos de coloração. Na nossa experiência, a 800 ul de uma solução de di-8-ANEPPS 50 uM é suficiente para manchar Tats redes completas num sedimento de células contendo células de VM 50000 9. No entanto, se o sedimento de células contém um menor número de miócitos cardíacos, Se detectores de fluorescência poderosos estão disponíveis, e se imagem confocal da distribuição global da rede TATS ao invés de pequenos detalhes de membrana e alterações quantitativas são de interesse, menores concentrações de corante pode ser utilizado com base em testes empíricos. Finalmente, um macro escrito para o programa de análise descrito pode ser utilizado para automatizar os passos de processamento de imagem para facilitar a análise dos conjuntos de dados grandes, o que é particularmente útil para a comparação entre os diferentes grupos de tratamento (por exemplo, drogas), os tipos de células (por exemplo, AM contra VM ), e intervenções fisiopatológicos (por exemplo, sham contra enfarte do miocárdio).

Para análise de imagens das redes tatuagens, a seguinte seqüência de passos principais é aplicado: 1) bola rolar background-subtração (4.5.1) para remover as variações espaciais na intensidade de fundo; 2) aumento de contraste local (4.5.2).; 3) a suavização de imagem (4.5.3); 4) região estatística fusão (4.5.4); 5), que define olimiar da imagem binarização (4.5.6); e 6) cálculo dos dados de esqueleto (4.5.8). Um passo crítico durante esqueletizações de imagens fluorescentes Tats é a binarizao imagem mostrada na Figura 6. Os passos de limiar associados por definir quais as estruturas de membrana verdadeiros são detectados para representar os componentes subjacentes Tats contra falsos potencialmente estruturas identificadas por erro do ruído de fundo. Identificação do limiar correcta para análise de imagem binária que correspondem com os verdadeiros TATS estruturas de membrana, o que depende de uma (SNR) proporção suficientemente alta de sinal-para-ruído de cada para as abordagens de microscopia confocal e SuperResolution. Portanto, a qualidade de imagem suficiente deve ser estabelecido pela primeira vez e, posteriormente, conjugado com uma apreciação crítica de qualidade célula individual incluindo a documentação por imagens brilhantes de campo, conforme descrito. Opções alternativas para adaptar o protocolo de segmentação de imagem para um determinado produto e / ou Phys dados microscópioperguntas iological incluem deconvolution imagem e outros procedimentos de limiar como "Otsu" ou "Iso-dados" disponíveis como plug-ins ImageJ. Independentemente do procedimento de segmentação final, consideramos a comparação entre os dados extraídos e matérias por imagem sobreposta um passo de controle de qualidade obrigatório. Em resumo, a integridade morfológica e de membrana de miócitos isolados individuais, a coloração suficiente de membranas Tats intracelulares, a optimização de parâmetros para imagens de fluorescência, e controlo de sobreposição de dados extraídos do esqueleto, contribuirão todos para a qualidade das imagens fluorescentes e tats resultados quantitativos.

Se as espécies maiores do rato são utilizados para isolamento de células, os protocolos podem ser facilmente adaptadas de modo adequado. Para as espécies maiores próximos, corações de rato pode ser canulado com uma cânula romba 14 L (diâmetro externo 2,1 mm) e perfundidos a 8 ml / min. Significativamente corações mais velhos ou doentes podem necessitar de tamanhos de cânulas ainda maiores. No general, a perfusão cardíaca, pode ser efectuada por exemplo, pressão constante, utilizando uma coluna de água de alta 1 m entre o reservatório e da aorta ou por fluxo constante utilizando uma bomba peristáltica. Para o isolamento de células dos corações pequenos roedores, como ratos e camundongos fluxo constante pode ser vantajosa, porque a digestão da colagenase acabará por perturbar vasos de resistência coronárias levando a taxas de perfusão excessivas vazem camas navios que serão controlados por algum grau de protocolos de fluxo constante. Em contraste, a perfusão de pressão constante é vantajoso se o monitoramento da vazão e punção correta são uma prioridade, o que é vantajoso para os modelos de intervenção com sangue alterado comportamentos de resistência navio, bem como para o treinamento dos procedimentos de isolamento celular.

Como descrito acima, a qualidade de células suficiente é muito importante para os estudos quantitativos de sistemas de membranas endógenos. No entanto, durante a perfusão cardíaca e colagenase digestão inúmeros fatores podem critically afetar a qualidade do isolamento de células, que nunca deve ser subestimado durante a otimização de protocolo ou de resolução de problemas 27. Em particular, a actividade de um dado lote de colagenase deve ser determinado para o tecido específico de interesse, por exemplo, átrios ou ventrículos anteriores para a execução de estudos experimentais bona fide para estabelecer as condições de isolamento para ser mantida durante todo o período restante do estudo. Além disso, a qualidade da água, pH, temperatura, e optimização de limpeza da instalação de perfusão irá minimizar o risco de danos inadvertidos de contaminantes e de êmbolos, e de factores potencialmente adicionais têm de ser monitorizados para determinar as condições óptimas homeostáticos durante o isolamento das células. BDM (2,3-butanodiona-monoxime) um inibidor reversível da miosina ATPase pontes cruzadas é geralmente utilizada durante a dissecção de tecidos e digestão de sustentar o relaxamento do músculo cardíaco, o que aumenta o rendimento do isolamento de células. No entanto, os investigadores precisam to estar ciente de que BDM podem exercer atividade de fosfatases não específicas que levam a efeitos off-alvo, por exemplo, a inibição da Na + / Ca 2 + taxas correntes sob certas condições 33. Para algumas experiências, pode ser vantajoso substituir BDM por blebbistatin como solução cardioplégica, um inibidor com uma elevada afinidade para a miosina em concentrações micromolares, que é, no entanto, tóxicos e relativamente caros e podem ter outros efeitos fora do alvo. Descansando cardiomiócitos saudáveis ​​não devem apresentar qualquer contrações na ausência de estimulação elétrica e essas células devem ser excluídos da análise posterior. Por outro lado, a contracção e relaxamento dos miócitos cardíacos, em resposta à estimulação eléctrica em extracelulares concentrações fisiológicas de Ca2 + podem ser usadas para estabelecer o comportamento normal contráctil como uma medida adicional para avaliar a qualidade de funcionamento de células e / ou comportamento anormal na doença cardíaca versus controlo saudável células.

9 e 21 AM células, bem como para a análise quantitativa das redes de microtúbulos em miócitos cardíacos fixos (dados não mostrados). Estes e futuras aplicações dos protocolos podem abrir vias para uma variedade de questões experimentais, tais como a caracterização de membranas Tats em diferentes estádios de desenvolvimento ou a análise de proteína associada à membrana de organelos ou de estruturas que estão em contacto a rede TATS exercer altamente localizada, domínio específico de sinalização funções nas células AM e VM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and Enzymes
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich, Munich, Germany B0753
Bovine calf serum Thermo Scientific, Schwerte, Germany SH30073 Triple 0.1 µm sterile filtered.
CaCl2 Sigma-Aldrich, Munich, Germany 21115 Diluted 1:10 in MQ water to obtain 100 mM CaCl2 stock concentration.
Collagenase type II Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Germany on request Enzymatic activity depends on individual collagenase batches. Collagenase II and other enzyme activities (Caseinase, Clostripain, Tryptic) can be assessed in the "collagenase lot selection tool". Determine cell yield and quality individually for each new lot of collagenase.
Glucose Carl Roth, Karlsruhe, Germany HN06.1
Heparin Rotexmedica, Trittau, Germany PZN-03862340 Diluted in 0.9% NaCl and injected subcutaneuosly in abdominal skin.
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.4
Forene 100% (V/V) Abbott, Libertyville, IL, USA B506 Active agent: isoflurane, 250 ml. Use approximately 2 Vol% in air/oxygen dispenser instrument.
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.3
KH2PO4 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3904.2
Laminin (2 mg/ml) BD Biosciences, Heidelberg, Germany 354232 Lamination is described under step 2.1.
MgCl2·6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2
MgSO4·7H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8283.2
Na2HPO4·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.2
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany HN01.1
Taurin Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4721.2
Dyes
Di-8-ANEPPS Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Germany D-3167 Stock solution 2 mM in DMSO
Trypan blue Sigma-Aldrich, Munich, Germany T8154 Trypan blue is gently mixed 1:1 via tip-cut 1 ml plastic pipette with cell suspension prior to cell counting in Neubauer cytometer.
Langendorff Perfusion Setup
Circulation thermostat Lauda, Lauda-Königshofen, Germany Please refer to Louch et al. (JMCC 2011). Heat up thermostat und buffers in perfusion tubing to 37 °C 15 min prior to use.
Flexible silicone tubing Tygon for peristaltic pump VWR, Darmstadt, Germany 224-2252 Tubing needs to be changed regularly.
Flexible silicone tubing Tygon for thermostat VWR, Darmstadt, Germany 228-4340
Heating coil surroundung perfusion tubing Rettberg, Göttingen, Germany custom-made Heating coil and tubing needs to be cleaned thoroughly via MQ water after using. Do not use detergents. Glass components should be bathed regularly  in 10 mM NaOH overnight.
Peristaltic pump Ismatec, Wertheim, Germany ISM830
Three way stop cock Discofix C Luer Lock 10 cm Braun, Melsungen, Switzerland 16500C
Three way stop cock Discofix 3SC Braun, Melsungen, Switzerland 4095146
Instruments
42 mm glass coverslips Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany on request 0.13-0.16 mm thickness
Cannula 21 G Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA 304432 Cut to a length of ~5 mm, roughened with sandpaper.
Coverslips for Neubauer cytometer 24 x 24 mm Menzel Gläser via Thermo Scientific, Schwerte, Germany on request 0.38-0.42 mm thickness
Graefe forceps, 0.5 mm tips, slight curve Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11151-10
LSM 710 NLO Carl Zeiss, Jena, Germany 63X 1.4 NA oil objective
Neubauer improved cytometer Labor Optik, Friedrichsdorf, Germany 1100000 Counting procedure: Wipe cytometer and coverslip provided with the counting chamber with 70 % ethanol. Press coverslip gently on the counting chamber so that the two glass surfaces are in contact and Newton's rings can be observed. Subsequently, 10-20 µl cell suspension can be applied to the edge of the coverslip to be sucked into the void by capillary action. Count the intact vs. defect myocytes using the squares of the cytometer grid which reflects 100 nl. Repeat counting procedure on the second grid provided on the cytometer. Calculate the density of cells in your original cell suspension by taking account of any dilutions and counting shortcuts.
POC-R2 Imaging Chamber Pecon, Erbach, Germany Cell suspension volume: 800 µl; desired plating density: ~1,000 AM and ~10,000 VM
Spring scissors, 8 mm blades straight, blunt Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 15025-10
Student dumont #7 forceps, inox Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91197-00
Student iris scissors, curved, 11.5 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91461-11
Student iris scissors, straight, 11.5 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91460-11
Student surcigal scissors, straight, sharp, 12 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 91402-12
Tissue forceps, 1 x 2 teeth, slim, 10 cm Fine Science Tools, Heidelberg, Germany 11023-10

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References

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Análise da Membrana Tubular Networks em Cardiac Miócitos de átrios e ventrículos
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Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles. J. Vis. Exp. (92), e51823, doi:10.3791/51823 (2014).

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