Abstract
Há um grande aumento da conscientização sobre o impacto positivo do exercício na melhoria de vários estados de doença com base neurobiológica; estes incluem melhorar a função cognitiva e desempenho físico. Como resultado, há um aumento no número de estudos animais empregando exercício. Argumenta-se que um valor intrínseco do exercício forçado é que o investigador tem controle sobre os fatores que podem influenciar o impacto do exercício sobre os resultados comportamentais, nomeadamente exercer frequência, duração e intensidade do exercício regime. No entanto, o cumprimento em regimes de exercício forçado pode ser um problema, especialmente se potenciais fatores de confusão da contratação de pé-choque devem ser evitados. Também é importante considerar que, uma vez que a maioria das deficiências cognitivas e locomotoras greve no indivíduo idoso, determinar o impacto do exercício sobre essas dificuldades devem considerar o uso de roedores idade com um nível mais alto possível de conformidade para garantir a mínima necessidade de teste de subjects. Aqui, as medidas pertinentes e as considerações necessárias para atingir quase 100% de adesão à esteira de exercícios em um modelo de roedor idade serão apresentados e discutidos. Não obstante o regime especial de exercícios sendo empregadas pelo investigador, o nosso protocolo deve ser de utilidade para os investigadores que estão particularmente interessados no impacto potencial de exercício forçado sobre as deficiências relacionadas com o envelhecimento, incluindo a relacionada com o envelhecimento Parkinsonismo e doença de Parkinson.
Introduction
Estratégias de estilo de vida não-invasivos que podem prevenir ou mitigar prejuízos à cognição e locomoção, tanto frequentemente associada ao envelhecimento, estão ganhando força como práticas viáveis para a manutenção da saúde e bem-estar 1,2. Por exemplo, moderada a exercícios rigorosos em uma base semanal e consistente em homens de meia-idade pode aumentar significativamente a capacidade de locomoção em comparação com seus pares mesma faixa etária com o avançar da idade 3. Além disso, cada vez mais evidências sugerem que estas estratégias de estilo de vida, tais como exercício, pode atenuar ou mesmo as perdas associadas com as doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Parkinson (DP) 4 inverter.
Os esforços para entender os mecanismos moleculares de deficiências relacionadas com o envelhecimento também foram direcionados para a identificação de como as estratégias não-invasivos, como o exercício, reverter ou atenuar os mecanismos que contribuem para tais deficiências. Ergométrico é um tal stratgia a ser cada vez mais empregues em modelos de DP de 5-7 e comprometimento cognitivo 1, em que os mecanismos subjacentes a melhorias na função cognitiva locomotora ou ainda estão a ser determinados. No entanto, é importante ressaltar que o envelhecimento é o fundo neurobiológico do PD. Assim, para qualquer tradução potencial de qualquer benefício do exercício em um modelo animal a ser realizado na condição humana, é necessário levar em consideração o fundo neurobiológico do envelhecimento. Por exemplo, os mecanismos compensatórios que protelar deficiência locomotora durante a progressão da PD poderia ser prejudicada pelo processo de envelhecimento 8. Assim, é lógico que os paradigmas do exercício deve ser desenvolvido que não só considerar o impacto do envelhecimento seja na presença ou ausência de patologia da doença, mas que também pode ser iniciado e mantido em roedores idosos.
Portanto, tendo em conta o envelhecimento no fundo neurobiológico, a seleção da cepa de ratodevem ser cuidadosamente consideradas pelo investigador. Várias linhagens de ratos estão disponíveis para estudos de envelhecimento, nomeadamente a Fischer 344 ea F 1 (BNF) híbrido Brown-Norway / Fischer 344. O rato Sprague Dawley utilizada (uma estirpe outbred) também é favorável para a sua utilização, como é vulgarmente utilizado em modelos de doenças neurodegenerativas, tais como o modelo de DP 6-hidroxidopamina. Nosso laboratório utiliza cepas tanto o Sprague Dawley ea BNF no envelhecimento e trabalho doença neurodegenerativa. Neste relatório, vamos apresentar os resultados, destacando os nossos protocolos de exercícios com as duas linhagens. Para os investigadores rigorosamente com foco em estudos relacionados com a idade, a tensão BNF oferece algumas vantagens importantes. Em primeiro lugar, é relativamente menos vulnerável a perturbações relacionadas com o envelhecimento (como tumores) e tem longevidade excepcional (vida típica superior a 30 meses) em comparação com outras linhagens. Eles também têm menor variabilidade de uma variedade de resultados fisiológicos e comportamentais, uma 9d são também adequados para investigar abordagens que interferem com o processo de envelhecimento. Além disso, experiências como o exercício forçado exigem manipulação considerável pelo investigador, eo suave disposição da estirpe BNF é vantajoso. Relacionadas com o envelhecimento alterações no conteúdo do tecido dopamina no estriado e mesencéfalo, bem como alterações na atividade locomotora são semelhantes em ratos e primatas 10-11 BNF. Nosso laboratório também tem uma vasta experiência com a caracterização e manipulação de estriado e sinalização de dopamina do mesencéfalo, bem como a atividade locomotora na cepa BNF 12-16. Portanto, porque o risco de outras doenças baseadas em neurobiologicamente aumenta com o envelhecimento, os modelos animais de doenças neurodegenerativas deve considerar o uso de linhagens de roedores com um extenso histórico de uso em estudos de envelhecimento.
Nosso protocolo aqui também aborda algumas questões críticas que o investigador deve ter em conta na interpretação dos seus resultados obtained a partir de um protocolo de exercício. O aparelho roedor esteira (cuja utilização vamos destacar neste relatório), normalmente é equipado com bobinas de choque elétrico na parte de trás de cada pista da esteira que pode ser desativado. No entanto, quando estas bobinas de choque elétrico são ativados, um pequeno choque nas patas é entregue ao sujeito como ele entra em contato com as bobinas. Esta estratégia é freqüentemente utilizado em estudos de exercícios para facilitar o cumprimento de esteira de exercícios. Este é um ponto crítico para a consideração, em especial para os pesquisadores envolvidos em estudos de comportamento que são influenciados pela dopamina ou norepinefrina-sinalização. Footshock elétrica é um fator de estresse fisiológico, e seu impacto sobre os sistemas neurotransmissores é bem documentado, com o aumento da ativação da tirosina hidroxilase 17-18. Assim, o aumento da biossíntese de qualquer neurotransmissor pode confundir a interpretação de qualquer efeito do exercício, fazendo com que o investigador responsável por interpretar se qualquervariação observada no comportamento após o exercício é estritamente devido ao regime de exercício ou estresse footshock. É importante ressaltar que o regime de exercícios forçados proposta não empregar o uso de footshock em qualquer ponto na aclimatação esteira ou exercer períodos de treinamento.
Regimes de exercício bem-sucedidas também exigir o cumprimento máximo para o exercício de cobaias. O emprego de choque no pé, a fim de garantir o cumprimento poderia confundir a interpretação dos resultados experimentais quando a medida dependente está relacionada com a sinalização de neurotransmissores que é influenciada por choque nas patas (como discutido anteriormente). Assim, o desafio é fazer com que os roedores, nomeadamente roedores idade, em conformidade com um regime de exercícios. A meta desejável de qualquer regime de exercícios é atingir quase 100% de adesão, pois isso irá reduzir o número de animais necessários para completar o regime de exercícios. Especificamente, o cumprimento máximo para o exercício e interpretação de resultados de regime de exercícios pode be obtidos em nosso regime de exercícios, como resultado de vários procedimentos pré-exercício, incluindo, 1) um ciclo claro-escuro reversa, que permite animais de exercer durante o seu) ciclo vigília (ativa, 2), garantindo linhas de base de desempenho locomotor são iguais antes da segregação de grupos controle e exercício, e 3) introduzindo os assuntos de teste para um período de aclimatação que, gradualmente, apresenta-los para as exigências do regime de exercícios. Aqui, as considerações e medidas experimentais supracitados necessárias para atingir quase 100% de adesão à esteira de exercícios em um roedor idade (> 18 meses de idade) serão avaliados e apresentados. Finalmente, o ambiente associada ao exercício pode ser estressante e, como tal, apresentam potencial confunde para determinar os efeitos fisiológicos específicos para o exercício. Nosso protocolo controla também para a exposição ao ambiente de indução de stress potencial do tapete rolante, incluindo o grupo sem exercício em todos os aspectos da fase de aclimatação (incluindo modest esteira rolante) e colocando-os na esteira estacionário durante o treinamento de exercício em esteira. Assim, este protocolo tem como objetivo descrever as medidas necessárias para determinar o impacto fisiológico do exercício.
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Protocol
Todos os seguintes procedimentos são realizados de acordo com o Cuidado e Uso Comissão de Animais Institucional na LSU em Ciências da Saúde Centro-Shreveport, e cumprir com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde.
1. Procedimentos Pré-exercício
Nota: Uma linha do tempo de todos os procedimentos relevantes neste exercício regime forçado é diagramado na Figura 1.
Figura 1 Forçado regime de exercícios timeline. Este cronograma detalha os eventos importantes de cada fase deste regime de exercício durante cada semana do estudo. A fase de pré-aclimatação (semanas 1-2) envolve manipulação experimentador e atividade locomotora basal. Durante a fase de aclimatação (3-4 semanas), todos os ratos submetidos a 3 dias de aclimatação formação waqui eles se sentam na esteira estacionária e depois 10 dias de treinamento de aclimatação para a esteira. Um mínimo de duas rodadas de exercício (1 volta = 12 dias consecutivos), seguido de um período de descanso de 2 semanas é necessária durante a fase de treinamento (semanas 5-10). As medidas comportamentais e / ou neuroquímicas podem ser feitas durante esses períodos de descanso. Além disso, este regime pode ser modificado para incluir múltiplos ciclos de exercício nesta fase. O peso corporal é medida ao longo de todas as fases do estudo em uma base semanal, e antes (primeira sessão) e depois (última sessão) cada fase deste regime de exercícios. Pontuações de treinamento físico em esteira são atribuídos após todas as sessões de aclimatação e treinamento físico, e variam de 1-4, sendo 4 com a maior pontuação possível. Resumidamente, uma pontuação de treinamento de 4 é atribuído quando os ratos exercer o treino inteiro sem assistência. Da mesma forma, atribuir uma pontuação de treinamento de 3 quando os ratos necessitam de assistência mínima (definida como: assistência para menos de 25% Do tempo da sessão de treino) do experimentador. Atribuir uma pontuação de formação 2, quando os ratos necessitam de muito apoio (definida como: assistência para maior do que 25% do tempo da sessão de treino) do experimentador durante a sessão de exercício. Finalmente, atribuir uma pontuação de treinamento de 1 a ratos que não adere e não terminar uma sessão de exercícios.
- Após a chegada à colônia animal, separada e individualmente abrigar todos os assuntos em gaiolas caixa de sapatos normais. Fornecer comida e água ad libitum a indivíduos ao longo de todo o estudo.
- Manter a 12 hr reverso ciclo claro-escuro (luzes acesas 1.800-0.600 hr) na colônia animal, e permitem que os voluntários se adapte a este ciclo por um período mínimo de uma semana. Executar todas as experiências comportamentais durante o ciclo activo (escuro) do sujeito, e 1-2 horas, antes da mudança do ciclo claro-escuro.
- Inicia-se duas semanas antes de quaisquer experimentos comportamentais, lidar com todos os assuntos de teste para vários minutes diariamente para familiarização do indivíduo com o experimentador, e para diminuir o estresse induzido pela novidade a ambientes estranhos, tais como a câmara locomotor ea esteira.
- Medida de cada sujeito de peso corporal, uma vez por semana e imediatamente antes (primeira sessão) e depois (a última sessão) cada intervalo maior do paradigma do exercício.
2. Base atividade locomotora avaliações: Determinação forçadas trabalhos de grupo Exercício
- Avaliar a actividade locomotora espontânea de cada sujeito, durante 60 minutos / dia durante 5 dias consecutivos para estabelecer capacidades locomotoras basais. Conduzir as sessões de actividade locomotora em câmaras de actividade locomotora em campo aberto automatizado consistindo de uma caixa de plexiglass (45 x 45 x 20 cm 3), com uma grelha de feixes infravermelhos montado horizontalmente e verticalmente, como sugerido no manual do produto.
- No início de cada dia da avaliação da atividade locomotora, carregar e configurar o computador e software programa ligado ao campo aberto câmaras de atividade locomotora, a fim de registrar o número de quebras de feixe (atividade locomotora) durante cada sessão.
- Adicionar cerca de 2 chávenas de cama pinheiro-chip para o chão da câmara locomotora antes de cada sessão.
- Transportar os temas oriundos do biotério para as câmaras de atividade locomotora em suas gaiolas imediatamente antes da sessão atividade locomotora. Carregar assuntos em seus câmara locomotor atribuído sob uma luz vermelha, e iniciar a sessão de 60 minutos no computador depois de terem sido colocados na câmara.
- Após a conclusão da sessão de actividade locomotora, remover matérias da câmara locomotora e devolvê-las para a sua gaiola de origem sob luz vermelha. Retornar imediatamente os assuntos para a colônia animal.
- Retirar da cama a partir da câmara e limpar as paredes da câmara e no chão com etanol a 50% depois de cada sessão.
- Repita os passos de 2,3-2,6 para sessões adicionais de locomoção cadadia conforme o necessário até que todos os indivíduos foram testados. Realizar todas as sessões de actividade locomotora no escuro, durante o ciclo activo do animal, e 1-2 horas, antes da mudança do ciclo claro-escuro.
- Para ter em conta a possibilidade de habituação às câmaras de actividade, rodar cada sujeito entre as câmaras disponíveis de modo a que a actividade locomotora é medida numa câmara diferente da do dia anterior.
- Se várias sessões devem ser realizadas em um dia, mudar a ordem de testar tal que os indivíduos são testados em uma ordem diferente da sessão anterior.
- A partir dos dados gerados pelo software usado para medir a atividade locomotora, determinar a atividade locomotora basal de cada animal com os seguintes cinco parâmetros locomotores: distância total percorrida (cm), atividade horizontal (número de quebras de feixe), número de movimento (número de movimentos iniciados) , o tempo gasto em movimento (seg), e a velocidade de movimento (cm / seg).
- De modo a atribuir Exercise grupos e sem exercício, calcular o valor médio em todos os cinco sessões para cada um dos parâmetros do aparelho locomotor 5 listados na etapa 2.9 acima.
- A partir destes cinco parâmetros, sem exercício determinar grupos (de controlo) de tal forma que um intervalo igual de actividade locomotora é representado em ambos os grupos e exercício. Deste modo, os ratos em conjunto emparelhar com base em capacidades de movimento semelhantes, e atribuir um rato para o grupo de exercício e um rato para o grupo sem exercício. Assim, por exemplo, emparelhar os dois ratos que exibem a maior média de todos os parâmetros de locomoção 5 em conjunto, e atribuir um rato para o grupo de exercício e o outro para o grupo sem exercício (atribuições de grupos são escolhidos aleatoriamente). Repita esse processo para as disciplinas restantes.
- Manter o emparelhamento durante todo o regime de exercícios forçados por todas as análises dos dados.
- Se o pesquisador está interessado nos efeitos do exercício sobre a atividade locomotora, medir pós-exercício de atividade locomotora ucantar os mesmos procedimentos descritos nos passos 2.1-2.8.1 começando no dia seguinte à sessão de exercício última escada rolante. NOTA: Se o investigador está interessado e / ou automatizados de software permitir a atividade locomotora, examinar as medidas relacionadas com a ansiedade (ou seja, o tempo gasto na periferia contra o centro da câmara de atividade) para avaliar a ansiedade relativa de assuntos durante as avaliações da atividade locomotora.
3. Aclimatação à escada rolante
- Realizar todos os procedimentos relacionados ao exercício em esteira em uma esteira motorizada roedor com pistas que são separados por paredes de plexiglas claras durante o ciclo ativo do animal, e 1-2 horas antes da mudança de ciclo claro-escuro.
- Em lugar das bobinas de choque eléctricos situados na parte de trás de cada pista, utilizar um anti-retorno de plexiglass concebida especificamente para se adaptar a esteira de modo que os sujeitos podem exercer continuamente, sem entrar em contacto com as bobinas de choque eléctrico. Para evitar que o recuo dedeslizamento durante as sessões de treinamento, segure o recuo no lugar com um 1,5 no c-clamp.
- Devido ao experimentador manipulação necessária para o treinamento de exercício em esteira, a realizar todas as sessões de exercício em esteira ergométrica com as luzes acesas.
- Temas de transporte em sua gaiola para a esteira imediatamente antes da sessão de treinamento físico em esteira. Quando a esteira é estacionária, os ratos de carga sobre a esteira em sua raia designada deslizando-se o recuo apenas o suficiente para que os sujeitos podem manobrar sob o recuo. Deslize o recuo de volta para a posição de descanso uma vez que o assunto está situado no cinto de esteira. Não inicie a sessão até que todos os assuntos foram colocados em sua raia designada para a sessão particular.
- Durante a primeira fase de aclimatação, cada rato em colocar uma das quatro faixas do tapete rolante estacionária (como descrito no passo 3.4) durante 5-10 minutos / dia durante 3 dias consecutivos. Aumente o tempo de cada sessão com cada d sucessivoay (por exemplo, 5 minutos a 1 dia, 7 min, no dia 2, e 10 min no dia 3), os ratos tornam-se familiarizado com o aparelho de esteira e a reduzir o potencial para a tensão da novidade ao aparelho rolante. Importante: Não coloque ratos em qualquer lugar na esteira (por exemplo, desativados bobinas de choque elétrico), exceto o cinto estacionária nesta fase.
- Durante a segunda fase de treinamento de aclimatação, coloque cada rato em uma pista de esteira parado em frente ao recuo. Quando todos os assuntos estão no lugar, ligue a esteira em uma velocidade de marcha lenta (por exemplo, 6 m / min). Independentemente do grupo experimental, treinar todos os ratos a caminhar na esteira ergométrica durante esta fase para assegurar que quaisquer potenciais efeitos observados a partir do regime de exercício forçado resultam do treinamento físico e não apenas a partir da capacidade de exercício.
- Como a correia da esteira começa a rolar, garantir que todos os ratos estão caminhando na direção de avanço. Assist ratos como necessários, orientando ou estimulando-as delicadamente até que eles estão se movendo para a frente. Durante o período de treinamento de aclimatação, treinar ratos para andar na esteira de tal forma que eles andam continuamente sobre a esteira sem a assistência do experimentador.
- Aclimatar todos os ratos para a escada rolante, aumentando gradualmente a velocidade ao longo de um período de 5-10 minutos / dia durante 10 dias consecutivos. Para facilitar ainda mais o cumprimento de esteira de exercícios, treinar os ratos em velocidades baixas (6-8 m / min) para 5-10 min durante os primeiros 5 sessões de aclimatação, e aumentar a velocidades mais moderadas (9-10 m / min) para 5 -10 min durante os últimos 5 sessões de aclimatação.
- Assegurar que todos os ratos podem manter uma velocidade de 9-10 m / min para 10 min pela última sessão do período de treinamento de aclimatação.
- Após a conclusão da sessão de aclimatação de esteira, remover matérias da esteira da mesma maneira que a utilizada para carregar sujeitos como descrito no passo 3.4. Retornar imediatamente assuntos a sua gaiola etransportá-los de volta para a colônia animal.
- Limpe cada pista individual, incluindo a paredes e esteira cinto com etanol 50% após cada sessão de treinamento físico em esteira individual.
- Avaliar a capacidade de exercício de cada rato através das sessões de exercício, atribuindo uma pontuação de exercício em esteira no final de cada sessão diária. Atribuir uma pontuação de treinamento de 4 quando os ratos exercer o treino inteiro sem assistência. Da mesma forma, atribuir uma pontuação de treinamento de 3 quando os ratos necessitam de assistência mínima (definida como: assistência para menos de 25% do tempo da sessão de treino) do experimentador. Atribuir uma pontuação de formação 2, quando os ratos necessitam de muito apoio (definida como: assistência para maior do que 25% do tempo da sessão de treino) do experimentador durante a sessão de exercício. Finalmente, atribuir uma pontuação de treinamento de 1 a ratos que não adere e não terminar uma sessão de exercícios.
NOTA: O sistema de pontuação do exercício é adaptado, Em parte, a partir de outros estudos 19.- Excluir ratos que não pode concluir a fase de aclimatação em razão de descumprimento e / ou uma lesão que impede de exercer temas (por exemplo, o que inclui ratos que ganham uma esteira pontuação treinamento físico de um para mais de um dia consecutivo de treinamento de aclimatação).
- Calcular a média dos escores de esteira através de cada período de formação (por exemplo, a formação de aclimatação e treinamento) para determinar a capacidade de exercício de cada sujeito. Certifique-se que todos os ratos são capazes obter uma pontuação de exercício em esteira de 4 durante uma sessão de treinamento até o final do período de aclimatação.
- Se alguns ratos não são compatíveis com as velocidades de exercício superiores mantidos por outros ao longo de uma sessão de treinamento, ajustar a velocidade para esses ratos de modo que eles são capazes de continuar a exercer para a mesma quantidade de tempo, mas em uma velocidade menor durante as sessões de treinamento. Neste caso, treinar os ratos mais lentos em separComeram sessões e aumentar a velocidade que os indivíduos para ajustar as velocidades mais lentas.
- Para evitar o potencial de pista viés na esteira durante o treino de exercício em esteira, girar cada rato entre as faixas disponíveis da esteira de modo que eles estão treinando em uma pista diferente com cada sessão de exercício subseqüente.
Treinamento 4 esteira de exercícios
- Comece as sessões de treinamento físico no dia seguinte à última sessão de treino de aclimatação, e continuar a exercer ratos durante 12 dias consecutivos. Realizar estas sessões durante o ciclo activo do animal, e 1-2 horas, antes da mudança do ciclo claro-escuro.
- Siga os mesmos procedimentos de configuração para cada sessão de treinamento físico em esteira utilizado durante o treinamento de aclimatação, conforme descrito nas etapas 3.2 e 3.4.
- No início de cada sessão, ligar a esteira a uma velocidade de aquecimento inferior (8 m / min) do que a velocidade de formação (9-11 m / min), que irá ser mantida atravHout o restante da sessão de treinamento físico. Continuar com esta velocidade de aquecimento durante 5-10 min, no início da sessão. Ajuste a velocidade de 9-11 m / min para o restante da sessão de treinamento. Treinar submete uma média de 30 minutos cada sessão para toda a 12 dias de treinamento físico.
- Após cada sessão de treinamento físico, atribuir uma pontuação de exercício em esteira para todos os ratos no grupo de exercícios que utilizam o mesmo sistema de exercício de pontuação descrito no passo 3.9. Não atribua uma pontuação de treinamento durante o período de treinamento físico em esteira em ratos sem exercício.
- Realize o exercício e as sessões sem exercício separadamente. Coloque os ratos sem exercício na esteira estacionário durante o mesmo tempo que a sua coorte exercício treinado durante cada sessão.
- Tal como descrito no passo 3.11, rodar cada um dos ratos entre as faixas disponíveis da esteira de modo a que eles estão na formação de uma pista diferente com cada sessão de exercício seguinte.
- Após a conclusão de uma rodada deexercício, indivíduos por 14 dias de descanso. NOTA: O período de repouso foi escolhida com base nos resultados de um estudo piloto descrito nas Figuras 2A e 2B.
- Se desejar, realizar várias avaliações comportamentais e / ou neuroquímicas no final do período de treinamento de 12 dias. Por outro lado, continuar com as rodadas subseqüentes do treinamento físico após o período de descanso de 14 dias.
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Representative Results
Um diagrama da linha do tempo de eventos em todas as três fases do regime de exercício forçado é mostrado na Figura 1. Além inversão do ciclo claro-escuro, diariamente manuseamento antes de qualquer ensaio experimental, e uma fase de formação de aclimatação, em que sujeitos sentar na esteira estacionária por 5-10 min / dia durante 3 dias consecutivos, foram implementadas para aumentar a adesão ao regime de exercícios forçados. Estes procedimentos foram adicionados ao protocolo, a fim de minimizar o estresse associado com novos ambientes, e para que indivíduos estariam mais inclinados a andar na esteira em movimento, se eles já estavam familiarizados com o aparelho parado. Estes procedimentos descritos na Figura 1 foram empregadas na sequência de um estudo piloto realizado em ratos BNF em que 50% dos indivíduos eram não aderentes a um regime de exercícios forçados anteriormente realizado em ratos Sprague Dawley. Neste regime de exercício forçado, de 18 meses de idade, os ratos Sprague Dawley foram ocobaias que foram submetidos a 30 minutos de exercício por 12 dias consecutivos, a velocidades de até 15 m / min (Figura 2). Estes resultados preliminares indicam que um ciclo de exercício (12 dias consecutivos), podem aumentar a atividade locomotora (Figura 2A), com a duração deste efeito do exercício na atividade locomotora duradoura para uma semana pós-exercício. Além disso, um efeito de ricochete de um aumento da actividade locomotora, em relação à linha de base inicial, observou-se seguindo o mesmo regime de exercícios 12 dias depois de um mês de inactividade (Figura 2B). Assim, no regime de exercícios forçados modificado detalhado neste protocolo, uma rodada de exercício forçado consiste em 12 dias consecutivos de exercício, seguido por um período de descanso de duas semanas. Os resultados apresentados na figura 2 sugerem que o regime de exercício forçado proposto pode aumentar a actividade locomotora em ratos que exercem em relação à sua respectiva actividade da linha de base.
Como discutido anteriormente, ~ 100% de adesão a este regime de exercício forçado pode ser obtida com a adição de vários procedimentos de esteira de aclimatação pré-esforço e. É importante ressaltar que as medidas tomadas para garantir o cumprimento neste regime de aumentar a sensibilidade da detecção de um efeito do exercício com o emprego deste regime de exercício forçado. Uma maneira de medir o efeito do exercício é através de medidas de peso corporal. Neste paradigma, os pesos corporais são medidos em uma base semanal, e antes (primeira sessão) e depois (última sessão) de cada fase do regime de exercícios. Tal como demonstrado na Tabela 1, os ratos tinham de exercício uma perda de peso média de 4,43 ± 0,32% em comparação com a sua pré-exercício de peso corporal. Comparatively, os ratos sem exercício tiveram uma perda de peso médio de 0,05 ± 0,55% em relação a sua pré-exercício de peso corporal. Assim, como esperado, existe uma diferença significativa na perda de peso total e a percentagem de mudança de peso corporal ao longo do regime de exercício forçado entre o exercício e ratos sem exercício (n = 7 por grupo, p <0,01, emparelhado, bicaudal t-teste). Da mesma forma, não foram observadas diferenças significativas na perda de peso e redução percentual do peso corporal durante round 1 (n = 7 por grupo, p <0,01, pareado bicaudal t-test) e round 2 do exercício forçado (n = 7 por grupo, p <0,05). Notavelmente, não houve diferenças significativas em cada parâmetro durante as fases de linha de base ou de aclimatação, o que indica que apenas os períodos de treinamento de exercícios forçados afetados peso do corpo. Este resultado indica que o regime de exercício tem um efeito fisiológico verificável em ratos no grupo de exercício, o que pode ser independente de outras variáveis que o investigador é medição. Dado que o peso corporal deesses assuntos variaram 378-572 g ao longo do estudo, uma diminuição de 4% do peso corporal não é considerada prejudicial ao bem-estar geral dos indivíduos, e também está dentro do alcance de nosso estudo piloto anterior regime de exercícios com ratos Sprague Dawley onde forçado uma diminuição de 6% no peso corporal foi observada em relação ao mesmo período de tempo. Finalmente, nota-se que não houve correlação significativa de peso corporal para a atividade locomotora foi observado em avaliações iniciais dos pesos individuais contra parâmetros atividade locomotora individuais listados na Figura 3.
Pontuações ergométrico são atribuídos após cada sessão de exercícios de aclimatação e esteira, e permitir que o experimentador para avaliar a capacidade de cada assunto que exercem em todo este esquema. Por exemplo, uma pontuação de esforço em tapete rolante 4 é indicativo do máximo conformidade com o regime de uma sessão particular, enquanto uma pontuação de esforço em tapete rolante 1 é indicativo de noncompliance ao regime para uma sessão particular. Assim, quando os critérios de conformidade são empregados neste regime, dezenas de exercícios em esteira deve refletir o cumprimento exercício que é demonstrado através da atribuição de pontuação de 3 ou 4 Durante o treinamento de aclimatação, exercício e ratos sem exercício são treinados para exercer na pontuação de exercício em esteira e escada rolante são atribuídas por ambos os grupos durante apenas esta fase. Por outro lado, os resultados de exercícios de esteira são apenas atribuídos a exercer ratos durante cada rodada de exercícios forçados. Os resultados dos escores de exercícios em esteira, tanto de aclimatação e treinamento físico em esteira são apresentados na Figura 4. Durante o treinamento de aclimatação, não há diferença significativa no escore médio de exercício em esteira entre o exercício e grupos sem exercício (n = 7 por grupo, p = 0,656, emparelhado de duas caudas teste t) conforme mostrado na Figura 4A. Isso indica que ambos os ratos exercício e sem exercício foram ambos compatível e capaz de se adaptar ao treexercício admill semelhante. 4B demonstra que ratos de exercício foram compatíveis com a esteira de exercícios por meio de duas rodadas de treinamento físico em esteira, como os escores médios de exercício em esteira não foi significativamente diferente entre os dois rounds (n = 7, p = 0,2336, pareado bicaudal t-teste). Assim, uma vez que eles foram aclimatados ao treinamento, os ratos exercício permaneceu compatível através de duas rodadas de exercício forçado. Finalmente, é importante notar que, dada a alta média dos escores de exercícios em esteira, tanto em treinamentos de aclimatação (combinado média pontuação exercício = 3,09) e treinamento físico (escore médio de exercício combinado = 3,80), o envolvimento investigador, em termos de assistência aos indivíduos do teste, durante as sessões de treinamento individual é mínima após as primeiras sessões de treinamento de aclimatação.
Figura 1 Forçado regime de exercícios timeline. Este cronograma detalha os eventos importantes de cada fase deste regime de exercício durante cada semana do estudo. A fase de pré-aclimatação (semanas 1-2) envolve manipulação experimentador e atividade locomotora basal. Durante a fase de aclimatação (semanas 3-4) todos os ratos submetidos a 3 dias de treinamento de aclimatação onde eles se sentam na esteira estacionária e depois de 10 dias de treinamento de aclimatação para a esteira. Um mínimo de duas rodadas de exercício (1 volta = 12 dias consecutivos), seguido por um período de descanso de duas semanas é necessária durante a fase de treinamento (semanas 5-10). As medidas comportamentais e / ou neuroquímicas podem ser feitas durante esses períodos de descanso. Além disso, este regime pode ser modificado para incluir múltiplos ciclos de exercício nesta fase. O peso corporal é medida ao longo de todas as fases do estudo em uma base semanal, e antes (primeira sessão) e depois (última sessão) cada fase deste regime de exercícios. Treadmill pontuação de treinamento físico são atribuídos depois de todas as sessões de aclimatação e treinamento físico, e variam de 1-4, sendo 4 com a maior pontuação possível. Resumidamente, uma pontuação de treinamento de 4 é atribuído quando os ratos exercer o treino inteiro sem assistência. Da mesma forma, atribuir uma pontuação de treinamento de 3 quando os ratos necessitam de assistência mínima (definida como: assistência para menos de 25% do tempo da sessão de treino) do experimentador. Atribuir uma pontuação de formação 2, quando os ratos necessitam de muito apoio (definida como: assistência para maior do que 25% do tempo da sessão de treino) do experimentador durante a sessão de exercício. Finalmente, atribuir uma pontuação de treinamento de 1 a ratos que não adere e não terminar uma sessão de exercícios.
Figura 2 estudo piloto sobre o impacto de 12 dias de paraexercício ced na actividade locomotora durante uma semana e o impacto do mesmo regime quando iniciado após um mês de inactividade. Dezoito meses de idade ratos Sprague Dawley foram submetidos à avaliação locomotora da linha de base durante o seu ciclo de inativos (período nonwake) sob iluminação ambiental nominal total em uma câmara de locomoção em campo aberto. A média diária de 5, 60 min sessões foi atingida para cada rato, e, em seguida, os ratos foram segregadas para o grupo sem exercício (NE) ou o grupo de exercício (E). Número movimento da linha de base (B) nos ratos do grupo sem exercício (NE-B) ou grupo de exercício (EB) não foi significativamente diferente. Após 12 dias consecutivos de exercício forçado (30 min / dia, 12-15 m / min), a atividade locomotora foi avaliada durante o seu ciclo ativo (esteira) (com as luzes se apagaram). Testar indivíduos durante o seu ciclo ativo desde um estímulo natural que induz movimento permitindo comparações contra as medidas de linha de base, em que a atividade locomotora é previsivelmente menos quando avaliar ed durante o ciclo de sono e com a iluminação do ambiente. Os ratos que exerceram (E-redonda 1) por 12 dias consecutivos exibiu 41% maior atividade locomotora em relação à sua base indivíduo original (n = 5 por grupo, p <0,01, t = 8,25, pareado bicaudal t-teste), enquanto ratos no grupo sem exercício (NE-redonda 1) exibiram atividade locomotora tendendo para um aumento, mas não significativamente diferente de sua linha de base (n = 5 por grupo, p = 0,11, t = 2,05, pareado bicaudal t-test). Após um mês de inatividade, os mesmos ratos foram submetidos a um segundo regime de exercícios idênticos e ratos no grupo de exercício (E-round 2) apresentaram um aumento de 61% na atividade locomotora em comparação com seus respectivos níveis de actividade de base individual originais (n = 4 por grupo , p <0,05, t = 5,34, emparelhado de duas caudas teste-t), em comparação com uma tendência não significativa para um aumento no grupo sem exercício (NE-redonda 2) (n = 4 por grupo, p = 0,13, t = 2,08 , pareado bicaudal t-test).
Figura 3 Comparação dos parâmetros de atividade locomotora basal em exercício e grupos sem exercício. Para estabelecer a atividade locomotora basal, 5 ensaios de locomoção (60 min / dia, 5 dias) foram realizadas no 18 meses de idade, os ratos machos BNF antes de exercício em esteira de aclimatação. Os valores médios dos cinco ensaios de locomoção foram determinados para todos os cinco parâmetros medidos locomotoras. Foram utilizados os meios de os parâmetros de locomoção para atribuir exercício e sem exercício (controlo) grupos tais que havia um intervalo igual de actividade locomotora representado em ambos os grupos. Os sujeitos foram pareados com base em valores médios semelhantes para todos os parâmetros de locomoção. Uma vez que os pares de grupos e receberam um teste t emparelhado de duas caudas foi realizado para cada um dos parâmetros de 5 para garantir que não houve diferenças significativas em l capacidades ocomotor entre os dois grupos. Em suma, um teste t pareado bicaudal não apresentaram diferenças significativas em (A) distância total percorrida (cm), (n = 8 por grupo, p = 0,7142, t = 0,3815), (B) atividade horizontal (número de quebras de feixe), (n = 8 por grupo, p = 0,7767, t = 0,2948), (C) número movimento, (# de movimentos iniciados), (n = 8 por grupo, p = 0,6186, t = 0,5207), ( D) tempo gasto em movimento (s), (n = 8 por grupo, p = 0,9307, t = 0,9011), e (E) a velocidade de movimento (cm / seg) (n = 8 por grupo, p = 0,655, t = 0,4569 ). Estes resultados garantiram que uma gama igual de capacidades locomotoras foi representado em ambos os grupos, e que tanto a capacidade como resposta ao exercício não foi baseada em diferenças na atividade locomotora entre os grupos antes da aclimatação treinamento.
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Figura dezenas de exercícios 4 esteira durante a aclimatação (A) e treinamento físico em esteira (B). Pontuação ergométrico são atribuídos após cada período de treinamento e aclimatação exercício em esteira, e servem como um indicador de conformidade durante cada sessão. As pontuações variam de 1-4, sendo 4 o mais elevado. A pontuação de 4 é atribuído quando os indivíduos exercer toda a sessão sem assistência. Dezenas de 3 e 2 são atribuídos quando os indivíduos exerçam com assistência mínima ou máxima do experimentador, respectivamente. Por fim, uma pontuação de 1 é atribuído a indivíduos que não terminarem a sessão de exercícios. Ambos exercício e ratos sem exercício passam por treinamento de aclimatação, e, assim, ambos os grupos de ratos são atribuídas pontuações de exercício em esteira durante a aclimatação. Como mostrado em (A), não há diferença significativa nos escores médios de exercício em esteira entre exercício e ratos sem exercício. Isto sugere que ambos os grupos de ratos foram capazes de AcClimate a esteira de exercícios da mesma forma, e, além disso, que os dois grupos eram compatíveis com a formação de aclimatação (n = 7 por grupo, p = 0,656, t = 2,270, pareado bicaudal teste t). Durante o treinamento de exercício em esteira, somente os ratos de exercício são atribuídas pontuações de exercício em esteira desde ratos sem exercício não faz exercício nesta fase. (B) demonstra que ratos de exercício foram capazes de manter a pontuação de exercício em esteira de 3-4 através de duas rodadas de treinamento físico. Da mesma forma, os escores médios de exercício em esteira não foi significativamente diferente entre os dois turnos de exercício (n = 7, p = 0,2336, t = 1,234, pareado bicaudal t-test) e foram compatíveis através de duas rodadas de exercício forçado.
| Sem exercício (n = 8) | Exercício (n = 7) | ||||||
| As medidas de peso corporal | Valor de p | ||||||
| Iniciar Peso corporal (g) | 457,10 ± 20,16 | 476,00 ± 26,85 | |||||
| Fim de peso corporal (g) | 450,80 ± 21,63 | 454,90 ± 25,55 | |||||
| Linha de Base | |||||||
| Perda de peso (g) | 5,69 ± 1,46 | 5,21 ± 2,35 | p = 0,982 | ||||
| A alteração percentual no peso corporal (%) | 1,35 ± 0,36 | 1,10 ± 0,51 | p = 0,811 | ||||
| Aclimatação-Phase 1 | |||||||
| Perda de peso (g) | 3,88 ± 0,56 | 3,93 ± 0,74 | p = 0,850 | ||||
| A alteração percentual no peso corporal (%) | 0,87 ± 0,16 | 0,83 ± 0,16 | p = 0,680 | ||||
| Aclimatação-Fase 2 | |||||||
| Perda de peso (g) | 5,81 ± 1,27 | 8,07 ± 2,39 | p = 0,486 | ||||
| A alteração percentual no peso corporal (%) | 1,29 ± 0,26 | 1,61 ± 0,47 | p = 0,744 | ||||
| Exercício Round 1 | |||||||
| Perda de peso (g) | 6,31 ± 1,00 ** | 13,50 ± 1,78 ** | p <0,01 | ||||
| A alteração percentual no peso corporal (%) | 1,45 ± 0,24 ** | 3,03 ± 0,47 ** | p <0,01 | ||||
| Exercício Round 2 | |||||||
| Perda de peso (g) | 0,5 ± 1,254 * | 11,29 ± 3,05 * | p <0,05 | ||||
| A alteração percentual no peso corporal (%) | 0,07 ± 0,30 * | 2,38 ± 0,63 * | p <0,05 | ||||
| Perda de peso global | </ Td> | ||||||
| Perda de peso (g) | 1,88 ± 2,63 ** | 21,14 ± 1,93 *** | p <0,01 | ||||
| A alteração percentual no peso corporal (%) | 0,05 ± 0,55 ** | 4,43 ± 0,32 ** | p <0,01 |
Tabela 1 medições de peso corporal durante o regime de exercícios forçados. Neste paradigma, os pesos corporais são medidos em uma base semanal e antes (primeira sessão) e depois (última sessão) de cada fase do regime de exercícios para fornecer uma medida dos efeitos fisiológicos deste exercício regime forçado. Os valores são representados como média ± SEM, e um teste t pareado bicaudal foi utilizado para analisar diferenças entre exercício e grupos sem exercício após cada fase do regime. No total, os ratos exercício teve uma perda média de peso de 21,14 ± 1,93 g e uma diminuição de 4,43 ± 0,32% do peso corporal. Comparativamente, os ratos sem exercício tem uma perda de peso média de 1,88 ± 2,63%, e uma diminuição de 0,05 ± 0,55% em peso corporal. Assim, existe uma diferença significativa na perda de peso total (n = 7 por grupo, p = 0,0016, t = 5,417, emparelhado de duas caudas t-teste) e diminuição da percentagem do peso do corpo (n = 7 por grupo, p = 0,0021 , t = 5,158, pareado bicaudal t-teste) ao longo deste exercício regime forçado entre exercício e ratos sem exercício. Diferenças significativas na perda de peso (n = 7 por grupo, p = 0,0036, t = 4,633, emparelhado bicaudal t-test) e diminuição da percentagem de peso corporal (n = 7 por grupo, p = 0,0037, t = 4,603, emparelhados bicaudal t-teste) foram observados durante todo 1. Resultados semelhantes foram observados durante o round 2 do exercício forçado em que houve diferença tão significativa na perda de peso (n = 7 por grupo, p = 0,0163, T = 3,305, pareado bicaudal t-test) e diminuição da percentagem de peso corporal (n = 7 por grupo, p = 0,0174, t = 3,255, pareado bicaudal t-test) entre exercício e grupos sem exercício. No entanto, não foram observadas diferenças significativas em ambos os parâmetros durante os períodos de referência ou de aclimatação, demonstrando que apenas os períodos de treinamento de exercícios forçados exercer efeitos fisiológicos sobre os ratos no grupo de exercício.
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Discussion
Há evidências que sugerem que as estratégias de estilo de vida, tais como o exercício, pode reduzir o risco de doenças relacionadas com a idade crônicas e seus sintomas cardinais, incluindo os das doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer e PD 20. O benefício do exercício forçado em uma esteira, ao contrário de exercício voluntário em uma roda de corrida, é que o investigador pode determinar a frequência, a taxa e / ou intensidade do exercício, e da duração da sessão de exercício. Assim, os efeitos pós-exercício específicos, tais como o aumento locomotor ou desempenho cognitivo, pode ser previsto ou esperado após a contratação de um determinado regime. Além disso, a tradução dos resultados de exercício em esteira forçado à condição humana é muito provável. De fato, estudos recentes em pacientes com DP demonstram que quando o paciente está em conformidade com um regime de exercícios estabelecido por um instrutor em uma bicicleta tandem, esses pacientes apresentam melhores escores de locomoção em comparispara pacientes com DP que apenas exercer em seu próprio ritmo 4.
A incidência de doenças neurodegenerativas, aumenta significativamente com o envelhecimento. Assim, a idade é um fator importante na concepção de estudos que visam traduzir qualquer resultado potenciais para a condição humana. Por exemplo, estudos que utilizam modelos adolescentes ou adultos animais para estudar a doença neurodegenerativa não levam em consideração que o envelhecimento é o fundo neurobiológico de tais doenças. Este potencialmente confunde a tradução dos efeitos observáveis clinicamente, porque o factor de idade fisiológica ainda não foi totalmente consideradas em tais estudos. Portanto, estudos examinando os efeitos do exercício em ambos os locomotor ou desempenho cognitivo, deve considerar o uso de modelos animais com idade desde deficiências cognitivas e motoras também estão associados com déficits relacionados ao envelhecimento nos índices neuroquímicas no 10,12,16 sistema nervoso central. Isso permitiria umacompreensão mais pertinente dos efeitos neurobiológicos do exercício sobre locomotora e função cognitiva do envelhecimento com ou na presença ou na ausência de patologia da doença.
Finalmente, a fim de verificar o impacto do exercício sozinho sobre as medidas pós-exercício em performance cognitiva ou motora, três práticas são essenciais para a obtenção de quase 100% de adesão a um regime de exercícios. Em primeiro lugar, é importante para manter um ciclo de luz-escuro reversa ao longo de todas as fases do regime de exercício forçado. Isso garante que os assuntos de teste estão treinando durante o seu ciclo (vigília) ativo. Em segundo lugar, é fundamental que as cobaias são lentamente aclimatadas para o ambiente esteira e os equipamentos utilizados para determinar a sua locomotor ou desempenho cognitivo. Aqui, o pesquisador deve seguir os procedimentos descritos na Figura 1 na linha do tempo recomendado. Por fim, o aparelho de choque nas patas elétrico nunca deve ser usado durante qualquer fase deste exercício regime forçado.Em vez disso, tal como salientado no protocolo, um recuo de acrílico pode ser utilizado para incentivar assuntos de continuar a exercer durante as sessões de exercício em esteira. Nesta conjuntura, o regime de exercício descrito deve ser considerado um ponto de partida para qualquer laboratório, com a expectativa de que a freqüência ea duração do regime de exercício pode variar de acordo com o paradigma do investigador. Os limites para a longevidade do presente regime de exercício forçado com certeza ainda tem que ser realizado, mas pode-se supor que, salvo lesão, as ratazanas compatível deve ser capaz de manter a adesão ao regime de exercício por um certo número de meses. No entanto, deve-se notar que a velocidade com que os assuntos de teste pode executar o exercício em esteira dentro de um determinado período de tempo (30 min neste regime) podem necessitar de ajuste e velocidades máximas não ultrapassaram os 15 m / min referidos estudos. O melhor atendimento é susceptível de ser realizado em velocidades que não excedam 11 m / min. Na verdade, se quisermos transtarde os resultados de exercícios para a população de meia-idade e envelhecimento, podemos esperar que o protocolo animal mais representativo é aquele que incide sobre a longevidade e compliance, ao invés de velocidade.
Para resumir, este protocolo de exercício forçado é aquele que pode ser utilizado em praticamente qualquer laboratório, especialmente para aqueles com foco em doenças neurodegenerativas e envelhecimento. Os indivíduos do teste utilizados neste relatório foram todos os 18 meses de idade no início do estudo. Além disso, os passos essenciais necessários para obter o cumprimento praticamente 100% nas cobaias também foram discutidos. Obviamente aquisição de 100% de conformidade é um benefício significativo para o investigador, principalmente porque só terá que usar o número de sujeitos necessários para testar uma hipótese dada na potência desejada. Além disso, a obtenção de 100% de cumprimento neste regime não exige o emprego de footshock elétrica. Na verdade, a eliminação de footshock elétrica é imprescindível, a fim de Interpret o impacto do exercício em medidas comportamentais que dependem de catecolaminas, especialmente a dopamina, dado o impacto há muito conhecida de estressores como footshook sobre catecolaminas biossíntese 17-18.
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Acknowledgments
O financiamento para este trabalho foi fornecido em parte por uma bolsa de investigação atribuído a MF Salvatore, do Instituto Nacional sobre Envelhecimento (AG040261). Os autores também gostariam de agradecer Victoria Fields por sua ajuda com os experimentos comportamentais associados com o trabalho apresentado e Mackenzie Orchard por sua ajuda com a construção do recuo para a esteira.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Exer-4 Treadmill for Rats | Columbus Instruments | 96157-2 | Columbus has a variety of treadmills for animals with varying numbers of lanes and other options such as metabolic measurements |
| Animal Activity Meter: Opto-Varimex 4-Auto Track | Columbus Instruments | 0170-R4 | Columbus has several options for activity chambers with varying arena sizes, beam spacing, and sensors |
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