Imagerie in vivo de Dauer spécifique neuronale Rénovation en C. elegans

Abstract

Les mécanismes qui contrôlent le stress induit par la plasticité phénotypique chez les animaux sont souvent complexes et difficiles à étudier in vivo. Un exemple classique de la plasticité induite par le stress est l'étape dauer de C. elegans. Dauers sont un stade de développement larvaire alternatif formé dans des conditions de faibles concentrations de produits alimentaires et de bactéries de fortes concentrations d'une phéromone de dauer. Dauers afficher vaste plasticité développementale et comportementale. Par exemple, un ensemble de quatre quadrants intérieure-labial (IL2Q) neurones subissent un remodelage réversibles lors de la formation de dauer. Utilisant l'entrée voies environnementales régulation dauer bien connu, une méthode précédemment établie pour la production de brut dauer phéromone de cultures de nématodes liquide à grande échelle est démontrée. Avec ce procédé, une concentration de 50 000 - 75 000 nématodes / ml de culture liquide est suffisante pour produire un brut très puissant dauer phéromone. La puissance de la phéromone brut est determined par un bio-essai dose-réponse. Enfin, les méthodes utilisées pour in vivo time-lapse imagerie des IL2Qs pendant la formation de dauer sont décrits.

Introduction

Plasticité phénotypique, y compris la plasticité développementale et comportementale, est important pour l'adaptation à des conditions environnementales défavorables et est considéré comme une force motrice dans l'évolution ^1. C. elegans est un organisme modèle fréquemment utilisé pour les études en matière de développement et de la neurobiologie. Dans des conditions idéales, C. elegans se développe à travers quatre stades larvaires avant d'entrer dans le stade de la reproduction des adultes. Cependant, dans des conditions de faible disponibilité de la nourriture et de fortes densités de population, C. elegans peut subir un commutateur de développement et entre dans une phase de longue durée et résistant au stress dauer ^2. Dauers présentent plusieurs différences morphologiques et comportementales des non-dauers qui interviennent probablement cette résistance au stress. Les signaux de l'environnement et des voies génétiques régulant l'entrée dauer ont été largement décrits ^{3, 4, 5, 6, 7.} Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant les changements phénotypiques individuelles qui se produisent; dformation dauer ors sont moins bien compris.

L'examen des phénotypes spécifiques Dauer nécessite la production d'animaux de Dauer. Ceci peut être réalisé de trois façons: 1) Choisir à partir d'une culture de faim de C. elegans, 2) Utilisation de formation dauer constitutive (daf-c) mutants, 3) l'induction de la formation de dauer par phéromone purifiée. Il est relativement simple à prendre dauers partir d'une plaque NGM standard avec un C. population elegans qui a épuisé son approvisionnement alimentaire bactérienne. Dans nos mains, une plaque NGM standard, initialement ensemencé avec 50 pi de OP50 Escherichia coli, a permis de croître pendant 3 jours, puis inoculés avec 3 - hermaphrodites 4 adultes maintenue à 25 ° C sera épuiser l'approvisionnement alimentaire dans la semaine et de produire plusieurs milliers de dauers dans 3 jours supplémentaires (en plus de nombreux non-dauers affamés). Cependant, ce procédé n'est pas satisfaisant pour les processus se produisant pendant l'examen mue en dAuer. Il est difficile de déterminer lequel de plusieurs milliers d'animaux sur une plaque affamés typique entrent dans dauer. En outre, l'utilisation d'une plaque de faim n'offre aucune possibilité de synchronisation. L'utilisation de mutants daf-c permet la synchronisation et la génération fiable de dauers. Cependant, il n'existe aucune garantie qu'une mutation daf-c particulier n'affectera pas les autres phénotypes spécifiques Dauer seul ou en combinaison avec d'autres mutations.

La présence d'une phéromone dauer a été impliqué par Cassada et Russell et a démontré plus tard par Golden et Riddle. La phéromone dauer a depuis été caractérisé chimiquement ^{2, 8, 9, 10.} L'phéromone purifiée est constitué d'un mélange complexe de ascarosides, qui sous différentes formes réguler les processus comportementaux et de développement ^{9, 11.} Utilisation d'un extrait de phéromone brut dauer permet induction fiable contrôlée de dauers synchronisés dans un fond de type sauvage. Le système nerveux et des cellules gliales associées subissent remodelage pendant dauer larve formation ^{12, 13, 14.} Certains de ces changements sont irréversibles, tels que la rénovation de cellules gliales au cours dauer ^{13, 14.} Cependant, d'autres événements de remodelage sont réversibles à un retour à favorable conditions environnementales. Par exemple, un ensemble de quatre neurones IL2Q neuronal subit un remodelage rapide et réversible lors de la formation de dauer comprenant: arborisation dendritique, un commutateur unique à partir de neurones à dendritique multidendritic remodelage axonal et ^12. Les présents procédés permettent l'imagerie in vivo fiable de la plasticité synaptique induite par le stress dans un organisme modèle. Les méthodes présentées pour la production et les essais de brut dauer phéromone sont décrits précédemment et compilées à partir de plusieurs sources ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. brut Dauer phéromone production

1. Cultivez OP50 E. coli à partir d'une seule colonie O / N à 37 ° C sous agitation dans 100 ml de bouillon LB, à 200 tpm. NOTE: Cette culture O / N peut être fait à l'avance et conservé à 4 ° C.
2. Cultivez N2 C. elegans à 15 au 20 juin cm boîtes de Pétri avec de la gélose NGM (voir la recette dans le tableau 1) ensemencé avec 50 ul de E. OP50 coli jusqu'à ce que les bactéries est presque épuisée ^19.
3. Assurez-5x 250 ml de S médias (voir la recette dans le tableau 1) dans 1 L Erlenmeyer ^19. NOTE: Cette solution peut être fait à l'avance.
4. Développer une culture de la OP50 E. coli dans 4 L de bouillon LB O / N par inoculation avec 1 ml de OP50 dans E. coli et agitation à 37 ° C pendant 16 heures.
5. Laver les nématodes à partir de plaques (étape 1.2) avec 1 ml de solution S de base (Voir la recette dans le tableau 1) et les nématodes de transfert 4-5 plaques dans chacune des 4 flacons 1 L Erlenmeyer avec les médias S préparés à l'étape 1.3 (4 5 plaquespour chaque flacon) ^19.
6. Centrifuger le OP50 de l'étape 1.4 à 650 g pendant 10 min et retirer le surnageant. Remettre en suspension chaque culot bactérien dans 10 ml de solution S basale. Transférer des quantités égales de bactéries remises en suspension à chaque flacon de nématodes.
7. Les flacons sont placés sur un agitateur orbital à température ambiante (20-25 ° C) et 100 à 150 tours par minute pendant 4-5 jours jusqu'à ce que la solution commence à se dégager, ce qui indique une diminution de l'alimentation.
8. Une fois que la nourriture est épuisée, développer une autre O / N culture de OP50 E. coli en 4x 1 L de bouillon LB. Centrifuger les bactéries à 650 xg pendant 10 min et ajouter une pastille d'un flacon de chacun des flacons de médias de S par les nématodes. Remettre les flacons de médias S à l'agitateur orbital, comme à l'étape 1.7, pour une période supplémentaire de 3 à 4 jours jusqu'à ce que la nourriture est épuisée encore une fois.
9. Il suffit de ~ 1 ml de solution aliquote de chaque fiole et estimer la concentration des nématodes par sous-échantillonnage 1 pl de chaque fraction aliquote de 1 ml et en comptant le nombre de nématodes. NOTE: L'population de nématodes devrait être 50.000 - 75.000 nématodes / ml. A cette concentration, la majorité des nématodes sont dauers.
10. Jeter les flacons contaminés. NOTE: La contamination se manifeste souvent que hyphes vu lors de l'étape 1.9.
11. Nématodes à centrifuger à 4000 g pendant 10 min à 4 ° C. Éliminer le culot de nématodes et conserver le surnageant. Sinon, voir la discussion sur l'utilisation de ces animaux pour faire une phéromone de faible puissance.
12. Filtrer le surnageant à travers ° 1 un papier filtre Whatman. REMARQUE: Une fiole à vide permettra d'accélérer ce processus.
13. Filtrer davantage le surnageant de 0,45 um vide stérile unités de filtration. REMARQUE: Le filtrat peut être conservé O / N à 4 ° C ou procéder à 1,14.
14. Ajouter le filtrat à un bécher de 2 L avec une barre d'agitation. Placez-les dans une hotte sur une plaque de chauffage d'agitation. Porter à ébullition en remuant et évaporer à environ 200 ml. Transférer la solution dans un bécher de 500 ml. Poursuivre l'ébullition jusqu'à environ 50 ml sont left. NOTE: Il faut faire attention lors de cette étape car il est possible pour la solution à déborder. La couleur des 50 derniers ml est un brun foncé. A tout moment pendant le processus de cuisson, la chaleur peut être désactivé et le filtrat stocké O / N à la température ambiante ou à 4 ° C.
15. Laisser refroidir et centrifuger pendant 5 min à 1000 x g. Verser le surnageant dans un bécher de 100 ml et jeter le culot.
16. Faire bouillir le surnageant jusqu'à une croûte brune. Retirer du feu et casser la croûte avec une spatule. Ajouter une quantité suffisante de l'éthanol 200 proof pour couvrir la croûte. Couvrir le bécher avec du parafilm et laisser reposer O / N à la température ambiante. Verser de l'éthanol dans un bécher propre et mettre sur le côté. Ajouter de l'éthanol frais pour couvrir la croûte. Répétez O / N extractions 3 fois. Réunir les extraits.
17. Utilisation d'une pompe à vide pour sécher les extraits éthanoliques. Si une pompe à vide n'est pas disponible, ajouter l'extrait à l'éthanol dans un bêcher propre et chauffée à 50 ° C sous agitation dans une hotte. REMARQUE: Une fois de l'éthanol s'est évaporé un résidu collant de lcouleur brun ight doit rester. Si le chauffage est utilisé, il faut prendre soin de ne pas brûler la solution par chauffage pendant trop longtemps.
18. Dissoudre résidu dans 10 ml d'eau distillée stérile. Stériliser par filtration de cette solution avec un filtre à seringue de 0,22 um et de conserver à -20 ° C en aliquots de 1 ml. NOTE: 1 ml d'eau est utilisé pour dissoudre le résidu par 100 ml de la culture de nématodes liquide d'origine. Par exemple, si l'un des flacons de culture liquide est rejetée en raison de la contamination, puis ajuster la quantité d'eau utilisée pour dissoudre le résidu.

2 Détermination de la réponse de la dose de phéromone

1. Préparez dauer phéromone en faisant 6x 5 ml de NGM médias avec de l'agar Noble, sans peptone, et additionné de 50 pg / sulfate de streptomycine ml et une gamme de dauer phéromone (voir la recette dans le tableau 1) ^{4, 19.} Mélanger les composants dans un 13x100 mm tube de culture en verre, faire bouillir sur un bec Bunsen, puis verser dans 3 cm des boîtes de Pétri.
2. Peser hTube icrocentrifuge. Ajouter 1 ml de O / N culture de E. coli OP50 sur le tube et centrifuger à 17 000 xg ~ dans un tube à centrifuger. Retirez tout le surnageant. Peser à nouveau le tube et déterminer le poids du culot bactérien. Reprendre le culot avec du tampon M9 (voir la recette dans le Tableau 1) pour une concentration finale de 4% ^(p / _v). Aliquote de 10 pl de la suspension bactérienne sur le centre de chaque plaque de phéromone ^4. plaques de magasin O / N à la température ambiante.
3. Choisissez 10-15 gravides N2 hermaphrodites de type sauvage un jour après la mue à l'âge adulte sur les plaques de phéromones ^4. Stocker les plaques à 25 ° C pour les 3 - 4 heures.
4. Ramassez tous les hermaphrodites adultes. Notez le nombre d'œufs pondus pour chaque plaque. Sceller les plaques avec du parafilm et retour à 25 ° C pendant 3 jours ^17.
5. Comptez le pourcentage de dauers (Figure 2). Remarque: Pour les deux méthodes, il est important de noter que dauers (et dans une moindre extente non-dauers) va grimper sur les murs et sur le couvercle de boîtes de Pétri. Il est donc important d'examiner toutes les surfaces de la vaisselle pour les nématodes.
6. Monter les données à une courbe dose-réponse et estimer la concentration de phéromone CE ₉₀ (phéromone suffisante pour induire 90% des animaux pour former dauers) comme le montre la figure 3. Remarque: On utilise typiquement un modèle de régression logistique pour évaluer la CE ₉₀ , mais différents logiciels statistiques peuvent avoir des méthodes alternatives qui produisent des estimations similaires.

3. imagerie en direct de Dauer IL2 neurones

1. Préparer les boîtes dauer de phéromones que dans le protocole 2 en utilisant la valeur CE ₉₀ déterminée dans l'étape 2.6.
2. Provoquer dauers en utilisant les méthodes dans le protocole 2 avec une souche portant une IL2 reporter transgène intégré (myIs13 [P _klp-6 :: gfp], myIs14 [P _klp-6 :: gfp], myIs16 [P klp-6 :: tdTomato] ou qIs56 [P _retard-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} REMARQUE: Si q Is56 est utilisée, l'expression de la GFP ne sera pas visible dans les IL2Qs jusqu'à plusieurs heures dans la mue dauer et certains des événements de remodelage initiaux ne seront pas visibles. En outre, alors que le signal de fluorescence de la _{P-lag 2} :: gfp transgène est finalement plus lumineux dans les IL2s pendant dauer que les P _KLP-6 rapporteurs fluorescents, le _{P-lag 2} :: transgène GFP exprime aussi faiblement dans les muscles de la tête qui peut masquer les branches de fines IL2.
3. Après la ponte, retirer les hermaphrodites adultes, sceller les plaques avec du parafilm et incuber pendant 34 h à 25 ° C ^17. REMARQUE: La longueur du temps de la mue dauer varie légèrement entre les individus. La période la plus rapide des dendrites arborisation commence 4 - 5 heures après le début de la mue dauer (39-44heures après la ponte à 25 ° C) ^12.
4. Le jour avant l'imagerie, de préparer une solution de 10% ^(p / _v) d'agarose dans du tampon M9 avec dauer phéromones à la concentration _CE90. Aliquote d'environ 100 pi de agarose sur une lame de microscope et rapidement, mais doucement, placer une autre diapositive sur le dessus pour créer une surface de la gélose plat. Après l'agarose solidifié, envelopper les lames dans une pellicule transparente et stocker dans une chambre humide (boîte de pointe de la pipette avec des serviettes en papier humide).
5. Après la période d'incubation de 34 h, examiner plaques de phéromones contre les nématodes qui ont cessé pharyngée pompage. Séparer les diapositives de telle sorte que seulement une surface de glissement présente une agarose sur elle. Choisir un ou plusieurs nématodes sur un bloc d'agarose à 10% et 1 μ l de 0,1 micron ²² billes de polystyrène. NOTE: Avec une population bien synchronisé, la majorité des nématodes sur la plaque va entrer dans la mue de L2d à dauer. Cependant, il peut y avoir des différences entre ies personnes. Il est donc important de noter fonctionnalités supplémentaires (stomie occlusion, du pharynx remodelage) pour estimer la quantité de temps que les animaux ont été dans la mue dauer (voir résultats représentatifs par exemple).
6. Déterminer l'orientation (gauche / droite, dorsale / ventrale) du nématode. Capturez des images Z-stack d'une dendrite IL2Q à 100x de grossissement avec la plus faible intensité de fluorescence possible toutes les 15 minutes ou selon les besoins de l'expérience spécifique. Continuer la capture d'images jusqu'à ce que le nématode a séparé de la cuticule L2d et l'immobilisation est impossible ou si l'animal se remet de dauer (pharynx commence pompage). Quand il n'est pas d'imagerie active, placer la lame dans une chambre humide. NOTE: Nous utilisons un microscope à épifluorescence avec un motorisé interférences stade et différencié contraste (DIC) de l'optique.

Representative Results

La production de brut résultats dauer de phéromones dans un liquide jaune (figure 1) qui est à la fois chaleur et froid stable. Des aliquotes de phéromone brut sont stockés à -20 ° C indéfiniment sans perte évidente de l'activité. Après la production de phéromone, une seule étude dose-réponse est suffisante pour une estimation approximative de la puissance. Cependant, pour la plupart des expériences, il est nécessaire de répéter l'essai biologique 2 - 3 fois et prendre une moyenne de chaque expérience. Des résultats représentatifs provenant de deux essais biologiques de phéromones sont donnés sur la figure 3. À partir de ces données et une EC ₅₀ EC ₉₀ peut être calculé.

En plus de la résistance à dodécylsulfate de sodium ^2, dauers peuvent être reconnus par plusieurs caractéristiques morphologiques, y compris une stomie occlus, ailes latérales, des corps réfringents dans l'hypoderme antérieures et un pharynx rétréci (figure 2 et figure 4A for L2 larves). Dauers ont également plusieurs caractéristiques comportementales distinctifs, notamment:. Une propension à rester comportemental de repos, la présence d'une stratégie de dispersion occasionnelle appelé nictation, la suppression de la tête de recherche de nourriture des mouvements, la suppression de pharyngée pompage et l'induction de canal excréteur impulsions ^{2, 5, 23} La caractéristiques comportementales montrent une variabilité entre les individus.

La mue en dauer prend environ 12 heures de la fin de la pré-dauer stade L2 (L2d) ^4. Cette période correspond à la croissance stéréotypée des tonnelles de IL2Q. Le premier événement notable de la mue en dauer est la suppression de pharyngée pompage. Suppression de pompage est commun à toutes mues en C. elegans. Cependant, la suppression de pompage pharyngé continue tout au long de la phase de dauer et se termine à peu près 4 heures après un retour de l'animal à des conditions environnementales favorables. Au cours de la période initiale de pompage pharyngésuppression, une couche de forme de la cuticule sur la stomie. Ces changements se produisent au cours de la première heure qui suit le début de la mue en dauer. Au cours de cette période initiale, il est souvent la formation d'un processus supplémentaire neurites s'étendant des corps cellulaires IL2Q. Toutefois, ce processus supplémentaire initial rétracte habituellement dans les 2 heures suivant le début de la mue en dauer ^12.

Pendant les heures de 2-5 après le début de la mue en dauer pharynx commence à remodeler montrant une réduction progressive de la taille (figure 4B). En même temps, forme courte de points lacrymaux et rétracter le long de la dendrite primaire IL2Q (figure 5). Pendant les heures de 4 à 8 qui suivent le début de la mue, le corps subit un rétrécissement radial progressive aboutissant à la séparation de la cuticule des nématodes de la L2d (Figure 4C). Cette période est corrélée avec l'excroissance de 2 ° à partir de dendrites primaires des dendrites et la mise en place d'undendrites utres des corps cellulaires IL2Q (spécifique dauer primaire dendrites-1d °). La croissance dendritique n'est pas constante, mais caractérisé par la formation à la fois dynamique et la rétraction du processus, comme illustré dans la figure 5. L'° et 2 ° 1d dendrites s'étendent généralement à la ventrale (pour IL2Vs) ou dorsale (pour IL2Ds) médianes. Une fois que la cuticule de dauer est complètement séparée de la cuticule L2d, l'application de la lumière fluorescente provoque l'animal à tourner rapidement autour de son axe longitudinal, ce qui rend difficile l'imagerie ultérieure. Les tentatives visant à retirer l'animal le développement de la diapositive, mécaniquement enlever la cuticule L2D, et monter l'animal sur une nouvelle diapositive tout en maintenant le développement de dauer n'ont pas réussi.

Figure 1: brut dauer phéromone estun liquide jaune qui peut être stocké indéfiniment à -20 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 DIC micrographies de C. elegans dauers avec Dauer typique caractéristiques morphologiques. vue (A) Dorsale mi-corps d'un dauer démontrant une stomie occlus (flèche) et un pharynx rétréci avec ampoule borne rectangulaire (indiquée en rouge, comparer avec L2 larve montre la figure 4A). Dauers nouvellement formés seront souvent conserver une partie de la cuticule L2d (tête de flèche). Vue (B) dorsale de l'hypoderme montrant corps hautement réfringents (flèche) typique de dauers. Encore une fois la cuticule L2d est évident (tête de flèche). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3 Dose réponse dosage de brut dauer phéromone. Animaux L1 exposés à des niveaux croissants de dauer phéromone incorporés dans les médias NGM modifié sont plus susceptibles de former dauers. Les données ont été collectées et regroupées à partir de deux expériences distinctes, sauf pour les concentrations suivantes, qui n'ont été que testé une fois: 0,05%, 2% et 4%. Les données ont été ajustées à une courbe dose-réponse sigmoïdale. Les valeurs de R ² et de la CE ont été calculés par régression logistique. Le nmbre d'animaux étudiés pour chaque concentration est la suivante: 0% n = 299, 0,05% n = 81, 0,1% n = 352, 0,5% n = 368, n = 1 241%, 2% n = 125, n 4% = 155. Les barres d'erreur représentent 95% des intervalles de confiance.

Figure 4 DIC latérale droite vue micrographies de C. elegans au cours des différentes étapes de la mue en dauer. (A) L2 animal avec ampoule à arrondi terminal pharyngée (indiqué en rouge). (B) environ 3 heures après la mue dans dauer, l'ampoule terminal est en baisse et la cuticule L2d commence à détacher de la cuticule de dauer nouvellement formé (tête de flèche). (C) environ 10 heures après le début de la mue de dauer, l'animal a subi une contraction radiale et de détachement de la cuticule L2d (tête de flèche). Parfois, le cuticule bordée canal excréteur de la scène L2d (flèche) peut être vu encore attaché à la dauer de développement. Les barres d'échelle, 10 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 latéraux micrographies vue de épifluorescence d'un seul animal exprimant l'IL2 reporter P _klp-6 :: tdTomato. Top, l'image sur toute la longueur de neurones IL2 environ 3 heures après le début de la mue en dauer. Encart montre une partie de IL2Q dendrites à divers points de temps après le début de la mue en dauer. Une extension rapide des branches de IL2Q s'amorce environ 5 heures après le début de la mue en dauer. Les barres d'échelle, 10 um.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Un examen de la neuroplasticité spécifique dauer et d'autres changements morphologiques Dauer associée nécessite le contrôle et la formation fiable de dauers soit par mutation génétique (c.-à-mutants, daf-c) ou par l'exposition d'animaux de type sauvage à la phéromone. Bien que l'utilisation d'une mutation génétique pour induire dauers est commode, on peut confondre résultats. Par conséquent les données collectées à des mutations daf-c doit être confirmée par la suite avec des animaux de type sauvage induit à entrer dans la phase de dauer par l'exposition à dauer phéromone.

La production de brut dauer phéromone est relativement simple et les variations de ce protocole sont publiés ^18. À l'exception possible de la contamination, la méthode présentée ici est très fiable. Pour produire l'extrait, nous utilisons une méthode standard de culture de grandes densités de nématodes dans un liquide culture médiatique de S ^19. Il existe une grande quantité de flexibilité dans la quantité d'initial nématode inoculum ajouté à la culture liquide. En commençant par un plus grand nombre de nématodes permettra d'accélérer la procédure. Cependant, il est important de veiller à ce que l'ensemble de l'inoculum initial de nématode est exempt de contamination. Les deux contaminations fongiques et bactériennes peuvent survenir au cours de la croissance dans les milieux liquides. La contamination fongique peut être facilement détecté par la présence d'hyphes. La contamination bactérienne est plus difficile à évaluer. Typiquement, un contaminant bactérien peut être observée si la culture liquide n'efface pas peu de temps après les périodes d'incubation cotées. Il ya une flexibilité dans la densité de la population totale des nématodes nécessaire pour produire la phéromone suffisante. Par exemple, une concentration de 25 000 nématodes / ml est suffisante pour produire une phéromone efficace pour induire dauers. Une autre méthode consiste à transférer les nématodes provenant d'une culture liquide à un faible volume de tampon M9 (~ 50 ml), suivie par une O / N incubation à la température ambiante sur un agitateur orbital et la purification ultérieure de la pheromone par les procédés décrits ici. Cette solution est efficace, mais produit une phéromone avec une CE ₅₀ supérieure (c'est à dire, moins puissant).

Comme chaque lot de phéromone brut peut varier en puissance, il est important de tester l'efficacité d'un sous-échantillon pour induire dauer. Pour de nombreuses applications, une seule étude avec une répétition pour chaque concentration de phéromone est suffisante pour fournir une estimation générale de la puissance. Cependant, il peut y avoir des variations importantes entre les essais biologiques dose-réponse effectués de façon indépendante. Par conséquent, si les expériences ont besoin d'un équilibre délicat entre la formation et le développement de dauer non dauer, il sera nécessaire d'effectuer 2 - 3 essais biologiques répétés pour déterminer une dose précise efficace. Dans l'avenir, comme l'importance de ascarosides dans nématode biologie est plus largement reconnu, il peut être possible d'acheter synthétisé phéromone dauer à un coût raisonnable.

La conclusion de neu-spécifique dauerremodelage ronal dans les IL2s fournit une plate-forme pour étudier les mécanismes moléculaires de la plasticité synaptique induite par le stress. Pour déterminer le mécanisme par lequel des gènes spécifiques régulent la plasticité synaptique, il peut être nécessaire de suivre le processus de remodelage en temps réel. Le procédé de l'IL2 en imagerie in vivo précédente s'appuie sur C. méthodes elegans ^{22, 24, 25.} L'un des obstacles à l'imagerie pendant la formation dauer est la possibilité de récupération de dauer. La solution la plus simple est d'utiliser d'abord une mutation daf-c. Confirmation de tout résultat peut alors être effectuée dans un arrière-plan non daf-c en utilisant les procédés décrits ici.

Singh et Sulston ont relevé plusieurs obstacles pour l'imagerie in vivo de la formation de dauer ^25. Ces dauers nouvellement formés inclus s'échapper de la lame de microscope et un mouvement incontrôlé qui suit retrait radial. L'utilisation de perles micro a éliminé la possibilité de fuite ^22. However le retrait radial qui se produit environ 10 h dans la mue dauer crée toujours des difficultés pour l'imagerie ultérieure.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving