In Vivo Imaging di Dauer-specifica neuronale ritocca in C. elegans

Abstract

I meccanismi che controllano lo stress-indotta plasticità fenotipica di animali sono spesso complesse e difficili da studiare in vivo. Un classico esempio di plasticità indotta da stress è la fase dauer di C. elegans. Dauers sono uno stadio larvale di sviluppo alternativo formata in condizioni di basse concentrazioni di cibo batterica e alte concentrazioni di un feromone dauer. Dauers visualizzare ampia plasticità evolutiva e comportamentale. Ad esempio, un set di quattro quadranti interno-labiale (IL2Q) neuroni soggetta ad un esteso rimodellamento reversibile durante la formazione dauer. Utilizzando la ben nota voce di percorsi ambientali di regolazione dauer, un metodo precedentemente stabilito per la produzione di greggio dauer feromone da grandi culture nematodi liquido è dimostrata. Con questo metodo, una concentrazione di 50.000 - 75.000 nematodi / ml di coltura liquido è sufficiente a produrre una molto potente greggio dauer feromone. La potenza feromone greggio è determined da un saggio biologico dose-risposta. Infine, sono descritti i metodi utilizzati per in vivo time-lapse imaging dei IL2Qs durante la formazione dauer.

Introduction

Plasticità fenotipica, tra cui plasticità evolutiva e comportamentale, è importante per adattamenti alle condizioni ambientali avverse ed è considerato una forza trainante nell'evoluzione ^1. C. elegans è un organismo modello utilizzato frequentemente per gli studi di sviluppo e neurobiologia. In condizioni ideali, C. elegans si sviluppa attraverso quattro stadi larvali prima di entrare nella fase riproduttiva adulto. Tuttavia, in condizioni di scarsa disponibilità di cibo e di alta densità di popolazione, C. elegans può subire un interruttore di sviluppo e di entrare in una fase di lunga durata e resistente alle sollecitazioni dauer ^2. Dauers mostrano molte differenze morfologiche e comportamentali da non dauers che probabilmente mediano questa resistenza allo stress. Gli stimoli ambientali e percorsi genetici che regolano l'ingresso dauer sono stati ampiamente descritti ^{3, 4, 5, 6, 7.} Tuttavia, i meccanismi molecolari che controllano le singole modifiche fenotipiche che si verificano durante formazione dauer sono meno ben compreso.

L'esame di fenotipi specifici-Dauer richiede la produzione di animali Dauer. Questo può essere realizzato in tre modi: 1) Picking da una cultura affamato di C. elegans, 2) Uso della formazione dauer costitutiva (daf-c) mutanti, 3) induzione della formazione dauer attraverso feromone purificato. E 'relativamente semplice per scegliere dauers da una piastra standard NGM con una C. popolazione elegans che ha esaurito il suo batterica di approvvigionamento alimentare. Nelle nostre mani, una piastra standard NGM originariamente seminato con 50 ml di OP50 Escherichia coli, ha permesso di crescere per 3 giorni e successivamente inoculate con 3 - 4 adulti ermafroditi mantenuta a 25 ° C, si esaurirà la fornitura di cibo entro una settimana e produrre diverse migliaia dauers all'interno di un ulteriore 3 giorni (oltre a numerosi non-dauers affamati). Tuttavia, questo metodo non è soddisfacente per i processi che si verificano durante l'esame muta in dAuer. E 'difficile determinare quale delle diverse migliaia di animali su un piatto tipico Starved stanno entrando in dauer. Inoltre, l'uso di una piastra di fame non offre alcuna possibilità di sincronizzazione. L'uso di mutanti daf-c consente la sincronizzazione e la generazione affidabile di dauers. Tuttavia, non vi è alcuna garanzia che una particolare daf-c mutazione non influirà altri fenotipi specifici-Dauer da solo o in combinazione con altre mutazioni.

La presenza di un feromone dauer stato implicito Cassada e Russell e successivamente dimostrato da Golden e Riddle. Il feromone dauer da allora è stato caratterizzato chimicamente ^{2, 8, 9, 10.} Feromone purificato è costituito da una miscela complessa di ascarosides, che in forme diverse a regolare entrambi i processi comportamentali e di sviluppo ^{9, 11.} L'uso di un estratto di feromone greggio dauer permette di induzione affidabile controllata di dauers sincronizzati in uno sfondo wild-type. Il sistema nervoso e le cellule gliali associate subiscono rimodellamento durante dauer larva formazione ^{12, 13, 14.} Alcuni di questi cambiamenti sono irreversibili, come ad esempio la ristrutturazione delle cellule gliali durante dauer ^{13, 14.} Tuttavia altri eventi di rimodellamento sono reversibili dopo un ritorno favorevole condizioni ambientali. Ad esempio, una serie di quattro neuroni IL2Q subiscono una rapida e reversibile rimodellamento neuronale durante la formazione dauer tra cui: arborizzazione dei dendriti, un passaggio da singolo dendritiche ai neuroni e assoni multidendritic rimodellamento ^12. I metodi consentono qui per imaging attendibile in vivo di neuroplasticità indotta da stress in un organismo modello. I metodi presentati per la produzione e la sperimentazione di greggio dauer feromone sono precedentemente descritti e compilati da diverse fonti ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1 Crude Dauer feromone Produzione

1. Grow OP50 E. coli da una singola colonia O / N a 37 ° C sotto agitazione in 100 ml di brodo LB a 200 rpm. NOTA: Questo / cultura O N può essere fatta in anticipo e conservato a 4 ° C.
2. Grow N2 C. elegans il 15-20 Giugno piatti cm Petri con NGM agar (vedi ricetta nella tabella 1), testa di serie con 50 ml di OP50 E. coli fino a quando il batterio è quasi esaurito ^19.
3. Fai 5x 250 ml di S supporti (vedi ricetta nella tabella 1) in 1 L beute ^19. NOTA: Questa soluzione può essere effettuato in anticipo.
4. Coltivare una cultura di OP50 E. coli in 4 l di brodo LB O / N inoculando con 1 ml di OP50 in E. coli e agitazione a 37 ° C per 16 ore.
5. Lavare i nematodi da piastre (passo 1.2) con 1 ml di soluzione S basale (vedi ricetta nella tabella 1) e di trasferimento nematodi 4-5 piastre in ciascuna delle 4 1 L Erlenmeyer palloni con i media S preparata al punto 1.3 (a 4 5 piattiper ogni pallone) ^19.
6. Centrifugare la OP50 dal punto 1.4 a 650 xg per 10 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere ogni pellet batterico in 10 ml di soluzione S basale. Trasferire la stessa quantità di batteri risospese ad ogni pallone di nematodi.
7. Collocare i flaconi in un agitatore orbitale a temperatura ambiente (20 - 25 ° C) e 100 - 150 rpm per 4 - 5 giorni fino a quando la soluzione inizia a cancellare, indicando una deplezione di cibo.
8. Una volta che il cibo è esaurito, crescerà un'altra cultura O / N di OP50 E. coli in 4x 1 l di brodo LB. Centrifugare i batteri a 650 xg per 10 minuti e aggiungere una pallina da un pallone a ciascuno dei palloni S multimediali con nematodi. Restituire i palloni S media per l'agitatore orbitale, come al punto 1.7, per altri 3-4 giorni fino a quando il cibo si esaurisce di nuovo.
9. Dai ~ 1 ml aliquota della soluzione da ciascuna beuta e stimare la concentrazione nematode da sub-campionamento 1 microlitri da ogni 1 ml aliquota e contando il numero di nematodi. NOTA: L'popolazione di nematodi dovrebbe essere 50.000 - 75.000 nematodi / ml. A questa concentrazione la maggior parte dei nematodi sono dauers.
10. Eliminare eventuali fiaschi contaminati. NOTA: La contaminazione si manifesta frequentemente come ife fungine visto durante la fase 1.9.
11. Nematodi Centrifugare a 4000 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il pellet nematode e conservare il surnatante. In alternativa, consultare la discussione per l'utilizzo di questi animali per fare un feromone a bassa potenza.
12. Filtrare il surnatante con # 1 carta da filtro Whatman. NOTA: Una boccetta di vuoto sarà accelerare questo processo.
13. Inoltre Filtrare il surnatante con unità di filtrazione a vuoto sterile 0,45 micron. NOTA: filtrato può essere conservato O / N a 4 ° C o procedere a 1.14.
14. Aggiungere il filtrato in un becher da 2 L con un ancoretta. Mettere in una cappa su una piastra riscaldante scalpore. Portate ad ebollizione mescolando ed evaporare a circa 200 ml. Trasferire la soluzione in un becher da 500 ml. Continuare l'ebollizione fino a circa 50 ml sono left. NOTA: Si deve prestare attenzione durante questa fase in quanto è possibile per la soluzione a bollire sopra. Il colore finale 50 ml è un marrone scuro. In qualsiasi momento durante il processo di cottura, il calore può essere spento e il filtrato O / N conservato a temperatura ambiente oa 4 ° C.
15. Lasciate raffreddare e centrifugare per 5 minuti a 1000 x g. Versare il surnatante in un becher da 100 ml e scartare il pellet.
16. Lessare il surnatante verso il basso per una crosta marrone. Togliere dal fuoco e rompere la crosta con una spatola. Aggiungere sufficiente etanolo 200 prova a coprire la crosta. Coprire il becher con Parafilm e lasciate riposare O / N a RT. Eliminare l'etanolo in un bicchiere pulito e messo a lato. Aggiungere etanolo fresco per coprire la crosta. Ripetere estrazioni O / N 3 volte. Si riuniscono gli estratti.
17. Utilizzare una pompa a vuoto per asciugare gli estratti di etanolo. Se una pompa a vuoto non è disponibile, aggiungere l'estratto etanolico di un becher pulito e caldo a 50 ° C sotto agitazione in una cappa aspirante. NOTA: Una volta che l'etanolo è evaporato un residuo appiccicoso di light colore marrone deve rimanere. Se si usa il riscaldamento, la cura dovrebbe essere presa per non bruciare la soluzione di riscaldamento per troppo tempo.
18. Disciogliere il residuo in 10 ml di acqua distillata sterile. Filtro sterilizzare questa soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron e conservare a -20 ° C in aliquote di 1 ml. NOTA: 1 ml di acqua viene utilizzata per sciogliere il residuo per ogni 100 ml di coltura nematode liquido originale. Ad esempio, se una delle fiasche di coltura liquido viene scartato a causa della contaminazione, quindi regolare la quantità di acqua utilizzata per sciogliere il residuo.

2 Determinazione del feromone Dose Response

1. Preparare dauer feromone facendo 6x 5 ml di NGM media con Noble agar senza peptone, e integrato con 50 mg / ml di streptomicina solfato e una serie di dauer feromone (vedi ricetta in Tabella 1) ^{4, 19.} Miscelare i componenti in un 13x100 mm provetta di vetro, bollire sopra un becco Bunsen, e poi versare in tre centimetri piastre di Petri.
2. Pesare amtubo icrocentrifuge. Aggiungere 1 ml di O / N coltura di E. coli OP50 al tubo e centrifugare a ~ 17.000 xg in una provetta. Rimuovere tutto il surnatante. Pesare nuovamente il tubo e determinare il peso del pellet batterico. Risospendere il pellet con tampone M9 (vedi ricetta in Tabella 1) per una concentrazione finale di 4% ^(w / _v). Aliquotare 10 microlitri della sospensione batterica sul centro di ciascuna piastra feromone ^4. Conservare le piastre O / N a RT.
3. Scegli 10-15 gravide N2 wild-type ermafroditi un giorno dopo la muta in età adulta sulle piastre feromoni ^4. Conservare le piastre a 25 ° C per 3 - 4 ore.
4. Scegli fuori tutti i ermafroditi adulti. Registrare il numero di uova deposte per ogni piatto. Sigillare le piastre con parafilm e ritornare a 25 ° C per 3 giorni ^17.
5. Contare la percentuale di dauers (Figura 2). Nota: Per entrambi i metodi, è importante notare che dauers (e ad un ex minoretenda non dauers) salirà sulle pareti e sul coperchio delle piastre di Petri. E 'quindi importante esaminare tutte le superfici del piatto per nematodi.
6. Montare i dati ad una curva dose-risposta e stimare la concentrazione CE ₉₀ del feromone (feromone sufficiente ad indurre il 90% degli animali per formare dauers) come mostrato in Figura 3 Nota:. Usiamo tipicamente un modello di regressione logistica per stimare la CE ₉₀ , ma diversi pacchetti software statistici possono avere metodi alternativi che producono stime simili.

3 Immagini dal vivo di Dauer IL2 neuroni

1. Preparare piatti dauer feromoni come nel protocollo 2 utilizzando il valore EC ₉₀ determinata al punto 2.6.
2. Indurre dauers utilizzando i metodi del protocollo 2 con un ceppo che trasporta un giornalista transgene integrato IL2 (myIs13 [P _klp-6 :: GFP], myIs14 [P _klp-6 :: GFP], myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] o qIs56 [P _lag-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} NOTA: Se si utilizza q Is56, espressione di GFP non sarà visibile nei IL2Qs fino a diverse ore nel molt dauer e alcuni degli eventi di rimodellamento iniziali non saranno visibili. Inoltre, mentre il segnale fluorescente dalla P _lag-2 :: GFP transgene è in definitiva più luminoso nelle IL2s durante dauer rispetto ai _{6 KLP-reporter} fluorescenti P, la P _lag-2 :: transgene GFP esprime anche debolmente nei muscoli della testa che può mascherare i bei rami IL2.
3. Dopo la deposizione delle uova, rimuovere gli ermafroditi adulti, sigillare le piastre con Parafilm e incubare per 34 ore a 25 ° C ^17. NOTA: La lunghezza del tempo per la muta dauer varia leggermente da individuo a individuo. La rapida periodo più di dendrite arborizzazione inizia 4-5 ore dopo l'inizio della muta dauer (39-44hr dopo la deposizione delle uova a 25 ° C) ^12.
4. Il giorno prima di imaging, costituiscono una soluzione di 10% ^(w / _v) agarosio in tampone M9 con dauer feromone alla concentrazione CE _90. Aliquota circa 100 ml di agarosio su un vetrino da microscopio e rapidamente, ma delicatamente, posizionare un'altra diapositiva in alto per creare una superficie piana agarosio. Dopo l'agarosio si è solidificato, avvolgere le diapositive saran wrap e conservare in una camera umida (scatola punta della pipetta con tovaglioli di carta bagnati).
5. Dopo il periodo di incubazione 34 ore, esaminare le piastre di feromone per nematodi che hanno smesso faringeo pompaggio. Scivoli separati in modo tale che una sola superficie di un vetrino ha agarosio su di esso. Scegli uno o più nematodi su un pad agarosio del 10% e 1 μ l di 0,1 micron sferette di polistirene ^22. NOTA: Con una popolazione ben sincronizzato, la maggior parte dei nematodi sul piatto entrerà nella muta da L2D a dauer. Tuttavia, ci possono essere variazioni tra individuals. E 'quindi importante notare funzionalità aggiuntive (stoma occlusione, faringeo rimodellamento) per stimare la quantità di tempo che gli animali sono stati all'interno della muta dauer (vedi risultati rappresentativi per esempio).
6. Determinare l'orientamento (sinistra / destra, dorsale / ventrale) del nematode. Cattura immagini di Z-stack di un dendrite IL2Q ad ingrandimento 100X con la possibile intensità di fluorescenza più basso ogni 15 minuti o quando necessario per l'esperimento specifico. Continuare a catturare immagini fino a quando il nematode ha separato dalla cuticola L2D e immobilizzazione è impossibile o se l'animale si riprende da dauer (faringe comincia pompaggio). Quando non l'imaging attivamente, posizionare il vetrino in una camera umida. NOTA: Usiamo un microscopio epifluorescente con un contrasto di interferenza differenziale di fase e motorizzato (DIC) ottica.

Representative Results

La produzione di greggio risultati dauer feromoni in un liquido giallo (Figura 1) che è sia caldo e freddo stabile. Aliquote di feromone greggio vengono conservati a -20 ° C indefinitamente senza perdita evidente di attività. In seguito la produzione di feromoni, un unico biotest dose-risposta è sufficiente per una stima approssimativa di potenza. Tuttavia, per la maggior parte degli esperimenti è necessario ripetere il saggio biologico 2 - 3 volte e prendere una media di ciascun esperimento. I risultati rappresentativi di due saggi biologici feromoni sono indicate nella figura 3. Da questi dati di CE e ₅₀ CE, ₉₀ possono essere calcolati.

Oltre alla resistenza al sodio dodecil solfato ^2, dauers possono essere riconosciuti da diverse caratteristiche morfologiche, tra cui una stomia occlusa, alae laterali, corpi rifrangenti nei ipoderma anteriori e una faringe rimpicciolito (Figura 2 e Figura 4A for larve L2). Dauers hanno anche diverse caratteristiche comportamentali distintive, tra cui:. Propensione a rimanere quiescente comportamentale, la presenza di una strategia di dispersione occasionale chiamato nictation, soppressione dei movimenti della testa foraggiamento, la soppressione di pompaggio faringea e l'induzione del dotto escretore pulsante ^{2, 5, 23} Il caratteristiche comportamentali mostrano variabilità tra gli individui.

La muta in dauer richiede circa 12 ore dalla fine della fase di pre-dauer L2 (L2D) ^4. Questo periodo corrisponde a una crescita stereotipata delle pergole IL2Q. Il primo evento notevole della muta in dauer è la soppressione di pompaggio faringea. Soppressione di pompaggio è comune a tutte le mute in C. elegans. Tuttavia, la soppressione della faringe pompaggio continua per tutta la fase dauer e termina circa 4 ore dopo il ritorno dell'animale alle condizioni ambientali favorevoli. Durante il periodo iniziale di pompaggio faringeasoppressione, uno strato di forme cuticola sopra la stomia. Questi cambiamenti si verificano durante la prima ora dopo l'inizio della muta in dauer. Durante questo periodo iniziale è frequente la formazione di un processo neuriti addizionale che si estende dai corpi cellulari IL2Q. Tuttavia, questo processo aggiuntivo iniziale di solito si ritrae in 2 ore dopo l'inizio della muta in dauer ^12.

Durante le ore di 2-5 dopo l'inizio della muta in dauer faringe inizia a rimodellare mostrando una progressiva riduzione delle dimensioni (Figura 4B). Contemporaneamente, forma puncta breve e ritrarre lungo il dendrite primario IL2Q (Figura 5). Durante le ore di 4-8 dopo l'inizio della muta, il corpo subisce una contrazione radiale graduale conseguente tirando via del nematode dalla cuticola L2D (Figura 4C). Questo periodo è correlato con la conseguenza di 2 ° dendriti dai dendriti primari e l'istituzione di undendriti SUPPLEMENTARI dai corpi cellulari IL2Q (specifica-dauer primario dendriti-1D °). La crescita dendritica non è costante, ma piuttosto caratterizzata sia la formazione dinamica e retrazione di processi come illustrato nella Figura 5. Il 2 ° e 1d ° dendriti generalmente estende al ventrale (per IL2Vs) o dorsale (per IL2Ds) mediane. Una volta che la cuticola dauer è completamente separata dalla cuticola L2D, l'applicazione di luce fluorescente provoca l'animale a girare rapidamente sul suo asse longitudinale, rendendo l'imaging successiva impegnativo. I tentativi di rimuovere l'animale in via di sviluppo dalla diapositiva, meccanicamente rimuovere la cuticola L2D, e montare l'animale su una nuova diapositiva, pur mantenendo lo sviluppo dauer non hanno avuto successo.

Figura 1 Crude dauer feromone èun liquido giallo che può essere conservato indefinitamente a -20 ° C. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2 DIC micrografie di C. elegans dauers con tipico Dauer caratteristiche morfologiche. vista (A) Dorsale metà corpo di un dauer dimostrando una stomia occluso (freccia) e un faringe rimpicciolito con bulbo terminale rettangolare (delineato in rosso, confrontare con L2 larva mostrato nella Figura 4A). Dauers recente formazione frequentemente trattenere parte della cuticola L2D (punta di freccia). Vista (B) dorsale di ipoderma che mostrano corpi altamente rifrangenti (freccia) tipico di dauers. Anche in questo caso la cuticola L2D è evidente (punta di freccia). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3 Dose risposta del test di greggio dauer feromone. L1 animali esposti a livelli crescenti di dauer feromone incorporati nel supporto NGM modificato è più probabile che si formi dauers. I dati sono stati raccolti e messi a disposizione dai due esperimenti separati, tranne per le seguenti concentrazioni, che sono stati testati solo una volta: 0,05%, 2% e 4%. I dati sono stati adattano ad una curva dose-risposta sigmoidale. I valori di R ² e CE sono stati calcolati utilizzando la regressione logistica. Il numero di animali esaminati per ciascuna concentrazione è la seguente: 0% n = 299, 0,05% n = 81, 0,1% n = 352, 0,5% n = 368, 1% n = 241, 2% n = 125, 4% n = 155. Le barre di errore rappresentano intervalli di confidenza al 95%.

Figura 4 DIC vista laterale destra micrografie di C. elegans durante le diverse fasi della muta in dauer. (A) L2 animale con tipico bulbo arrotondato faringea terminale (indicato in rosso). (B) Circa 3 ore dopo la muta in dauer, il bulbo terminale si sta restringendo e la cuticola L2D sta cominciando a staccarsi dalla cuticola dauer di recente formazione (punta di freccia). (C) circa 10 ore dopo l'inizio della muta dauer, l'animale è stato sottoposto a ritiro radiale e distacco dalla cuticola L2D (punta di freccia). Di tanto in tanto, il cuticola foderato dotto escretore della fase L2D (freccia) può essere visto ancora attaccato al dauer sviluppo. Bar Scala, 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. laterali micrografie vista epifluorescente di un singolo animale che esprime il IL2 giornalista _{klp P-6} :: tdTomato. Top, full-length immagine di neuroni IL2 circa 3 ore dopo l'inizio della muta in dauer. Inset mostra porzione di IL2Q dendrite in vari punti temporali successivi l'inizio della muta in dauer. Una rapida estensione dei rami IL2Q avviene a partire circa 5 ore dopo l'inizio della muta in dauer. Bar Scala, 10 micron.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Un esame della neuroplasticità specifici per dauer e altri cambiamenti morfologici Dauer-associata richiede controllata e affidabile di formazione dauers sia attraverso la mutazione genetica (cioè mutanti, DAF-C) o in caso di esposizione di wild-type animali a feromone. Mentre l'uso di una mutazione genetica per indurre dauers è conveniente, può confondere risultati. Pertanto, i dati raccolti con mutazioni daf-c devono essere successivamente confermati con wild-type animali indotti ad entrare nella fase dauer da esposizione a dauer feromone.

La produzione di greggio dauer feromone è relativamente semplice e variazioni di questo protocollo sono pubblicati ^18. Con la possibile eccezione di contaminazione, il metodo presentato qui è molto affidabile. Per produrre l'estratto, usiamo un metodo standard di coltura di grandi densità di nematodi a S mezzi liquidi cultura ^19. Vi è una grande quantità di flessibilità nella quantità di initial nematode inoculo aggiunto alla coltura liquida. A partire da un maggior numero di nematodi sarà accelerare la procedura. Tuttavia, è importante garantire che tutte nematode inoculo iniziale è esente da contaminazione. Sia fungina e la contaminazione batterica possono sorgere durante la crescita dei mezzi liquidi. Contaminazione fungina può essere facilmente rilevata dalla presenza di ife. La contaminazione batterica è più difficile da valutare. Tipicamente un contaminante batterica può essere osservata se la coltura liquida non cancella subito dopo i periodi di incubazione indicati. C'è duttilità sul totale densità di popolazione di nematodi necessario per produrre feromone sufficiente. Per esempio, una concentrazione di 25.000 nematodi / ml è sufficiente per produrre un feromone efficace ad indurre dauers. Un metodo alternativo consiste nel trasferimento dei nematodi da una coltura liquida di un piccolo volume di tampone M9 (~ 50 ml) seguito da una / N O incubazione a temperatura ambiente su un agitatore orbitale e successiva purificazione del pheRomone con i metodi qui descritti. Questa alternativa è efficace, ma produce un feromone con CE superiore ₅₀ (cioè, meno potente).

Come ogni lotto di feromone greggio può differire in potenza, è importante testare un sottocampione per l'efficacia nell'indurre dauer. Per molte applicazioni un unico biotest con una replica per ogni concentrazione di feromone è sufficiente a fornire una stima generale di potenza. Tuttavia, ci possono essere variazioni significative tra eseguite indipendentemente biotest dose-risposta. Pertanto, se gli esperimenti richiedono un delicato equilibrio tra la formazione dauer e sviluppo non dauer, sarà necessario eseguire 2 - 3 biotest replicati per determinare una dose efficace accurato. In futuro, come l'importanza di ascarosides in nematode biologia è più ampiamente riconosciuto, può essere possibile acquistare sintetizzato feromone dauer a costi ragionevoli.

Il ritrovamento di Neu-specific dauerrimodellamento Ronal nei IL2s fornisce una piattaforma per lo studio dei meccanismi molecolari di neuroplasticità indotta da stress. Per identificare il meccanismo con cui i geni specifici regolano neuroplasticità, può essere necessario per seguire il processo di rimodellamento in tempo reale. Il metodo di IL2 imaging in vivo si basa sulla precedente C. metodi elegans ^{22, 24, 25.} Un ostacolo immagini durante la formazione dauer è la possibilità di recupero dauer. La soluzione più semplice è quello di utilizzare inizialmente un daf-c mutazione. Conferma dei risultati può essere eseguita in un non daf-c di sfondo utilizzando i metodi qui descritti.

Singh e Sulston notato diversi ostacoli per imaging in vivo di formazione dauer ^25. Questi dauers recente formazione inclusi fuggire fuori dal vetrino da microscopio e il movimento incontrollato dopo restringimento radiale. L'utilizzo di perline di microsfere ha eliminato la possibilità di fuga ^22. However la contrazione radiale che si verifica circa 10 ore in muta dauer crea ancora difficoltà per l'imaging successiva.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving