In vivo avbildning av Dauer-spesifikke nevronale ombygging i C. elegans

Abstract

Den mekanisme som kontrollerer stressindusert fenotypisk plastisitet hos dyr er ofte komplekse og vanskelige å studere in vivo. Et klassisk eksempel stress-indusert plastisitet er Dauer stadium av C. elegans. Dauers er en alternativ utviklingslarvestadiet dannet under betingelser med lave konsentrasjoner av bakterielle mat og høye konsentrasjoner av en Dauer feromon. Dauers vise omfattende utviklingsmessige og atferds plastisitet. For eksempel, et sett med fire inner-labial kvadranten (IL2Q) nevroner gjennomgå omfattende reversibel ombygging under Dauer formasjon. Ved hjelp av den kjente miljø trasé regulerings Dauer inngang, en tidligere etablert metode for produksjon av råolje Dauer feromon fra store væske nematode kulturer blir demonstrert. Med denne metoden en konsentrasjon på 50 000 - er tilstrekkelig til å produsere en høypotent råolje Dauer feromon 75,000 nematoder / ml væskekultur. Råoljen feromon potens er determined av en dose-respons bioassay. Endelig er de metodene som brukes for in vivo time-lapse avbildning av de IL2Qs under Dauer dannelse beskrevet.

Introduction

Fenotypisk plastisitet, inkludert utviklingsmessige og atferds plastisitet, er viktig for tilpasninger til ugunstige miljøforhold og regnes som en pådriver i utviklingen ^en. C. elegans er en modellorganisme ofte brukt for studier i utvikling og nevrobiologi. Under ideelle forhold, C. elegans utvikler gjennom fire larvestadier før inn i voksen reproduktive stadium. Men under forhold med lav mattilgang og høy befolkningstetthet, C. elegans kan gjennomgå en utviklings bryter og inngå en langlivet og stress-motstandsdyktig Dauer trinn ^2. Dauers vise flere morfologiske og atferdsmessige forskjeller fra ikke-dauers som sannsynlig megle denne stresstoleranse. De miljømessige signaler og genetiske trasé som regulerer Dauer oppføring har vært omfattende beskrevet ^{3, 4, 5, 6, 7.} Men de molekylære mekanismene som kontrollerer individuelle fenotypiske endringer som skjer during Dauer dannelse er mindre godt forstått.

Undersøkelsen av Dauer-spesifikke fenotyper krever produksjonen av Dauer dyr. Dette kan oppnås på tre forskjellige måter: 1) plukking fra en sultet kultur av C. elegans, 2) Bruk av Dauer dannelsen konstituerende (daf-c) mutanter, 3) Induksjon av Dauer dannelse gjennom renset feromon. Det er relativt enkelt å plukke dauers fra en standard NGM plate med en C. elegans befolkningen som har brukt opp sin bakteriell mat-forsyning. I våre hender, en standard NGM plate opprinnelig podet med 50 pl av OP50 Escherichia coli, tillatt å vokse i 3 dager og deretter inokulert med 3 - 4 voksne hermaphrodites holdt ved 25 ° C vil eksos maten tilførsel i løpet av en uke, og produserer flere tusen dauers innen en ekstra 3 dager (i tillegg til en rekke sultet ikke-dauers). Imidlertid er denne metode ikke tilfredsstillende for behandlingen av prosesser som forekommer i løpet av molt i dAuer. Det er vanskelig å avgjøre hvilke av de flere tusen dyr på en typisk sultet plate går inn i Dauer. Videre er bruk av en sultet plate gir ingen mulighet for synkronisering. Bruken av daf-c mutantene gjør det mulig for synkronisering og pålitelig generering av dauers. Imidlertid er det ingen garanti for at en bestemt daf-c mutasjon ikke vil påvirke andre Dauer-spesifikke fenotyper alene eller i kombinasjon med andre mutasjoner.

Tilstedeværelsen av en Dauer feromon ble først antydet av Cassada og Russell og senere demonstrert av gylne og Riddle. Den Dauer feromonet har siden blitt kjemisk preget ^{2, 8, 9, 10.} Det rensede feromon består av en kompleks blanding av ascarosides, som i forskjellige former regulere både atferdsmessige og utviklingsmessige prosesser ^{9, 11.} Anvendelse av en råolje Dauer feromon ekstrakt gir mulighet for pålitelig og kontrollert induksjon av synkroniserte dauers i et villtype-bakgrunn. Nervesystemet og tilhørende gliacellene gjennomgå ombygging under Dauer larve dannelse ^{12, 13, 14.} Noen av disse endringene er irreversible, slik som ombygging av gliaceller celler under Dauer ^{13, 14.} Men andre remodeling hendelser er reversible ved en retur til gunstig miljømessige forhold. For eksempel, et sett med fire IL2Q nevroner gjennomgå raske og reversible neuronal ombygging under Dauer dannelse inkludert: Dendritt arborization, en bryter fra enkelt dendrittiske til multidendritic nevroner og axon ombygging ^12. Fremgangsmåtene heri tillate pålitelige in vivo avbildning av stress-fremkalt neuroplasticity i modellorganisme. Metodene som presenteres for produksjon og testing av råolje Dauer feromon er som tidligere beskrevet og samlet fra flere kilder ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. Crude Dauer Pheromone Produksjon

1. Grow OP50 E. coli fra en enkelt koloni O / N ved 37 ° C under rysting i 100 ml LB-næringsløsning ved 200 rpm. Merk Denne O / N kultur kan lages på forhånd og lagret ved 4 ° C.
2. Grow N2 C. elegans på juni 15 til 20 cm petriskåler med agar NGM (Se oppskriften i tabell 1) podet med 50 pl av E. OP50 coli inntil bakterier er nesten tom ^19.
3. Gjør 5x 250 ml S media (se oppskrift i tabell 1) i 1 L Erlenmeyer kolber ^19. MERK: Denne løsningen kan gjøres på forhånd.
4. Dyrk en kultur for OP50 E. coli i 4 liter av LB-næringsløsning O / N ved å inokulere med 1 ml av OP50 i E. coli og risting ved 37 ° C i 16 timer.
5. Vask de nematoder fra platene (trinn 1.2) med 1 ml av S basal-løsning (se oppskrift i tabell 1) og overførings nematoder 4-5 platene til hver av fire 1 L Erlenmeyer-kolber med S media fremstilt i trinn 1.3 (4- 5 platerfor hver kolbe) ^19.
6. Sentrifuger OP50 fra trinn 1.4 ved 650 xg i 10 minutter og fjerne supernatanten. Resuspender hver bakteriell pellet i 10 ml S basal løsning. Overfør like mengder resuspendert bakterier til hver kolbe nematoder.
7. Plasser kolber på en orbital-rysteapparat ved romtemperatur (20 - 25 ° C) og 100 - 150 rpm i 4-5 dager inntil oppløsningen begynner å tippe, noe som indikerer en uttømming av mat.
8. Når maten er oppbrukt, vokser en annen O / N kultur OP50 E. coli i 4x 1 L av LB-næringsløsning. Sentrifuger bakteriene ved 650 xg i 10 min og tilsett en pellet fra en kolbe til hver av de S medie kolber med nematoder. Returner S medie kolber til orbital shaker, som i trinn 1.7, i ytterligere 3-4 dager inntil maten er utarmet på nytt.
9. Ta ~ 1 ml aliquot av løsningen fra hver kolbe og estimere nematode konsentrasjon av sub-sampling 1 pl fra hver 1 ml alikvot og telling av antallet av nematoder. MERK:nematode befolkningen bør være 50.000 - 75.000 nematoder / ml. Ved denne konsentrasjonen flertallet av nematoder er dauers.
10. Kast alle forurensede kolber. MERK: Forurensning ofte manifesterer seg som sopp hyfer sett under trinn 1.9.
11. Sentrifuger nematoder ved 4000 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast nematode pellet og beholde supernatanten. Alternativt, se diskusjonen for å bruke disse dyr for å lage en lav potens feromon.
12. Filtrer supernatanten gjennom Whatman # 1 filterpapir. MERK: En termos vil fremskynde denne prosessen.
13. Videre filtrere supernatanten gjennom 0,45 mikrometer sterile vakuumfiltrering enheter. MERK: Filtrat kan holdes O / N ved 4 ° C eller gå videre til 1,14.
14. Legg filtratet til en 2 liters begerglass med en rørestav. Plasser i en avtrekkshette på en varme oppstuss plate. Kok opp under omrøring og fordampe til ca 200 ml. Overfør løsningen til et 500 ml begerglass. Fortsett å koke til ca 50 ml er le. ft MERK: Utvis forsiktighet under dette trinnet som det er mulig for løsningen å koke over. Fargen på de sluttelige 50 ml er en mørk brun. På ethvert tidspunkt under tilberedningsprosessen, kan varmen slått av, og filtratet lagres O / N ved romtemperatur eller 4 ° C.
15. La den avkjøles og sentrifuger i 5 min ved 1000 x g. Hell av supernatanten til en 100 ml begerglass og Kasser pelleten.
16. Kok supernatanten ned til en brun skorpe. Fjern fra varmen og bryte opp skorpen med en slikkepott. Legg tilstrekkelig 200 bevis etanol for å dekke jordskorpen. Dekk begerglasset med Parafilm og la den sitte O / N ved RT. Hell av etanol i et rent begerglass og satt til side. Legg frisk etanol for å dekke jordskorpen. Gjenta O / N utdrag 3 ganger. Pool ekstrakter.
17. Bruk av en vakuumpumpe for å tørke etanolekstrakter. Dersom en vakuumpumpe ikke er tilgjengelig, tilsett etanol-ekstrakt til et rent begerglass og oppvarmes til 50 ° C under omrøring i en avtrekkshette. MERK: Når etanol har fordampet sitter rester av light brun farge bør forbli. Hvis oppvarming brukes, bør man sørge for å ikke brenne løsningen ved oppvarming for lenge.
18. Oppløs residuet i 10 ml destillert sterilt vann. Filter sterilisere denne løsning med et 0,22 mikrometer sprøytefilter og oppbevares ved -20 ° C i 1 ml alikvoter. MERK: 1 ml vann blir brukt til å løse opp residuet for hver 100 ml av den opprinnelige væsken nematode kultur. For eksempel, hvis en av de flytende kulturflasker blir forkastet på grunn av forurensning, så justere mengden av vann som brukes for å oppløse residuet.

2. Fastsettelse av Pheromone Dose Response

1. Forbered Dauer feromon ved å gjøre 6x 5 ml NGM media med Noble agar, uten pepton, og supplert med 50 ug / ml streptomycin-sulfat og en rekke Dauer feromon (se oppskrift i tabell 1) ^{4, 19.} Bland komponentene i en 13x100 mm glass kultur tube, koke over en gassbrenner, og deretter helle i 3 cm petriskåler.
2. Vei amicrocentrifuge tube. Tilsett 1 ml av O / N kultur av E. coli OP50 til røret og sentrifuger ved ~ 17 000 xg i et mikrosentrifugerør. Fjern alle av supernatanten. Vei opp i røret igjen, og bestemme vekten av den bakterielle pellet. Resuspender pelleten med M9 buffer (se oppskrift i tabell 1) for en endelig konsentrasjon på 4% ^(w / _v). Delmengde 10 pl av bakteriesuspensjonen ut mot midten av hver plate ⁴ feromon. Oppbevar plater O / N ved RT.
3. Plukk 10-15 av gravid N2 villtype hermafroditter en dag etter molt inn i voksenlivet på de feromon plater ^fire. Oppbevar platene ved 25 ° C i 3 - 4 timer.
4. Plukk av alle de voksne hermafroditter. Registrere antall egg lagt for hver plate. Forsegle platene med Parafilm og gå tilbake til 25 ° C i 3 dager ^17.
5. Tell hvor mange prosent av dauers (figur 2). Merk: For begge metoder er det viktig å merke seg at dauers (og i mindre exteltet ikke-dauers) vil klatre opp veggene og på lokket av petriskåler. Det er derfor viktig å undersøke alle overflater av parabolen for nematoder.
6. Monter data til en dose-responskurve, og estimere EC ₉₀ konsentrasjonen av feromon (feromon er tilstrekkelig til å indusere 90% av dyrene til å danne dauers) som vist i figur 3 Merknad:. Vi bruker vanligvis en logistisk regresjonsmodell for å estimere EC ₉₀ , men ulike statistiske programvarepakker kan ha alternative metoder som produserer tilsvarende beregninger.

3. Levende Imaging av Dauer IL2 Neuroner

1. Forbered Dauer feromon plater som i protokoll 2 bruker EF ₉₀ verdi fastsatt i trinn 2.6.
2. Indusere dauers bruke metodene i protokoll 2 med en belastning å bære en integrert IL2 reporter transgenet (myIs13 [P _klp-6 :: GFP], myIs14 [P _klp-6 :: GFP], myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] eller qIs56 [P _lag-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} MERK: Hvis q Is56 brukes, vil uttrykk for GFP ikke være synlig i IL2Qs før flere timer inn i Dauer molt og noen av de første remodeling hendelser vil ikke være synlig. I tillegg, mens fluorescerende signal fra P _lag-2 :: GFP transgenet er til syvende og lysere i IL2s under Dauer enn P _KLP-6 fluorescerende reportere, P _lag-2 :: GFP transgenet uttrykker også svakt i hodet muskler som kan maskere den fine IL2 grener.
3. Etter egg-legging, fjerne den voksne hermafroditter, forsegle platene med Parafilm og inkuberes i 34 timer ved 25 ° C ^17. MERK: Hvor lenge til Dauer molt varierer litt mellom individer. Den raskeste perioden av dendrite arborization begynner 4-5 timer etter utbruddet av Dauer molt (39-44hr etter eggleggingen ved 25 ° C) ^12.
4. Dagen før avbildning, utgjør en løsning av 10% ^(w / _v) agarose i M9 buffer med Dauer feromon ved EC ₉₀ konsentrasjon. Delmengde ca 100 mL av agarose på et objektglass og raskt, men forsiktig, plasserer et annet lysbilde på toppen for å lage en flat agarose underlag. Etter agarosen har stivnet, pakk lysbildene i Saran wrap og oppbevar i en luftfuktighet kammer (pipettespissen boksen med våte tørkepapir).
5. Etter 34 timers inkubasjonstid, undersøke feromon plater for nematoder som har stoppet svelget pumping. Separate lysbilder slik at kun en overflate av en slide har agarose på den. Plukk en eller flere nematoder på en 10% agarose puten og en μ l på 0,1 mikron polystyrenkuler ^22. MERK: Med en godt synkronisert befolkningen, de fleste av nematoder på platen vil bli inngåelse molt fra L2D til Dauer. Imidlertid kan det være variasjon mellom jegndividuals. Det er derfor viktig å merke seg ekstra funksjoner (stomi okklusjon, svelget ombygging) for å anslå hvor lenge dyrene har vært innenfor Dauer molt (se representative resultater for eksempel).
6. Bestemme retningen (venstre / høyre, dorsal / ventral) av nematode. Fang Z-stabelen bilder av en IL2Q dendritt ved forstørrelse 100x med lavest mulig fluorescensintensitet hvert 15 min eller etter behov for det aktuelle eksperiment. Fortsett å ta bilder før nematode har skilt fra L2D skjellaget og immobilisering er umulig eller hvis dyret kommer seg fra Dauer (svelg begynner å pumpe). Når du ikke aktivt bildebehandling, plasserer lysbildet i en luftfuktighet kammer. MERK: Vi bruker en epifluorescent mikroskop med en motorisert scene og differensial interferens kontrast (DIC) optikk.

Representative Results

Produksjon av råolje Dauer feromon resulterer i en gul væske (figur 1) som er både varme og kulde stabil. Aliquoter av råolje feromon er lagret ved -20 ° C ubestemt tid uten åpenbare tap i aktivitet. Etter produksjon av feromon, er en enkelt dose-respons-bioassay tilstrekkelig for et grovt estimat av styrken. Imidlertid, for de fleste eksperimenter er det nødvendig å gjenta bioassay 2-3 ganger og ta et gjennomsnitt fra hvert eksperiment. Representative resultater fra to feromon bioassay er gitt i figur 3. Fra disse data en EC EC ₅₀ og ₉₀ kan beregnes.

I tillegg til motstand mot natriumdodecylsulfat ^2, kan dauers bli gjenkjent av flere morfologiske egenskaper, inkludert en lukket stoma, lateral alae, refraktile legemer i fremre hypodermis og en krympet pharynx (figur 2 og figur 4A for L2 larver). Dauers har også flere karakteristiske atferdsmessige egenskaper inkludert:. En tilbøyelighet til å forbli atferdsmessig quiescent, tilstedeværelse av en tilfeldig spredning strategi kalt nictation, undertrykkelse av hode slåing bevegelser, undertrykkelse av svelget pumping og induksjon av pulserende utførselskanal ^{2, 5, 23} Den atferdsmessige kjennetegn viser variasjon mellom individer.

Den molt inn Dauer tar ca 12 timer fra slutten av pre-Dauer L2 stadiet (L2D) ^4. Denne perioden tilsvarer med stereotype vekst av IL2Q lysthus. Den første merkbare ved den molt inn Dauer er undertrykkelse av svelget pumping. Undertrykkelse av pumping er felles for alle molts i C. elegans. Imidlertid fortsetter undertrykkelse av svelget pumping gjennom Dauer fasen og ender omtrent 4 timer etter en retur av dyret til gunstige miljømessige forhold. I den første tiden av svelget pumpingundertrykkelse, et lag av skjelskjema over stomaen. Disse endringene forekommer i løpet av den første timen etter starten av molt inn Dauer. I løpet av denne innledende periode er det ofte dannelsen av en ekstra neurite prosessen strekker seg fra IL2Q cellelegemer. Imidlertid trekker denne første tilleggsprosess vanligvis innen 2 timer etter inntreden av den molt inn Dauer ^12.

Under timer 2-5 etter utbruddet av molt inn Dauer svelget begynner å renovere viser en gradvis reduksjon i størrelse (Figur 4B). Samtidig, kort puncta form og trekke langs IL2Q primære dendrite (figur 5). I løpet av timer 4-8 Følgende utbruddet av molt, gjennomgår kroppen gradvis radial krymping resulterer i å trekke bort av nematode fra L2D hårstråene (figur 4C). Denne perioden er korrelert med utvekst av 2 ° dendritter fra de primære dendritter, og etablering av endditional dendritter fra IL2Q celle organer (Dauer spesifikke primære dendritter-1D °). Den dendrittiske vekst er ikke konstant, men i stedet karakterisert av både den dynamiske dannelse og tilbaketrekkingen av prosesser som er illustrert i figur 5. Den 2 ° og 1d ° dendritter generelt strekker seg til den ventrale (for IL2Vs) eller dorsal (for IL2Ds) midlines. Når Dauer hårstråene er helt atskilt fra det L2D hårstråene, fører bruk av fluorescerende lys på dyret for å rotere hurtig om sin lengdeakse, noe som gjør etterfølgende avbildning utfordrende. Forsøk på å fjerne utviklings dyret fra raset, mekanisk fjerne L2D skjellaget, og montere dyret på et nytt lysbilde samtidig opprettholde Dauer utvikling var ikke vellykket.

Figur 1. Crude Dauer feromon eren gul væske som kan lagres på ubestemt tid ved -20 ° C. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. DIC mikrografer av C. elegans dauers med typisk Dauer morfologiske egenskaper. (A) Dorsal midten av kroppen visning av en Dauer demonstrere en lukket stomi (pil) og en krympet svelg med rektangulær terminal pære (uthevet i rødt, sammenlign med L2 larve vist i figur 4A). Nydannede dauers vil ofte holde tilbake deler av L2D hårstråene (pilspiss). (B) Dorsal visning av hypodermis viser svært refraktile legemer (pil) typisk for dauers. Igjen L2D hårstråene er tydelig (pilspiss). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Dose respons analysen til rå Dauer feromon. L1 dyr eksponert for økende nivåer av Dauer feromon innlemmet i endret NGM medier er mer sannsynlig å danne dauers. Data ble oppsamlet fra to separate forsøk, bortsett fra de følgende konsentrasjoner, som bare ble testet en gang: 0,05%, 2% og 4%. Data ble passe til en sigmoidal dose-responskurve. R ² og EC-verdiene ble beregnet ved bruk av logistisk regresjon. Den numbra av dyr ble undersøkt for hver konsentrasjon er som følger: 0% n = 299, 0,05% n = 81, 0,1% n = 352, 0,5% n = 368, 1% n = 241, 2% n = 125, 4% n = 155. Feil søylene representerer 95% konfidensintervall.

Figur 4. DIC lateral rettigheten Vis mikrografer av C. elegans under forskjellige stadier av molt inn Dauer. (A) L2 dyr med typiske avrundet terminal svelget pære (uthevet i rødt). (B) Omtrent tre timer etter molt inn Dauer, er terminalen pære krymper og L2D hårstråene begynner å løsne fra den nydannede Dauer hårstråene (pilspiss). (C) Omtrent 10 timer etter utbruddet av Dauer molt, har dyret gjennomgått omfattende radial krymping og løsrivelse fra L2D hårstråene (pilspiss). Av og til, den cuticle foret utførselskanal for L2D scenen (pil) kan sees fortsatt festet til utvikling Dauer. Scale barer, 10 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Lateral utsikt epifluorescent mikrografer av et enkelt dyr som uttrykker IL2 reporter P _klp-6 :: tdTomato. Top, full-lengde bilde av IL2 nevroner ca 3 timer etter utbruddet av molt inn Dauer. Inset viser del av IL2Q Dendritt på ulike tidspunkter etter utbruddet av molt inn Dauer. En rask utvidelse av IL2Q grener oppstår starter cirka 5 timers etter utbruddet av molt inn Dauer. Scale barer, 10 mikrometer.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

En undersøkelse av Dauer spesifikke nevroplastisitet og andre Dauer-forbundet morfologiske endringer krever kontrollert og pålitelig dannelsen av dauers enten gjennom genetisk mutasjon (dvs., DAF-c mutanter) eller ved eksponering av vill type dyr til feromon. Mens bruken av en genetisk mutasjon for å indusere dauers er fordelaktig, kan det forvirre resultater. Derfor data samlet inn med daf-c mutasjoner skal senere bekreftet med vill-type dyr talt til å gå inn i Dauer scenen ved eksponering for Dauer feromon.

Produksjonen av råolje Dauer feromon er relativt enkel og varianter av denne protokollen er publisert ^18. Med det mulige unntak av forurensning, idet fremgangsmåten er presentert her er svært pålitelig. For å produsere ekstrakt, bruker vi en standard metode for dyrking store tettheter av nematoder i S media flytende kultur ^19. Det er en stor mengde fleksibilitet i mengden innledetl nematode inokulum tilsettes til den flytende kulturen. Fra og med større antall nematoder vil fremskynde prosessen. Det er imidlertid viktig å sikre at alt av den innledende nematode inokulum er fri for forurensninger. Både sopp-og bakteriell forurensning kan oppstå under vekst i flytende medium. Soppforurensning kan lett oppdages ved tilstedeværelse av hyfer. Bakteriell forurensning er vanskeligere å vurdere. Vanligvis er en bakteriell forurensning kan observeres dersom væskekultur ikke fjerner snart etter de nevnte inkubasjonsperioder. Det er fleksibilitet i total nematode befolkningstetthet trengs for å produsere tilstrekkelig feromon. For eksempel, er tilstrekkelig til å produsere et feromon effektiv til å indusere dauers en konsentrasjon på 25.000 nematoder / ml. En alternativ metode består i å overføre de nematoder fra en flytende kultur til et lite volum av M9 buffer (~ 50 ml) etterfulgt av en O / N inkubering ved RT på en orbital shaker og etterfølgende rensing av den pheromone ved fremgangsmåtene beskrevet heri. Dette alternativ er effektive, men gir et feromon med en høyere EC ₅₀ (dvs. mindre potent).

Ettersom hver batch av råolje feromon kan variere i styrke, er det viktig å teste en subsample for effektivitet i å indusere Dauer. For mange anvendelser en enkelt bioanalyse med en replikat for hver feromon konsentrasjon er tilstrekkelig til å gi en generell estimat av styrken. Imidlertid kan det være betydelig variasjon mellom selvstendig utført dose-respons bioassay. Derfor, hvis eksperimenter kreve en delikat balanse mellom Dauer dannelse og ikke-Dauer utvikling, vil det være nødvendig å utføre 2-3 gjentatte biologiske tester for å bestemme en nøyaktig effektiv dose. I fremtiden, som betydningen av ascarosides i nematode biologi er mer anerkjent, kan det være mulig å kjøpe syntetisert Dauer feromon til rimelig pris.

Funn av Dauer spesifikke neuRonal ombygging i IL2s gir en plattform for å studere molekylære mekanismer for stress-indusert nevroplastisitet. For å identifisere den mekanismen som spesifikke gener som regulerer neuroplasticity, kan det være nødvendig å følge ombygging prosessen i sann tid. Fremgangsmåte IL2 in vivo avbildning bygger på tidligere C. elegans metoder ^{22, 24, 25.} Ett hinder for bildebehandling under Dauer formasjonen er muligheten for Dauer utvinning. Den enkleste løsningen er å først bruke en daf-c mutasjon. Bekreftelse av noen resultater kan deretter utføres i et ikke-daf-c bakgrunnen ved hjelp av metodene beskrevet heri.

Singh og Sulston bemerket flere hindringer for in vivo avbildning av Dauer formasjonen ^25. Disse inkluderte nydannede dauers rømmer av objektglass og ukontrollert bevegelse etter radial krymping. Bruk av mikrosfære perler har eliminert muligheten for flukt ^22. However radial svinn som oppstår ca 10 t inn i Dauer molt fortsatt skaper vanskeligheter for senere bildebehandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving