В естественных изображений из Dauer конкретным нейронов ремоделирования в C. Элеганс

Abstract

Механизмы, контролирующие вызванное стрессом фенотипическую пластичность у животных часто сложным и трудным для изучения в естественных условиях. Классическим примером индуцированной стрессом пластичности является этап Dauer из C. Элеганс. Dauers являются альтернативой развития личиночной стадии формируются в условиях низких концентраций бактериальной пищи и высоких концентраций DauER феромона. Dauers отображения обширный развития и поведения пластичность. Например, набор из четырех внутренний-губной квадранте (IL2Q) нейроны претерпевают обратимое обширную реконструкцию в процессе формирования DauER. Используя известную запись экологические тропы регулирования DauER, ранее установленного способа для производства сырой DauER феромона от крупномасштабных жидкость нематод культур демонстрируется. С помощью этого метода, концентрации 50000 - 75000 нематоды / мл жидкой культуры является достаточным для получения высокой активностью сырой DauER феромон. Сырой феромон потенция Determined по биоанализе доза-реакция. Наконец, методы, используемые для в естественных условиях покадровой съемки из IL2Qs при формировании DauER описаны.

Introduction

Фенотипический пластичность, в том числе развития и состояния психического пластичности, имеет важное значение для адаптации к неблагоприятным условиям окружающей среды и считается движущей силой в эволюции ^1. C. Элеганс является модельным организмом часто используются для исследований в области развития и нейробиологии. В идеальных условиях, C. Элеганс развивается через четыре личиночной стадии перед входом в репродуктивной стадии взрослого. Тем не менее, в условиях низкой доступности пищи и высокой плотностью населения, C. Элеганс могут пройти переключатель с развитием и войти в долгоживущих и стресс-устойчивых этапе DauER ^2. Dauers отображать несколько морфологических и поведенческих отличий от не-dauers что, вероятно, опосредующие этот стрессоустойчивость. Экологические сигналы и генетические пути, регулирующие въезд DauER широко описаны ^{3, 4, 5, 6, 7.} Однако молекулярные механизмы, контролирующие отдельные изменения фенотипических которые происходят Dформирование рительными Dauer менее понятны.

Изучение DauER конкретных фенотипов требует производства DauER животных. Это может быть достигнуто тремя способами: 1) Выбор из голодали культуры C. Элеганс, 2) Использование образования DauER конститутивный (DAF-с) мутантов, 3) индукции формирования DauER через очищенной феромона. Это довольно просто подобрать dauers от стандартного NGM пластины с C. население Элеганс, которая исчерпала свой ​​бактериальный продовольственную. В наших руках, стандартный NGM пластины первоначально высевают с 50 мкл OP50 кишечной палочки, могут расти в течение 3 дней, а затем, привитых 3 - 4 взрослых гермафродитов выдерживали при 25 ° С исчерпает поставку продовольствия в течение одной недели и производить несколько тысяч dauers пределах дополнительных 3 дней (в дополнение к многочисленным голода не-dauers). Тем не менее, этот способ является неудовлетворительным для анализа процессов, происходящих во время линьки в DАуэр. Трудно определить, какой из нескольких тысяч животных на типичного голодали пластины вступаем в Dauer. Кроме того, использование голодали пластины не дает возможность синхронизации. Использование DAF-с-мутантов позволяет синхронизации и надежной генерации dauers. Тем не менее, нет никакой гарантии, что конкретный DAF-C мутации не влияют на другие DauER конкретного фенотипа отдельно или в сочетании с дополнительными мутаций.

Наличие DauER феромона впервые подразумевается Cassada и Рассела и позже показали Золотой и Риддл. Dauer феромона с тех пор были химически охарактеризован ^{2, 8, 9, 10.} Очищенный феромона состоит из сложной смеси ascarosides, которые в различных формах регулировать как поведенческие и развития процессов ^{9, 11.} Использование сырой экстракт DauER феромонов позволяет надежно контролируется индукция синхронизированных dauers в фоновом режиме дикого типа. Нервная система и связанные глиальные клетки подвергаются ремоделирования во DauER личинки образования ^{12, 13, 14.} Некоторые из этих изменений являются необратимыми, таких как ремоделирования глиальные клетки во время Dauer ^{13, 14.} Тем не менее другие ремоделирования события обратимы после возвращения к благоприятным экологические условия. Например, набор из четырех IL2Q нейронов подвергаются быстрому и обратимое нейронов ремоделирования при формировании DauER включая: дендритов разветвление, перехода от одного дендритных к multidendritic нейроны и аксоны реконструкции ^12. Здесь методы позволяют для надежной визуализации в естественных условиях стресс-индуцированной нейропластичностью в качестве модельного организма. Методы, представленные для производства и тестирования сырой DauER феромона предварительно описано и составлена ​​из нескольких источников ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1 Сырая Dauer Феромоны Производство

1. Вырастить OP50 Е. палочки из одной колонии O / N при 37 ° С при встряхивании в 100 мл LB бульоне при 200 оборотах в минуту. Примечание: Эта O / N. культуры могут быть сделаны заранее и хранили при 4 ° С.
2. Вырастить N2 C. Элеганс на 15 - 20 6 см чашки Петри с NGM агар (Просмотреть рецепт в таблице 1), засеянного с 50 мкл OP50 Е. палочка до бактерий не близок к исчерпанию ^19.
3. Сделать 5x 250 мл S СМИ (см рецепт в таблице 1) в 1 л конических колб ^19. Примечание: Это решение может быть сделано заблаговременно.
4. Вырастить культуру OP50 Е. палочка в 4 л LB бульоне O / N путем посева 1 мл OP50 в Е. палочка и перемешиванием при 37 ° С в течение 16 часов.
5. Вымойте нематод из пластин (шаг 1.2) с 1 мл S базальной решения (см рецепт в таблице 1) и передачи нематод из 4-5 пластин в каждую из 4 1 L колбы Эрленмейера со СМИ S, полученного на стадии 1.3 (4 5 пластиндля каждой колбы) ^19.
6. Центрифуга OP50 с шага 1,4 при 650 мкг в течение 10 мин и удалить супернатант. Ресуспендируют каждый бактериальных гранул в 10 мл базальной решения S. Передача равные количества бактерий ресуспендировали в каждую колбу нематод.
7. Поместите колбы на орбитальном шейкере при комнатной температуре (20 - 25 ° C) и 100 - 150 оборотов в минуту в течение 4 - 5 дней, пока раствор не начнет очистить, что указывает на истощение пищи.
8. Как только еда будет исчерпан, вырасти еще на O / N культуру OP50 Е. палочка в 4-кратным 1 л LB бульоне. Центрифуга бактерии при 650 х г в течение 10 мин и добавляют гранулы из одной колбе с каждой из медиа-S колбы с нематодами. Верните S медиа колб в орбитальном шейкере, как на стадии 1.7, в течение еще 3-4 дней, пока еда не будет снова исчерпаны.
9. Возьмем ~ 1 мл аликвоты раствора из каждой колбы и оценить концентрацию нематод путем подвыборки 1 мкл из каждого 1 мл аликвоты и подсчета количества нематод. ПРИМЕЧАНИЕ:нематода население должно быть 50 000 - 75 000 нематоды / мл. При этой концентрации большинство нематод dauers.
10. Откажитесь от любых загрязненных колб. ПРИМЕЧАНИЕ: Загрязнение часто проявляется как гиф гриба видели на этапе 1.9.
11. Центрифуга нематоды при 4000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Откажитесь от нематод осадок и сохранить супернатант. Кроме того, смотрите обсуждение для использования этих животных, чтобы сделать низкой потенции феромон.
12. Фильтр супернатанта через # 1 Whatman фильтровальной бумаги. ПРИМЕЧАНИЕ: Термос будет ускорить этот процесс.
13. Далее фильтр супернатант через фильтрующих блоков 0,45 мкм стерильный вакуума. ПРИМЕЧАНИЕ: фильтрата может быть O / N при 4 ° С или перейти к 1,14.
14. Добавить фильтрата до 2 л химический стакан с мешалкой. Поместите в вытяжной шкаф на отопление мешалки. Доведите до кипения при помешивании и выпаривают примерно 200 мл. Передача раствора до 500 мл химический стакан. Продолжить кипения до примерно 50 мл не ле. футов ПРИМЕЧАНИЕ: Следует проявлять осторожность во время этого шага, как это возможно для решения кипеть. Цвет готового 50 мл представляет собой темно-коричневый. В любое время в процессе приготовления, тепло может быть выключен и фильтрат хранятся O / N при комнатной температуре или температуре 4 ° С.
15. Остудите и центрифуги в течение 5 мин при 1000 х г. Налейте супернатант в мл стакан 100 и отбросить гранул.
16. Варить супернатант до коричневой корочки. Снять с огня и разбить корку с помощью шпателя. Добавьте достаточное количество 200 этанол пробы для покрытия корку. Стакан накрывают парафильмом и оставьте O / N при комнатной температуре. Вылейте этанола в чистую стакан и положил в сторону. Добавить свежий этанол, чтобы покрыть кору. Повторите O / N экстракции 3 раза. Бассейн выдержки.
17. С помощью вакуумного насоса, чтобы высушить этанола экстрактов. Если вакуумный насос не доступен, добавить экстракт этанола в чистом химическом стакане и теплой до 50 ° С при перемешивании в вытяжном шкафу. ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как этанол испарится липких следов на лIGHT коричневый цвет должен оставаться. Если используется отопление, следует позаботиться, чтобы не сжечь решение при нагревании слишком долго.
18. Остаток растворяют в 10 мл дистиллированной стерильной воды. Фильтр стерилизовать это решение с шприцевой фильтр 0,22 мкм и хранить при температуре -20 ° С в 1 мл аликвоты. Примечание: 1 мл воды используется для растворения остатка на каждые 100 мл исходного жидкой культуры нематод. Например, если один из жидких культуральных колбах отбрасывают вследствие загрязнения, а затем регулировать количество воды, используемой для растворения остатка.

2 Определение феромона дозы Response

1. Подготовьте DauER феромон, сделав 6x 5 мл NGM СМИ с Noble агар, без пептона, и с добавлением 50 мкг / мл стрептомицина сульфата и ряд DauER феромона (см рецепт в таблице 1) ^{4, 19.} Смешайте компоненты в 13x100 мм культура трубка стекла, кипятить над горелкой Бунзена, а затем влить в 3 см чашках Петри.
2. Взвесьте утраicrocentrifuge трубки. Добавьте 1 мл O / N культуры Е. палочка OP50 к трубе и центрифуги при ~ 17000 мкг в микроцентрифужных трубки. Удалить все супернатанта. Взвесьте трубку снова и определить вес бактериальной гранул. Ресуспендируют гранул с М9 буфера (Смотреть рецепт в таблице 1) для конечной концентрации 4% ^(вес / _объем). Аликвоты по 10 мкл бактериальной суспензии на центр каждого феромонов пластины ^4. Храните пластины O / N при комнатной температуре.
3. Подберите 10-15 беременных N2 гермафродиты дикого типа на следующий день после линьки во взрослую жизнь на феромонных пластин ^4. Хранить пластин при 25 ° С в течение 3 - 4 часов.
4. Отслойка все взрослые гермафродитов. Запишите количество яиц, отложенных для каждой пластины. Уплотнение пластин парафильмом и возврата до 25 ° С в течение 3 дней ^17.
5. Подсчитайте процент dauers (рисунок 2). Примечание: Для обоих методов важно отметить, что dauers (и, в меньшей EXпалатка не-dauers) будет подниматься вверх по стенам и на крышке чашки Петри. Поэтому важно изучить все поверхности блюдо для нематод.
6. Установите данные в кривой доза-реакция и оценить концентрацию феромона EC ₉₀ (достаточной феромона, чтобы вызвать 90% животных, чтобы сформировать dauers), как показано на рисунке 3. Примечание: Обычно мы используем модели логистической регрессии для оценки EC ₉₀ , но различные статистические программные пакеты могут иметь альтернативные методы, которые производят аналогичные оценки.

3 Живая съемка DauER IL2 нейронов

1. Подготовьте Dauer феромона пластины, как в протоколе 2 используя значение EC ₉₀ определено на этапе 2.6.
2. Вызвать dauers с использованием методов в протоколе 2 с напряжением балансовой интегрированный IL2 репортер трансгенов (myIs13 [P _KLP-6 :: GFP], myIs14 [P _KLP-6 :: GFP], myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] или qIs56 [P _{отставание-2} :: GFP]) ^{12, 20, 21.} ПРИМЕЧАНИЕ: Если д Is56 используется, выражение GFP не будут видны в IL2Qs до нескольких часов в Dauer линька и некоторые из первоначальных событий ремоделирования не будет видно. Кроме того, в то время как флуоресцентный сигнал от P _лаг-2 :: GFP трансгена в конечном счете ярче в IL2s во Dauer чем P _KLP-6 люминесцентных журналистами, P _{отставание-2} :: GFP трансгенов также выражает слабо в головных мышц, которые может маскировать мелкие ветви IL2.
3. После откладки яиц, удалите взрослых гермафродитов, печать пластин с парафильмом и выдержать в течение 34 ч при 25 ° С ^17. ПРИМЕЧАНИЕ: Длина и время на DauER линьки слегка варьируется в зависимости от физических лиц. Самый быстрый период дендритов разветвление начинается 4 - 5 ч после начала DauER линьки (39 - 44часов после откладки яиц при 25 ° C) ^12.
4. За день до обработки изображений, составляют раствор 10% ^(вес / _объем) агарозном в буфер М9 с DauER феромона при концентрации EC _90. Алиготе примерно 100 мкл агарозы на А стекло микроскопа и быстро, но осторожно, поместите другую слайд на вершине, чтобы создать плоскую агарозном поверхность. После агарозном укрепил, обернуть слайды в Саран обернуть и хранить в камере влажности (пипетки коробки влажными бумажными полотенцами).
5. После 34 ч инкубационного периода, изучить феромона пластины для нематод, которые остановили глотки накачку. Отдельные скользит таким образом, что только одна поверхность одного слайда имеет агарозы на нем. Выбор одного или нескольких нематод на 10% агарозном площадку и 1 μ л 0,1 микрона полистирольных шариков ^22. ПРИМЕЧАНИЕ: С хорошо синхронизированы населения, большинство нематод на тарелке будет входить в линьки от L2D в Dauer. Тем не менее, могут быть вариации между Individuals. Поэтому важно отметить дополнительные функции (Стома окклюзии, глотки ремоделирования) оценить количество времени животные были в DauER линьки (см репрезентативные результаты, например).
6. Определите ориентацию (левый / правый, спинной / вентральной) нематоды. Захват изображений Z-стек с IL2Q дендрита в 100-кратном увеличении с минимально возможной интенсивности флуоресценции каждые 15 мин или по мере необходимости для конкретного эксперимента. Продолжить съемку фотографий, пока нематода не отделена от кутикулы L2D и иммобилизация невозможно или если животное восстанавливается после Dauer (глотки начинает насосных). Когда не активно визуализации, поместите слайд в камере влажности. ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем эпифлуоресцентной микроскопа с моторизованным этап и дифференциального интерференционного контраста (DIC) оптики.

Representative Results

Производство результатов сырой Dauer феромонных в желтой жидкости (рисунок 1), что является одновременно тепло и холод стабильной. Аликвоты сырого феромона хранятся при температуре от -20 ° С до бесконечности без очевидного потери активности. После производства феромона, один биологический анализ доза-реакция достаточно для грубой оценки потенции. Тем не менее, для большинства экспериментов необходимо повторить биопроб 2 - 3 раза и занимает в среднем от каждого эксперимента. Типичные результаты двух феромонов биоанализа приведены на рисунке 3. Из этих данных ЕС ₅₀ и EC ₉₀ может быть вычислена.

В дополнение к устойчивости к додецилсульфата натрия ^2, dauers могут быть признаны несколько морфологических особенностей, включая окклюзии стомы, латеральными крыльями, рефрактильных органов в передних гиподерме и усохшие глотки (рис 2 и рисунке 4A FOЛичинки R L2). Dauers также есть несколько отличительных поведенческих характеристик в том числе:. Склонность оставаться поведенчески покоя, при наличии случайной стратегии разгона под названием nictation, подавление движений головы нагула, подавление глотки накачки и индукции выводной проток пульсирующего ^{2, 5, 23} поведенческие характеристики показывают вариабельность.

Линька в Dauer занимает около 12 ч с момента окончания предварительного DauER L2 стадии ⁽⁴⁾ L2D. Этот период соответствует стереотипным роста IL2Q беседок. Первым заметным событием линьки в Dauer является подавление глотки накачки. Подавление накачки является общим для всех линьки в C. Элеганс. Однако подавление глотки перекачки продолжается в течение всего этапа DauER и заканчивается примерно 4 ч следующую возвращения животного к благоприятной экологической обстановки. В начальный период глоточной накачкойподавление, слой кутикулы форм над стомы. Эти изменения происходят в течение первого часа после начала линьки в Dauer. В течение этого начального периода существует часто формирование дополнительного нейритов процесса, простирающейся от IL2Q клеточных тел. Тем не менее, этот первоначальный дополнительный процесс, как правило, втягивается в течение 2 ч после начала линьки в Dauer ^12.

Во время часов 2 - 5 следующих наступлением линьки в Dauer глотки начинает переделывать показывая постепенное уменьшение размера (Рисунок 4B). Одновременно, короткая форма Puncta и убрать по первичной дендрита IL2Q (рисунок 5). Во время часов 4 - 8 следующих наступлением линьки, тело претерпевает постепенное радиальную усадку, что приводит к отгибании нематоды от L2D кутикулы (Рисунок 4C). Этот период соотносится с вырост 2 ° дендритов от первичных дендритов и установленияопо лни тельная дендриты от IL2Q клеточных тел (Dauer конкретных первичных дендритов-1D °). Дендритных рост не является постоянной, а характеризуется как динамического формирования и втягивания процессов, как показано на рисунке 5. 2 ° и 1г ° дендритов обычно распространяется на вентральной (для IL2Vs) или спинной (для IL2Ds) средних линий. После Dauer кутикула полностью отделена от кутикулы L2D, применение флуоресцентного света вызывает животное быстро вращаться на своей продольной оси, что делает последующее изображений сложным. Попытки извлечь проявляющее животное от слайда, механически удалить кутикулу L2D, и смонтировать животное на новом слайде, сохраняя развитие DauER не увенчались успехом.

Рис.1 Сырая Dauer феромонов являетсяжелтая жидкость, что может храниться бесконечно при -20 ° С. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Фигура 2 DIC микрофотографии C. Элеганс dauers с типичным DauER морфологических особенностей. вид () Спинной середины тело Dauer, демонстрируя окклюдированной стомы (стрелка) и усохших глотку с прямоугольной терминала лампочки (обведена красным, сравнить с L2 личинки, показанном на рисунке 4A). Недавно сформированные dauers будет часто сохраняют часть кутикулы L2D (стрелки). (B) Dorsal вид подкожного слоя, показывая весьма рефрактильные органы (стрелка) типичны dauers. Опять кутикула L2D очевидно (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 Доза ответ анализа на сырую DauER феромона. L1 животные подвергаются повышение уровня DauER феромона включены в модифицированной НГМ СМИ, скорее всего, сформировать dauers. Данные были собраны и объединены с двух отдельных экспериментах на следующих концентрациях, которые были испытаны только один раз, за ​​исключением: 0,05%, 2% и 4%. Данные были пригодны для сигмоидальной кривой доза-ответ. Значения R ² и EC были рассчитаны с использованием логистической регрессии. Нумбра из исследованных животных для каждой концентрации выглядит следующим образом: 0% N = 299, 0,05% N = 81, 0,1% N = 352, 0,5% N = 368, 1% N = 241, 2% N = 125, 4% N = 155. Усы представляют 95% доверительных интервалов.

Рисунок 4 DIC боковая справа Вид микрофотографии C. Elegans на разных стадиях линьки в Dauer. (А) L2 животных с типичной округлой терминала глотки лампы (описанной в красный цвет). (В) Приблизительно 3 ч после линьки в Dauer, терминал лампы сокращается, а кутикула L2D начинает отделяться от новообразованной DauER кутикулы (стрелки). (с) приблизительно 10 ч после начала в DauER линьки животное подвергся обширной радиальную усадку и отрешенность от кутикулы L2D (стрелки). Иногда, кутикула выстроились выводной проток из стадии L2D (стрелка) можно увидеть еще привязаны к развивающейся Dauer. Шкала баров, 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 Вид сбоку эпифлуоресцентной микрофотографии одного животного, выражающей IL2 репортер P _KLP-6 :: tdTomato. Лучшие, полнометражные образ IL2 нейронов примерно 3 часа после начала линьки в Dauer. Вставка показывает часть IL2Q дендрита в различных временных точках после начала линьки в Dauer. Быстрое расширение IL2Q ветвей происходит начиная примерно 5 ч после начала линьки в Dauer. Шкала баров, 10 мкм.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Экспертиза DauER конкретных нейропластичностью и других DauER связанных морфологических изменений требует контролируется и надежный формирование dauers либо с помощью генной мутации (т.е., DAF-с-мутантов) или воздействия животных дикого типа к феромона. В то время как использование генетической мутации, чтобы вызвать dauers удобно, он может путать результаты. Поэтому данные, собранные с DAF-с мутациями должны быть впоследствии подтвержден с животных дикого типа индуцированных на сцену DauER воздействием DauER феромона.

Добыча сырой DauER феромона является относительно простым и вариации этого протокола опубликованы ^18. С возможным исключением загрязнения, метод, представленный здесь очень надежным. Для получения экстракта, мы используем стандартный метод культивирования больших плотностей нематод в жидкой культуре S СМИ ^19. Существует большое количество гибкости в количестве INITIAл посевной нематод добавлены к жидкой культуре. Начиная с большего числа нематод ускорит процедуру. Тем не менее, важно, чтобы гарантировать, что все исходного посевного материала нематод свободна от загрязнений. Оба грибковые и бактериальные загрязнения могут возникнуть в ходе роста в жидких средах. Грибковые загрязнение может быть легко обнаружена в присутствии гиф. Бактериальное загрязнение труднее оценить. Обычно бактериальная загрязнителем может наблюдаться, если жидкость культура не очистить вскоре после перечисленных инкубационных периодов. Существует определенная гибкость в общей плотности поселения нематод, необходимого для производства достаточного феромон. Например, концентрация 25000 нематоды / мл является достаточным для получения эффективного феромон в индукции dauers. Альтернативный способ состоит в передаче нематод из жидкой культуры в небольшом объеме буфера M9 (~ 50 мл) с последующим O / N инкубации при комнатной температуре на орбитальном шейкере и последующей очистки Pheromone помощью методов, описанных в данном документе. Этот вариант является эффективным, но вызывает феромон с более высоким EC ₅₀ (то есть, менее активен).

В каждой партии сырой феромона может отличаться в потенции, важно, чтобы проверить подвыборки для эффективности в стимулировании DauER. Для многих применений одного биоанализа с одним репликации для каждой концентрации феромона является достаточным, чтобы обеспечить общую оценку активности. Тем не менее, может быть существенная разница между независимо проведенных биопроб доза-реакция. Таким образом, если эксперименты требуют тонкий баланс между образованием DauER и развития не-DauER, необходимо будет выполнить 2 - 3 дублирующие биоанализа, чтобы определить точную эффективную дозу. В будущем, как важность ascarosides в нематоды биологии более широкое признание, это может быть возможным, чтобы купить синтезированный DauER феромон по разумной цене.

Нахождение DauER конкретных NeuRonal ремоделирования в IL2s предоставляет платформу для изучения молекулярных механизмов стресс-индуцированной нейропластичностью. Чтобы определить механизм, посредством которого специфические гены регулировать нейропластичность, это может быть необходимо, чтобы следить за процессом ремоделирования в режиме реального времени. Метод IL2 в естественных изображений основывается на предыдущем C. методы Элеганс ^{22, 24, 25.} Одним из препятствий для визуализации при формировании DauER является возможность восстановления DauER. Самым простым решением является изначально использовать DAF-C мутацию. Подтверждение любых результатов, то может быть выполнена в не DAF-с фоном, используя методы, описанные в данном документе.

Сингх и Салстон отметил несколько препятствий для визуализации в естественных условиях формирования DauER ^25. К ним относятся новообразованные dauers побега от микроскопа и неконтролируемому перемещению следующий радиальной усадки. Использование микросфер бисером устранила возможность побега ^22. Хоувер радиальной усадки, которая происходит примерно 10 ч в DauER линьки еще создает трудности для последующей визуализации.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving