Neuroscience

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

Published: September 4, 2014 doi: 10.3791/51834

¹Department of Crop Sciences, University of Illinois Urbana-Champaign

Abstract

آليات السيطرة على الإجهاد الناجم عن المظهرية اللدونة في الحيوانات كثيرا ما تكون معقدة وصعبة للدراسة في الجسم الحي. والمثال الكلاسيكي من التوتر الناجم اللدونة هي المرحلة داور من C. ايليجانس. Dauers هي مرحلة اليرقات التنموية البديلة تشكلت في ظل ظروف تركيزات منخفضة من المواد الغذائية البكتيرية وتركيزات عالية من فرمون داور. عرض Dauers اللدونة التنموية والسلوكية واسعة النطاق. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة رباعي الداخلية-شفوي (IL2Q) الخلايا العصبية تخضع لإعادة عكسها واسعة خلال تشكيل داور. الاستفادة من دخول مسارات بيئية تنظيم داور معروفة، وهي طريقة المحددة سابقا لإنتاج النفط الخام داور من فرمون على نطاق واسع الثقافات الخيطية السائلة ويتجلى. مع هذا الأسلوب، وهو تركيز 50،000 - 75،000 الديدان الخيطية / مل من ثقافة السائل كافية لإنتاج قوية للغاية داور الخام فرمون. رجولية فرمون الخام هي DETErmined من قبل الأحيائي الاستجابة للجرعة. وأخيرا، يتم وصف الأساليب المستخدمة لفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير من خلال تشكيل IL2Qs داور.

Introduction

اللدونة المظهري، بما في ذلك اللدونة التنموية والسلوكية، مهم لعمليات التكيف مع الظروف البيئية المعاكسة وتعتبر قوة دافعة في التطور ^1. C. ايليجانس هو كائن نموذج كثيرا ما تستخدم للدراسات في التنمية وبيولوجيا الأعصاب. في ظل ظروف مثالية، C. ايليجانس يتطور من خلال أربع مراحل اليرقات قبل دخول المرحلة الإنجابية الكبار. ومع ذلك، في ظل ظروف انخفاض توافر الغذاء والكثافة السكانية العالية، C. ايليجانس يمكن أن يخضع لعملية التحول التنموي والدخول في معمرة ومقاومة للإجهاد مرحلة داور ^2. عرض Dauers العديد من الاختلافات الشكلية والسلوكية من غير dauers، والتي من المرجح توسط هذه المقاومة الإجهاد. كانت العظة البيئية والوراثية التي تنظم مسارات دخول داور وصف على نطاق واسع ^{3، 4، 5، 6، 7،} إلا أن الآليات الجزيئية التي تتحكم في التغيرات المظهرية الفردية التي تحدث دأقل مفهومة جيدا تشكيل داور خلال شهر.

دراسة الظواهر داور محددة يتطلب إنتاج الحيوانات داور. ويمكن تحقيق ذلك من خلال ثلاث طرق: 1) اختيار من ثقافة محرومة من C. ايليجانس، 2) استخدام داور تشكيل التأسيسية (داف ج) المسوخ، 3) تحريض تشكيل داور من خلال فرمون تنقيته. أنها بسيطة نسبيا لاختيار dauers من لوحة NGM القياسية مع C. السكان ايليجانس أن استنفد البكتيرية الإمدادات الغذائية لها. في أيدينا، وهي لوحة NGM القياسية المصنفة أصلا مع 50 ميكرولتر من OP50 القولونية، سمح لتنمو لمدة 3 أيام، وبعد ذلك تلقيح مع 3 - 4 المنحرفين الكبار أبقى عند 25 درجة مئوية واستنفاد الإمدادات الغذائية في غضون أسبوع وإنتاج عدة آلاف dauers في غضون 3 أيام إضافية (بالإضافة إلى العديد من تجويع غير dauers). ومع ذلك، وهذه الطريقة غير مرضية لعمليات فحص تحدث أثناء تساقط في دأوير. فإنه من الصعب تحديد أي من عدة آلاف من الحيوانات على لوحة تجويع نموذجية ندخل داور. وعلاوة على ذلك استخدام لوحة تجويع، لا يقدم أي إمكانية للتزامن. استخدام داف ج المسوخ يسمح لمزامنة والجيل موثوق بها من dauers. ومع ذلك، ليس هناك ما يضمن أن سوف معينة داف ج طفرة لا تؤثر الظواهر الأخرى داور الخاصة وحدها أو بالاشتراك مع الطفرات إضافية.

وقد ضمنا وجود فرمون داور أول من Cassada وراسل وأظهرت في وقت لاحق من قبل الذهبي وريدل. فرمون داور منذ ذلك الحين اتسمت كيميائيا ^{2، 8، 9، 10.} يتكون فرمون تنقيته من مزيج معقد من ascarosides، التي تنظم في أشكال مختلفة سواء العمليات السلوكية والتنموية ^{9 و 11.} استخدام استخراج فرمون داور الخام يسمح لل الحث موثوق رقابة من dauers متزامنة في الخلفية من النوع البري. الجهاز العصبي والخلايا الدبقية المرتبطة الخضوع لإعادة تشكيل داور خلال ^{12 و 13 و 14} يرقة. بعض هذه التغيرات لا رجعة فيها، مثل إعادة الخلايا الدبقية خلال داور ^{13 و 14،} ولكن غيرها من الأحداث هي إعادة عرض عكسها على العودة إلى مواتية الظروف البيئية. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة الخلايا العصبية IL2Q الخضوع لإعادة الخلايا العصبية السريع وعكسها خلال تشكيل داور بما في ذلك: تشجر تغصناته، والتحول من واحد إلى شجيري الخلايا العصبية محوار multidendritic وإعادة ^12. الطرق تسمح هذه الوثيقة لموثوق التصوير في الجسم الحي من التوتر الناجم المرونة العصبية في كائن نموذج. الأساليب المقدمة للإنتاج واختبار داور فرمون الخام موصوفة سابقا وتجميعها من عدة مصادر ^{4، 8، 15، 16، 17، 18.}

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الخام داور إنتاج فرمون

تنمو OP50 E. القولونية من مستعمرة يا واحد / N عند 37 درجة مئوية في حين تهتز في 100 مل من مرق LB عند 200 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يمكن إجراء هذا O / N ثقافة مسبقا وتخزينها في 4 درجات مئوية.
تنمو N2 C. ايليجانس في يونيو 15-20 سم أطباق بتري مع NGM أجار (انظر الوصفة في الجدول 1) المصنف مع 50 ميكرولتر من OP50 E. حتى البكتيريا القولونية يتم استنفاد ما يقرب من ^19.
جعل 5X 250 مل من وسائل الإعلام S (انظر الوصفة في الجدول 1) في 1 L قوارير مخروطي ^19. ملاحظة: يمكن إجراء هذا الحل مقدما.
تنمو ثقافة OP50 E. القولونية في 4 لتر من مرق LB O / N، فحقن مع 1 مل من OP50 في E. القولونية وتهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
غسل الديدان الخيطية من لوحات (الخطوة 1.2) مع 1 مل من محلول S القاعدية (انظر الوصفة في الجدول 1) والديدان الخيطية نقل 4-5 لوحات في كل من 4 1 L قوارير مخروطي مع وسائل الإعلام S أعدت في الخطوة 1.3 (4- 5 لوحاتلكل قارورة) ^19.
الطرد المركزي OP50 من الخطوة 1.4 في 650 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالة طاف. و resuspend كل بيليه الجرثومي في 10 مل من محلول S القاعدية. نقل كميات متساوية من البكتيريا معلق على كل قارورة من الديدان الخيطية.
وضع قوارير على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة (20 - 25 ° C) و100-150 دورة في الدقيقة لمدة 4 - 5 ايام حتى يبدأ الحل لمسح، مما يشير إلى استنزاف المواد الغذائية.
مرة واحدة يتم استنفاد المواد الغذائية، وتنمو ثقافة O / N آخر من OP50 E. القولونية في 4X 1 لتر من مرق LB. أجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 650 x ج لمدة 10 دقيقة وإضافة بيليه من قارورة واحدة إلى كل من قوارير S سائل الاعلام مع الديدان الخيطية. العودة القوارير S سائل الإعلام إلى شاكر المداري، كما في الخطوة 1.7، ل3-4 أيام إضافية حتى يتم استنفاد الطعام مرة أخرى.
نلقي ~ 1 مل قسامة من حل من كل قارورة وتقدير تركيز النيماتودا التي كتبها الفرعية أخذ العينات 1 ميكرولتر من كل 1 مل قسامة وتعول عدد من الديدان الخيطية. ملاحظة:يجب أن يكون السكان الخيطية 50،000 - 75،000 الديدان الخيطية / مل. في هذه تركيز غالبية الديدان الخيطية هي dauers.
تجاهل أي قوارير الملوثة. ملاحظة: يظهر التلوث في كثير من الأحيان كما خيوط فطرية ينظر خلال خطوة 1.9.
الديدان الخيطية الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه الخيطية والاحتفاظ طاف. بدلا من ذلك، انظر مناقشة لاستخدام هذه الحيوانات لجعل فرمون منخفضة رجولية.
تصفية طاف من خلال رقم 1 هتما التصفية. ملاحظة: سوف قارورة فراغ تعجيل هذه العملية.
وعلاوة على ذلك تصفية طاف من خلال 0.45 ميكرون وحدات الترشيح الفراغ العقيم. ملاحظة: رشح يمكن أن تظل O / N عند 4 درجات مئوية أو المضي إلى 1.14.
إضافة الراشح إلى دورق 2 لتر مع بقضيب. وضع في غطاء الدخان على لوحة التدفئة ضجة. تقديمهم ليغلي مع التحريك وتتبخر إلى حوالي 200 مل. نقل الحل إلى كوب 500 مل. تواصل المغلي حتى ما يقرب من 50 مل هي جنيهقدم ملاحظة: يجب توخي الحذر خلال هذه الخطوة لأنه من الممكن حل الغليان. لون النهائية 50 مل هو البني الداكن. في أي وقت أثناء عملية الطبخ، ويمكن أن تحول الحرارة قبالة والراشح تخزين O / N في RT أو 4 درجات مئوية.
السماح لتبرد وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،000 ز س. صب طاف في 100 مل كوب وتجاهل بيليه.
تغلي طاف وصولا الى القشرة البني. إزالة من الحرارة وتفريق القشرة مع ملعقة. إضافة الإيثانول 200 دليلا كافيا لتغطية القشرة. تغطية الكأس مع parafilm والسماح لها الجلوس O / N في RT. تخلصي من الايثانول في كوب نظيف ووضع إلى الجانب. إضافة الإيثانول النقي لتغطية القشرة. تكرار الاستخراج O / N 3 مرات. تجميع مقتطفات.
استخدام مضخة فراغ لتجفيف مستخلصات الايثانول. إذا مضخة فراغ غير متوفرة، إضافة إلى استخراج الإيثانول دورق نظيفة ودافئة إلى 50 درجة مئوية مع التحريك في غطاء الدخان. ملاحظة: عندما تبخرت الايثانول بقايا لزجة من لترينبغي أن تظل آيت اللون البني. إذا تم استخدام التدفئة، وينبغي الحرص على عدم حرق حل عن طريق التسخين لفترة طويلة جدا.
حل بقايا في 10 مل من الماء المعقم المقطر. فلتر تعقيم هذا الحل مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون وتخزينها في -20 درجة مئوية في 1 مل مأخوذة. ملاحظة: 1 مل من الماء يستخدم لإذابة بقايا لكل 100 مل من ثقافة الخيطية السائلة الأصلية. على سبيل المثال، إذا تم تجاهل واحد من قوارير ثقافة السائلة بسبب التلوث، ثم ضبط كمية المياه المستخدمة لإذابة بقايا.

2. تحديد الجرعة فرمون الاستجابة

إعداد داور فرمون بجعل 6X 5 مل من NGM مع وسائل الإعلام نوبل أجار، دون ببتون، وتستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ومجموعة من داور فرمون (انظر الوصفة في الجدول رقم 1) ^{4، 19.} اخلطي المكونات في 13x100 ملم الزجاج أنبوب الثقافة، وتغلي على موقد بنسن، ثم تصب في أطباق بتري 3 سم.
تزن صباحاأنبوب icrocentrifuge. إضافة 1 مل من O / N ثقافة E. القولونية OP50 إلى أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في ~ 17،000 x ج في أنبوب microcentrifuge. إزالة كافة طاف. وزن الأنبوب مرة أخرى وتحديد وزن بيليه البكتيرية. resuspend الكرية مع M9 عازلة (انظر الوصفة في الجدول 1) لتركيز النهائي من 4٪ ^(ث / _ت). قسامة 10 ميكرولتر من تعليق البكتيرية على مركز كل لوحة فرمون ^4. مخزن لوحات O / N في RT.
اختيار 10-15 حبلي N2 من النوع البري المنحرفين بعد يوم واحد تساقط في مرحلة البلوغ على لوحات فرمون ^4. تخزين لوحات عند 25 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة.
سلخ كل من المنحرفين الكبار. تسجيل عدد البيض الذي تضعه على كل لوحة. ختم لوحات مع parafilm والعودة إلى 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام ^17.
عد نسبة dauers (الشكل 2). ملاحظة: بالنسبة لكلتا الطريقتين من المهم أن نلاحظ أن dauers (وإلى أقل السابقوخيمة غير dauers) يتسلق الجدران وعلى غطاء من أطباق بتري. ولذلك فمن المهم أن تدرس جميع الأسطح الطبق لالديدان الخيطية.
تناسب البيانات إلى منحنى الاستجابة للجرعة وتقدير تركيز EC ₉₀ من فرمون (فرمون كافية لإحداث 90٪ من الحيوانات لتشكيل dauers) كما هو مبين في الشكل (3) ملاحظة: نحن عادة استخدام نموذج الانحدار اللوجستي لتقدير EC ₉₀ ، ولكن حزم البرامج الإحصائية المختلفة قد يكون لها طرق البديلة التي تنتج تقديرات مماثلة.

3. تصوير لايف من داور IL2 الخلايا العصبية

إعداد لوحات داور فرمون كما في بروتوكول 2 باستخدام القيمة EC ₉₀ تحديدها في الخطوة 2.6.
حمل dauers باستخدام الأساليب في بروتوكول 2 مع سلالة تحمل متكامل IL2 مراسل التحوير (myIs13 _{[P-6 KLP} :: GFP]، myIs14 _{[P-6 KLP} :: GFP]، myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] أو qIs56 _[P-2 :: _تأخر GFP]) ^{12، 20، 21} ملاحظة: إذا تم استخدام ف Is56، والتعبير عن GFP لا تكون مرئية في IL2Qs حتى عدة ساعات في تساقط داور وبعض الأحداث إعادة الأولية لا تكون مرئية. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن إشارة الفلورسنت من _{تأخر P-2} :: GFP التحوير هي أكثر إشراقا في نهاية المطاف في IL2s خلال داور من _{KLP P-6} صحفيين الفلورسنت، وP :: يعبر عن _{التأخر-2} التحوير GFP أيضا ضعيفة في عضلات الرأس التي يمكن أن تحجب فروع IL2 غرامة.
بعد وضع البيض، وإزالة المنحرفين الكبار، وختم لوحات مع parafilm واحتضان لمدة 34 ساعة عند 25 ° C ^17. ملاحظة: طول الوقت لتساقط داور يختلف قليلا بين الأفراد. في معظم فترة سريعة من التغصنات تشجر تبدأ 4-5 ساعة بعد بداية تساقط داور (39-44آخر ساعة عند 25 درجة مئوية) ¹² وضع البيض.
قبل يوم من التصوير، وتشكل حلا من 10٪ ^(ث / _ت) الاغاروز في المخزن M9 مع داور فرمون في تركيز EC _90. قسامة حوالي 100 ميكرولتر من الاغاروز على شريحة المجهر وبسرعة، ولكن بلطف، ووضع شريحة أخرى على رأس لخلق سطح مسطح الاغاروز. بعد أن عززت agarose، والتفاف الشرائح في التفاف ساران وتخزينها في غرفة الرطوبة (ماصة مربع تلميح مع مناشف ورقية مبللة).
بعد فترة الحضانة 34 ساعة، وفحص لوحات فرمون عن الديدان الخيطية التي توقفت عن ضخ البلعوم. شرائح منفصلة بحيث سطح واحد فقط من شريحة واحدة لديه الاغاروز على ذلك. اختيار واحد أو أكثر من الديدان الخيطية على لوحة agarose 10٪ و 1 μ لتر من 0.1 ميكرون الخرز البوليسترين ^22. ملاحظة: ويبلغ عدد سكانها متزامنة جيدا، وغالبية الديدان الخيطية على لوحة سوف تدخل في تساقط من L2d إلى داور. ومع ذلك، قد يكون هناك تباين بين طndividuals. ولذا فمن المهم أن نلاحظ الميزات الإضافية (انسداد أسنان، البلعوم إعادة عرض) لتقدير مقدار الوقت كانت الحيوانات داخل تساقط داور (انظر نتائج ممثلة على سبيل المثال).
تحديد اتجاه (يسار / يمين، الظهرية / بطني) من الديدان الخيطية. التقاط الصور Z-كومة من التغصنات IL2Q في التكبير 100X بأقل كثافة مضان ممكن كل 15 دقيقة أو حسب الحاجة للتجربة محددة. مواصلة التقاط الصور حتى فصل الخيطية من إهاب L2d والشلل مستحيل أو إذا يتعافى الحيوان من داور (البلعوم يبدأ ضخ). عندما لا التصوير بنشاط، ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. ملاحظة: نحن نستخدم مجهر المجهر epifluorescent مع الآلية تدخل مرحلة والتفضيلية النقيض (DIC) البصريات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنتاج النفط الخام النتائج داور فرمون في السائل الأصفر (الشكل 1) في آن معا الحرارة ومستقرة البارد. يتم تخزين aliquots من فرمون الخام عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى دون أي خسارة واضحة في النشاط. بعد إنتاج فرمون، واحد الأحيائي الاستجابة للجرعة كافية لتقدير تقريبي للقوة. ومع ذلك، بالنسبة لمعظم التجارب من الضروري تكرار الأحيائي 2 - 3 مرات، وتأخذ في المتوسط من كل تجربة. وتعطى نتائج ممثلة من اثنين من اختبارات بيولوجية فرمون في الشكل 3. من هذه البيانات لEC ₅₀ EC ₉₀ ويمكن حساب.

بالإضافة إلى مقاومة دوديسيل كبريتات الصوديوم ^2، dauers يمكن أن يعترف بها العديد من الميزات المورفولوجية بما في ذلك المغطي للأسنان، لجناح الجانبي والهيئات سهل الانكسار في اللحمة الأمامي والبلعوم منكمشة (الشكل 2 والشكل 4A FOص اليرقات L2). يكون Dauers أيضا العديد من الخصائص السلوكية المميزة منها: ميل أن تظل هادئة سلوكيا، وجود استراتيجية تشتيت عرضية دعا nictation، وقمع حركات الرأس تستخدم علفا، وقمع البلعوم الضخ وتحريض القناة المفرغة يتقطع ^{2 و 5 و 23} تظهر الخصائص السلوكية التباين بين الأفراد.

وتساقط في داور يستغرق حوالي 12 ساعة من نهاية مرحلة ما قبل داور L2 مرحلة (L2d) ^4. هذه الفترة يتوافق مع النمو النمطي للالعرش IL2Q. أول حدث من تساقط ملحوظ في داور هو قمع البلعوم الضخ. قمع ضخ شائع لجميع molts في C. ايليجانس. ومع ذلك، وقمع البلعوم ضخ يستمر طوال مرحلة داور وينتهي حوالي 4 ساعة عقب عودة الحيوان إلى الظروف البيئية المواتية. خلال الفترة الأولى من البلعوم الضخقمع، طبقة من أشكال بشرة على أسنان. تحدث هذه التغييرات خلال الساعة الأولى بعد بداية تساقط في داور. خلال هذه الفترة الأولية هو في كثير من الأحيان هناك تشكيل لعملية محوار إضافية تمتد من أجسام الخلايا IL2Q. ومع ذلك، فإن هذه العملية الإضافية الأولية تتراجع عادة في غضون 2 ساعة بعد بداية تساقط في داور ^12.

خلال ساعات 2-5 بعد بداية تساقط في داور يبدأ البلعوم لإعادة تظهر انخفاض تدريجي في حجم (الشكل 4B). وفي الوقت نفسه، شكل نقاط والقصير والتراجع على طول التغصنات الأولية IL2Q (الشكل 5). خلال ساعات 4-8 بعد بداية تساقط، الجسم يخضع لانكماش شعاعي تدريجي مما أدى إلى سحب بعيدا من الديدان الخيطية من إهاب L2d (الشكل 4C). ويرتبط هذه الفترة مع ثمرة من 2 ° التشعبات من التشعبات الأولية وإنشاءالتشعبات dditional من أجسام الخلايا IL2Q (داور محددة التشعبات-1D الأساسي °). نمو شجيري ليست ثابتة، ولكن يتميز بدلا من كلا تشكيل دينامية وتراجع العمليات كما هو موضح في الشكل 5. و 2 درجة و 1D ° التشعبات تمتد عادة إلى بطني (لIL2Vs) أو الظهرية (لIL2Ds) midlines. مرة واحدة يتم فصل بشرة داور تماما عن بشرة L2d، وتطبيق ضوء الفلورسنت يسبب الحيوان تدور بسرعة حول محورها الطولي، مما يجعل من التصوير لاحق تحديا. محاولات لإزالة الحيوان من وضع الشريحة، ميكانيكيا إزالة إهاب L2D، وجبل الحيوان على شريحة جديدة في حين لا يزال الحفاظ على تنمية داور لم تكن ناجحة.

الشكل 1
الرقم 1. الخام داور فرمونالسائل الأصفر التي يمكن تخزينها لأجل غير مسمى في -20 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. DIC الميكروسكوب من C. ايليجانس dauers مع داور نموذجي الميزات المورفولوجية. عرض (A) الظهرية منتصف جثة داور مما يدل على أسنان المغطي (السهم) والبلعوم منكمشة مع مستطيلة مبة محطة (الموضحة باللون الأحمر، مقارنة مع L2 يرقة هو مبين في الشكل 4A). سوف dauers التي شكلت حديثا في كثير من الأحيان يحتفظ جزء من بشرة L2d (رأس السهم). رأي (B) ظهري من اللحمة تبين الهيئات سهل الانكسار عالية (السهم) نموذجية من dauers. مرة أخرى إهاب L2d هو واضح (رأس السهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3. الجرعة استجابة لفحص داور الخام فرمون. الحيوانات L1 تتعرض لمستويات متزايدة من داور فرمون إدراجها في تعديل وسائل الإعلام NGM هم أكثر عرضة لتشكيل dauers. تم جمع البيانات وتجميعها من تجربتين منفصلتين باستثناء التركيزات التالية، التي تم اختبارها مرة واحدة فقط: 0.05٪ و 2٪ و 4٪. وتناسب البيانات إلى منحنى الاستجابة للجرعة السيني. تم احتساب القيم R ² و EC باستخدام الانحدار اللوجستي. نبني مصفر من الحيوانات بفحص كل التركيز هو على النحو التالي: 0٪ ن = 299، 0.05٪ ن = 81، 0.1٪ ن = 352، 0.5٪ ن = 368، 1٪ ن = 241، 2٪ ن = 125، 4٪ ن = 155. تمثل أشرطة الخطأ فواصل الثقة 95٪.

الرقم 4. DIC الوحشي عرض الميكروسكوب اليمنى للC. ايليجانس خلال مراحل مختلفة من تساقط في داور. (A) L2 مع الحيوانات نموذجية لمبة مدورة البلعوم الطرفية (الموضحة باللون الأحمر). (B) نحو 3 ساعة عقب تساقط في داور، لمبة محطة تتقلص وبدأ بشرة L2d فصل من إهاب داور شكلت حديثا (رأس السهم). (C) حوالي 10 ساعة بعد بداية تساقط داور، الحيوان شهدت انكماش شعاعي واسعة ومفرزة من إهاب L2d (رأس السهم). في بعض الأحيان، و واصطف بشرة القناة المفرغة للمرحلة L2d (السهم) ويمكن رؤية لا تزال تعلق على داور النامية. أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. الجانبية الميكروسكوب رأي المجهر epifluorescent من حيوان واحد معربا عن IL2 مراسل _{KLP P-6} :: tdTomato. الأعلى، كامل طول صورة من الخلايا العصبية IL2 حوالي 3 ساعة بعد بداية تساقط في داور. معارض أقحم جزء من IL2Q التغصنات في مختلف نقاط وقت بعد بداية تساقط في داور. ملحق السريع للفروع IL2Q يحدث بدأت حوالي 5 ساعة بعد بداية تساقط في داور. أشرطة النطاق، 10 ميكرومتر.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دراسة المرونة العصبية داور محددة وغيرها من التغيرات المورفولوجية المرتبطة داور يتطلب التحكم وتشكيل موثوق بها من dauers إما عن طريق طفرة جينية (أي داف المسوخ ج) أو عن طريق التعرض البرية من نوع الحيوانات لفرمون. في حين أن استخدام طفرة جينية للحث dauers مريحة، قد اربكت النتائج. لذلك البيانات التي تم جمعها مع داف ج الطفرات ينبغي تأكيد في وقت لاحق مع الحيوانات البرية من نوع يسببها لدخول مرحلة داور عن التعرض لداور فرمون.

إنتاج النفط الخام داور فرمون هو بسيط نسبيا وتنشر الاختلافات من هذا البروتوكول ^18. مع استثناء محتمل للتلوث، والطريقة المعروضة هنا هو موثوق للغاية. لإنتاج واستخراج، ونحن نستخدم طريقة قياسية من زراعة كثافة كبيرة من الديدان الخيطية في الثقافة سائل الإعلام S ^19. هناك قدر كبير من المرونة في كمية initiaوأضاف ل الخيطية اللقاح للثقافة السائلة. سوف تبدأ مع أعداد أكبر من الديدان الخيطية تعجيل الإجراء. ومع ذلك، فمن المهم التأكد من أن جميع من اللقاح الخيطية الأولي خالية من التلوث. كلا الفطرية والتلوث الجرثومي قد تنشأ أثناء النمو في وسائل الإعلام السائلة. تلوث فطري يمكن اكتشافه بسهولة من خلال وجود خيوط. التلوث الجرثومي هو أكثر صعوبة لتقييم. عادة الملوثات البكتيرية يمكن ملاحظة إذا كانت ثقافة السائل لا اضحة قريبا بعد فترات حضانة المدرجة. هناك مرونة في إجمالي الكثافة السكانية الخيطية اللازمة لإنتاج فرمون كافية. على سبيل المثال، تركيز النيماتودا 25،000 / مل كافية لإنتاج فرمون فعالة في إحداث dauers. يتكون طريقة بديلة لنقل الديدان الخيطية من ثقافة السائلة إلى وحدة تخزين صغيرة من M9 عازلة (~ 50 مل) تليها O / N في حضانة RT على شاكر المداري وتنقية اللاحقة للPHEromone من الطرق الموصوفة هنا. هذا البديل هو فعال، ولكن تنتج فرمون مع ارتفاع EC ₅₀ (أي أقل قوة).

حيث أن كل دفعة من فرمون الخام قد تختلف في قوتها، من المهم لاختبار عينة فرعية للفعالية في إحداث داور. للعديد من التطبيقات والأحيائي واحد مع تكرار واحد لكل تركيز فرمون كافية لتوفير تقديرات العام للقوة. ومع ذلك، يمكن أن يكون هناك تفاوت كبير بين أداء اختبارات بيولوجية مستقلة الاستجابة للجرعة. ولذلك، إذا التجارب تتطلب وجود توازن دقيق بين تشكيل داور والتنمية غير داور، فإنه سيكون من الضروري القيام 2 - 3 اختبارات بيولوجية تكرار لتحديد الجرعة الفعالة دقيقة. في المستقبل، كما يتم التعرف على أهمية ascarosides الخيطية في البيولوجيا أكثر على نطاق واسع، قد يكون من الممكن شراء توليفها فرمون داور بتكلفة معقولة.

العثور نوي داور محددةإعادة عرض RONAL في IL2s يوفر منصة لدراسة الآليات الجزيئية التي يسببها الإجهاد المرونة العصبية. للتعرف على الآلية التي تنظم جينات معينة المرونة العصبية، قد يكون من الضروري لمتابعة عملية إعادة عرض في الوقت الحقيقي. طريقة IL2 في مجال التصوير فيفو يستند C. السابق طرق ايليجانس ^{22، 24، 25.} إحدى العقبات التصوير خلال تشكيل داور هي إمكانية الانتعاش داور. الحل الأسهل هو استخدام البداية طفرة داف ج. تأكيد أي نتائج يمكن بعد ذلك إجراء في غير داف ج الخلفية باستخدام الطرق الموضحة في هذه الوثيقة.

وأشار سينغ وSulston عدة عقبات للتصوير في الجسم الحي من تشكيل داور ^25. تضمين هذه dauers شكلت حديثا الهروب خارج الشريحة المجهر وحركة غير المنضبط بعد انكماش شعاعي. استخدام الخرز المكروية في القضاء على إمكانية الهرب ^22. هاوالنسخة انكماش شعاعي أن يحدث ما يقرب من 10 ساعة في تساقط داور يزال يخلق صعوبات للتصوير لاحق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[P_klp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[P_klp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[P_lag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H₂O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO₄ buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl₂, 1 ml of 1 M MgSO₄
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K₂HPO₄, 1.5 g KH₂PO₄, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H₂O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate_,H₂O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO₄ •7 H₂O, 0.2 g MnCl2•4 H₂O, 0.29 g ZnSO₄ •7 H₂O, 0.025 g CuSO₄ •5 H₂O, H₂O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl₂, and 0.75 ml of 1 M MgSO₄.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H₂O to bring the volume to 4.725 ml. Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO₄ buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl₂, 50 µl 0.1 M MgSO₄ and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube. Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO₄, H₂O to 1 liter. Sterilize by autoclaving