In vivo billeddannelse af Dauer-specifik neuronal Remodeling i C. elegans

Abstract

De mekanismer, der styrer stress-induceret fænotypisk plasticitet hos dyr er ofte komplekse og vanskelige at undersøge in vivo. Et klassisk eksempel på stress-induceret plasticitet er Dauer etape af C. elegans. Dauers er et alternativ udviklingsmæssig larvestadiet dannet ved lave koncentrationer af bakteriel mad og høje koncentrationer af en Dauer feromon. Dauers vise omfattende udviklingsmæssige og adfærdsmæssige plasticitet. For eksempel et sæt af fire indre-labial kvadrant (IL2Q) neuroner undergår omfattende reversibel remodellering under Dauer dannelse. Udnytte den velkendte miljømæssige veje regulering Dauer indrejse, en tidligere fastlagte metode til produktion af rå Dauer feromon fra store flydende nematode kulturer er påvist. Med denne metode, en koncentration på 50.000 - 75.000 nematoder / ml flydende kultur er tilstrækkelig til at frembringe en yderst potent rå Dauer feromon. Den rå feromon styrke er determined af en dosis-respons-bioassay. Endelig er de metoder, der anvendes til in vivo time-lapse billeddannelse af IL2Qs under Dauer dannelse beskrevet.

Introduction

Fænotypisk plasticitet, herunder udviklingsmæssige og adfærdsmæssige plasticitet, er vigtig for tilpasninger til ugunstige miljøforhold og betragtes som en drivende kraft i evolutionen. ¹ C. elegans er en model organisme, der ofte anvendes til studier i udvikling og neurobiologi. Under ideelle forhold C. elegans udvikler sig gennem fire larvestadier forud for indsættelsen på voksne reproduktive fase. Men under forhold med lav tilgængelighed af føde og høje befolkningstæthed, C. elegans kan undergå en udviklingsmæssig kontakt og indgå en langlivet og stress-resistente Dauer trin ^2. Dauers vise adskillige morfologiske og adfærdsmæssige forskelle fra ikke-dauers der sandsynligvis medierer denne stress modstand. De miljømæssige stikord og genetiske veje regulerer Dauer post har været udførligt beskrevet ^{3, 4, 5, 6, 7.} Dog de ​​molekylære mekanismer, der styrer individuelle fænotypiske forandringer, der sker dnder Dauer dannelse er mindre godt forstået.

Undersøgelsen af ​​Dauer-specifikke fænotyper kræver produktionen af ​​Dauer dyr. Dette kan opnås på tre måder: 1) Picking fra en udsultet dyrkning af C. elegans, 2) brug af Dauer dannelse konstitutiv (daf-c) mutanter, 3) Induktion af Dauer dannelse gennem renset feromon. Det er forholdsvis simpelt at samle dauers fra en standard NGM plade med en C. elegans befolkning, der har opbrugt sin bakterielle fødevaresituation. I vores hænder, en standard NGM plade oprindelig podet med 50 ul OP50 Escherichia coli, lov til at vokse i 3 dage og derefter podet med 3 - 4 voksne hermafroditter holdt ved 25 ° C vil udtømme fødevareforsyningen inden for en uge og producere flere tusinde dauers Inden for en yderligere 3 dage (i tillæg til mange sultede ikke-dauers). Men denne metode er utilfredsstillende for behandlingen processer, der forekommer i løbet af fældningen i dAuer. Det er vanskeligt at afgøre, hvilken af ​​de flere tusinde dyr på en typisk udsultet plade er på vej ind Dauer. Endvidere, anvendelsen af ​​et sultet plade giver ingen mulighed for synkronisering. Anvendelsen af daf-c mutanter muliggør synkronisering og pålidelig generering af dauers. Der er dog ingen garanti for, at en bestemt daf-c mutationen ikke vil påvirke andre Dauer-specifikke fænotyper alene eller i kombination med yderligere mutationer.

Tilstedeværelsen af ​​en Dauer feromon blev først antydes af Cassada og Russell og senere demonstreret af gyldne og Riddle. Den Dauer feromon er siden blevet kemisk karakteriseret ^{2, 8, 9, 10.} Det oprensede feromon består af en kompleks blanding af ascarosides, som i forskellige former regulere både adfærdsmæssige og udviklingsmæssige processer ^{9, 11.} Anvendelse af et råt Dauer feromon ekstrakt giver mulighed for pålidelig kontrolleret induktion af synkroniserede dauers i en vildtype-baggrund. Nervesystemet og tilknyttede gliaceller undergår remodellering under Dauer larve dannelse ^{12, 13, 14.} Nogle af disse ændringer er irreversible, såsom ombygning af gliaceller under Dauer ^{13, 14.} Dog andre remodeling begivenheder er reversible ved en tilbagevenden til positiv miljøforhold. For eksempel et sæt af fire IL2Q neuroner undergå hurtig og reversibel neuronal remodellering under Dauer dannelse herunder: dendritceller arborization, et skifte fra én dendritiske til multidendritic neuroner og Axon remodeling ^12. Metoderne heri giver mulighed for pålidelig in vivo billeddannelse af stress-induceret neuroplasticitet i en model organisme. De metoder, der præsenteres for produktion og test af rå Dauer feromon er tidligere beskrevet og indsamlet fra flere kilder ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. Rå Dauer Pheromone Produktion

1. Grow OP50 E. coli fra en enkelt koloni O / N ved 37 ° C under omrystning i 100 ml LB-bouillon ved 200 omdrejninger pr. BEMÆRK: Denne O / N-kulturen kan laves i forvejen og opbevares ved 4 ° C.
2. Grow N2 C. elegans på 15-20 juni cm petriskåle med NGM agar (se opskrift i tabel 1) podet med 50 ul OP50 E. coli indtil bakterierne er næsten udtømt ^19.
3. Gør 5x 250 ml S medier (se opskrift i tabel 1) i 1 L Erlenmeyerkolber ^19. Bemærk: Denne løsning kan laves i forvejen.
4. Dyrk en kultur af OP50 E. coli i 4 l LB-bouillon O / N-ved at inokulere 1 ml OP50 i E. coli og rystning ved 37 ° C i 16 timer.
5. Vask nematoder fra pladerne (trin 1.2) med 1 ml S basal opløsning (se opskrift i tabel 1) og overføre nematoder 4-5 plader i hver af 4 1 L Erlenmeyerkolber med S medier fremstillet i trin 1.3 (4 5 pladerfor hver kolbe) ^19.
6. Centrifugere OP50 fra trin 1.4 ved 650 xg i 10 minutter og fjern supernatanten. Resuspender hver bakteriepellet i 10 ml S basal løsning. Overfør lige store mængder af resuspenderede bakterier til hver kolbe af nematoder.
7. Kolberne anbringes på en orbitalryster ved stuetemperatur (20 - 25 ° C) og 100 - 150 rpm for 4 - 5 dage, indtil opløsningen begynder at fjerne, hvilket indikerer en udtynding af fødevarer.
8. Når maden er opbrugt, vokser en anden O / N-kultur OP50 E. coli 4x 1 L LB-bouillon. Centrifugeres bakterierne ved 650 xg i 10 minutter og tilsæt en pellet fra en kolbe til hver af de S medier kolber med nematoder. Returnér S medier kolber til orbitalryster, som i trin 1.7, i yderligere 3-4 dage, indtil maden er udtømt igen.
9. Tag en ~ 1 ml portion af opløsningen fra hver kolbe og estimere rundorm koncentrationen af ​​sub-sampling 1 gl fra hver 1 ml prøve og tælle antallet af nematoder. BEMÆRK:rundorm befolkning bør være 50.000 - 75.000 nematoder / ml. Ved denne koncentration størstedelen af ​​nematoder er dauers.
10. Kassér alle forurenede kolber. BEMÆRK: Forurening ofte manifesterer sig som svampehyfer set under trin 1.9.
11. Centrifugér nematoder ved 4.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Kassér nematoden pellet og fastholde supernatanten. Alternativt se diskussionen for at bruge disse dyr til at gøre en lav potens feromon.
12. Filtrer flydelaget gennem # 1 Whatman filterpapir. BEMÆRK: En termokande vil fremskynde denne proces.
13. Yderligere filtrere supernatanten gennem 0,45 um steril vakuumfiltrering enheder. BEMÆRK: Filtrat kan holdes O / N-ved 4 ° C eller fortsætte til 1,14.
14. Filtratet tilsættes til en 2 L bægerglas med en omrører. Anbring i et stinkskab på en opvarmning omrøringsplade. Bring i kog under omrøring og inddampes til cirka 200 ml. Opløsningen overføres til et 500 ml bægerglas. Fortsæt med at koge indtil ca. 50 ml er left. BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed under dette trin, da det er muligt for den løsning, at koge over. Farven af ​​de endelige 50 ml er en mørkebrun. På ethvert tidspunkt under tilberedningen, kan varmen slukket, og filtratet lagrede O / N ved RT eller 4 ° C.
15. Lad afkøle og centrifugeres i 5 minutter ved 1000 x g. Hæld supernatanten i et 100 ml bægerglas, og kassér bundfaldet.
16. Kog supernatanten ned til en skorpe. Fjern fra varmen og bryde op skorpe med en spatel. Tilsæt tilstrækkeligt 200 proof ethanol til dækning af skorpen. Bægerglasset dækkes med Parafilm og lad det sidde O / N ved stuetemperatur. Hæld ethanol i et rent bægerglas og sat til side. Føj frisk ethanol til dækning af skorpen. Gentag O / N ekstraktioner 3 gange. Pool ekstrakterne.
17. Anvend en vakuumpumpe til at tørre ethanol ekstrakter. Hvis en vakuumpumpe ikke er tilgængelig, tilføje ethanolekstrakt til et rent bægerglas og opvarm til 50 ° C under omrøring i et stinkskab. BEMÆRK: Når ethanol er fordampet en klæbrig rest af Løjre brun farve bør forblive. Hvis der anvendes varme, bør der drages omsorg for ikke at brænde opløsningen ved opvarmning for længe.
18. Opløses remanensen i 10 ml destilleret sterilt vand. Filtersteriliser denne opløsning med et 0,22 um sprøjtefilter og opbevares ved -20 ° C i portioner på 1 ml. BEMÆRK: 1 ml vand anvendes til at opløse remanensen for hver 100 ml af den oprindelige flydende nematode kultur. For eksempel, hvis en af ​​de flydende dyrkningskolber kasseres på grund af forurening, og derefter justere mængden af ​​vand, der anvendes til at opløse resten.

2. Bestemmelse af Pheromone Dosisrespons

1. Forbered Dauer feromon ved at 6x 5 ml NGM medier med Noble agar uden pepton og suppleret med 50 ug / ml streptomycinsulfat og en række Dauer feromon (se opskrift i tabel 1) ^{4, 19.} Bland komponenterne i et 13x100 mm glas kultur rør, koge over en bunsenbrænder, og derefter hældes i 3 cm petriskåle.
2. Am afvejesicrocentrifuge rør. Der tilsættes 1 ml O / N-kulturen E. coli OP50 til røret og centrifugeres ved ~ 17.000 xg i et mikrocentrifugerør. Fjern alle supernatanten. Røret vejes igen, og bestemme vægten af ​​den bakterielle pellet. Pelleten resuspenderes med M9-puffer (se opskrift i tabel 1) til en slutkoncentration på 4% ^(w / _v). Alikvot 10 ul af bakteriesuspensionen på midten af hver feromon plade ^4. Opbevar plader O / N ved stuetemperatur.
3. Pick 10-15 GRAVID N2 vildtype hermafroditter én dag efter fældningen ind i voksenalderen onto feromon pladerne ^4. Opbevar pladerne ved 25 ° C i 3 - 4 timer.
4. Pluk fra alle de voksne hermafroditter. Registrere antallet af æg, der for hver plade. Forsegl pladerne med parafilm og vende tilbage til 25 ° C i 3 dage ^17.
5. Tæl procentdel af dauers (figur 2). Bemærk: Ved begge metoder er det vigtigt at bemærke, at dauers (og i mindre extelt ikke-dauers) vil stige op ad vægge og ned på låget på petriskåle. Det er derfor vigtigt at undersøge alle de overflader på skål for nematoder.
6. Passer til dataene til en dosis-respons-kurve og anslå EF ₉₀ koncentrationen af feromon (tilstrækkeligt feromon til at fremkalde 90% af dyrene til at danne dauers) som vist i figur 3 Note:. Vi bruger typisk en logistisk regressionsmodel til at estimere _EC90 , men forskellige statistiske softwarepakker kan have alternative metoder, der producerer lignende skøn.

3. Levende Imaging af Dauer IL2 neuroner

1. Forbered Dauer feromon plader som i protokol 2 ved hjælp af EF _90-værdi bestemt i trin 2.6.
2. Fremkald dauers anvender de metoder, i protokol 2 med en stamme, som bærer en integreret IL2 reporter transgen (myIs13 [P _KLP-6 :: GFP] myIs14 [P _KLP-6 :: GFP] myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] eller qIs56 [P _LAG-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} BEMÆRK: Hvis der bruges q Is56 vil ekspression af GFP ikke være synlige i IL2Qs indtil flere timer inde i Dauer fældningen, og nogle af de oprindelige remodeling begivenheder vil ikke være synlige. Og mens det fluorescerende signal fra P _LAG-2 :: GFP transgen er i sidste ende lysere i IL2s under Dauer end P _KLP-6 fluorescerende reportere, P _LAG-2 :: GFP transgen udtrykker også svagt i hovedet muskler, som kan maskere de fine IL2 grene.
3. Efter æglægning, skal du fjerne de voksne hermafroditter, forsegle pladerne med parafilm og inkuberes i 34 timer ved 25 ° C ^17. BEMÆRK: Længden af ​​tid til Dauer fældningen varierer lidt mellem individer. Sterkest periode dendritceller arborization begynder 4-5 timer efter starten af ​​Dauer fældningen (39-44timer efter æglægning ved 25 ° C) ^12.
4. Dagen før billeddannelse, udgør en opløsning af 10% ^(w / _v) agarose i M9 buffer med Dauer feromon ved _{EC90-koncentrationen.} Alikvot ca. 100 ul agarose onto et objektglas og hurtigt, men forsigtigt placere et andet dias på toppen for at skabe en flad agarose overflade. Efter agarosen er størknet, pak dias i Saran wrap og opbevares i et fugtigt kammer (pipettespids kasse med våde papirservietter).
5. Efter 34 timers inkubationstid, undersøge feromon plader til nematoder, der er stoppet svælg pumpning. Separate objektglas, således at kun den ene overflade af et objektglas har agarose på det. Pick en eller flere nematoder på en 10% agarose pad og 1 μ l 0,1 mikrometer polystyrenkugler ^22. BEMÆRK: Med et godt synkroniseret befolkning, de fleste af nematoder på pladen vil indgå fældningen fra L2D til Dauer. Der kan dog være variation blandt jegndividuals. Det er derfor vigtigt at bemærke yderligere funktioner (stomi okklusion, svælg remodeling) for at anslå den tid dyrene har været i Dauer fældningen (se repræsentative resultater for eksempel).
6. Bestem retning (venstre / højre, dorsale / ventrale) af nematoden. Capture Z-stack billeder af en IL2Q dendritceller ved 100x forstørrelse med det lavest mulige fluorescensintensitet hver 15 min eller efter behov til det specifikke eksperiment. Fortsætte med at tage billeder, indtil den nematode er adskilt fra L2D neglebånd og immobilisering er umuligt, eller hvis dyret kommer sig Dauer (svælg begynder at pumpe). Når du ikke aktivt imaging, placere dias i et fugtigt kammer. BEMÆRK: Vi bruger et epifluorescensmikroskop med et motoriseret kontrast scene og differential interferens (DIC) optik.

Representative Results

Produktionen af rå Dauer feromon resulterer i en gul væske (figur 1), der er både varme og kulde stabil. Portioner af rå feromon opbevares ved -20 ° C i det uendelige uden indlysende tab i aktivitet. Efter produktionen af ​​feromon, en enkelt dosis-respons bioassay er tilstrækkelig for et groft skøn over styrken. Men for de fleste eksperimenter er det nødvendigt at gentage bioassayet 2 - 3 gange, og tage et gennemsnit af hvert eksperiment. Repræsentative resultater fra to feromon bioanalyser er givet i figur 3. Fra disse data en _EC50 og _EC90 kan beregnes.

Ud over at resistens over for natriumdodecylsulfat ² kan dauers anerkendes af flere morfologiske træk, herunder en okkluderet stomi laterale alae, refraktile legemer i de forreste hypodermis og en formindsket svælg (figur 2 og figur 4A for L2 larver). Dauers har også flere markante adfærdsmæssige karakteristika, herunder:. En tilbøjelighed til at forblive adfærdsmæssigt hvilende, tilstedeværelsen af en lejlighedsvis spredning strategi kaldet nictation, undertrykkelse af hoved fouragering bevægelser, undertrykkelse af svælg pumpning og induktion af udskillelseskanal pulserende ^{2, 5, 23} adfærdsmæssige karakteristika viser variation mellem individer.

Fældningen i Dauer tager cirka 12 timer fra slutningen af før-Dauer L2 etape (L2D) ^4. Denne periode svarer til stereotype vækst af IL2Q dorne. Den første mærkbare tilfælde af fældningen i Dauer er undertrykkelse af svælg pumpning. Undertrykkelse af pumpning er fælles for alle molts i C. elegans. Men undertrykkelse af svælg pumpning fortsætter hele Dauer scenen og slutter cirka 4 timer efter et afkast på dyret til gunstige miljøforhold. I den indledende periode, svælg pumpningundertrykkelse, et lag af kutikula former over stomien. Disse ændringer forekommer i den første time efter påbegyndelsen af ​​fældningen i Dauer. I denne indledende periode er der ofte dannelsen af ​​en ekstra neurite proces strækker sig fra IL2Q cellelegemerne. Men denne indledende yderligere proces normalt trækker inden 2 timer efter påbegyndelsen af fældningen i Dauer ^12.

Under timer 2 - 5, efter påbegyndelsen af fældningen i Dauer svælget begynder at omforme viser en gradvis reduktion i størrelse (figur 4B). Samtidig hermed kort puncta formular og trække langs IL2Q primære dendritceller (figur 5). Under timer 4-8 efter begyndt fældningen, kroppen gennemgår en gradvis radial krympning resulterer i løsrivning af nematode fra L2D neglebånd (figur 4C). Denne periode er korreleret med udvækst på 2 ° dendritter fra de primære dendritter og etablering af enDERLIGERE dendritter fra IL2Q celle organer (Dauer-specifikke primære dendritter-1D °). Den dendritisvækst er ikke konstant, men er karakteriseret ved både den dynamiske dannelse og tilbagetrækning af processer som illustreret i figur 5. 2 ° og 1d ° dendritter strækker sig generelt til den ventrale (for IL2Vs) eller dorsale (til IL2Ds) midlines. Når Dauer kutikula er helt adskilt fra L2D kutikula, anvendelse af fluorescerende lys forårsager dyret til hurtigt at dreje om sin langsgående akse, hvilket gør efterfølgende billeddannelse udfordrende. Forsøg på at fjerne dyret udvikler fra slide, mekanisk fjerne L2D neglebånd, og montere dyret på et nyt dias samtidig bibeholde Dauer udvikling ikke var en succes.

Figur 1. Rå Dauer feromon eren gul væske, der kan gemmes på ubestemt tid ved -20 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. DIC mikrografier C. elegans dauers med typiske Dauer morfologiske træk. (A) Dorsal midten krop af en Dauer viser en okkluderet stomi (pil) og en formindsket svælg med rektangulær terminal pære (markeret med rødt, sammenlign med L2 larve vist i figur 4A). Nydannede dauers vil ofte tilbageholde en del af den L2D neglebånd (pilespids). (B) Dorsal udsigt hypodermis viser særdeles refraktile legemer (pil) typisk for dauers. Igen L2D kutikula er indlysende (pilespids). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Dosis respons assay til rå Dauer feromon. L1 dyr udsat for stigende niveauer af Dauer feromon inkorporeret i modificeret NGM medier er mere tilbøjelige til at danne dauers. Data blev opsamlet og samlet fra to separate eksperimenter med undtagelse af følgende koncentrationer, der kun blev testet en gang: 0,05%, 2% og 4%. Data blev passe til en S-formet dosis-respons kurve. ^R2 og EF-værdier blev beregnet ved anvendelse af logistisk regression. Numbra af undersøgte dyr for hver koncentration er som følger: 0% n = 299, 0,05% n = 81, 0,1% n = 352, 0,5% n = 368, 1% n = 241, 2% n = 125, 4% n = 155. Error søjler repræsenterer 95% konfidensintervaller.

Figur 4. DIC laterale rigtige opfattelse mikrografier af C. elegans i forskellige stadier af fældningen i Dauer. (A) L2 dyr med typisk afrundet terminal svælg pære (skitseret i rødt). (B) Ca. 3 timer efter fældningen i Dauer er den terminale pære skrumpende og L2D neglebånd er begyndt at løsne sig fra det nydannede Dauer kutikula (pilespids). (C) Ca. 10 timer efter starten af Dauer fældningen har dyret undergået omfattende radiale krympning og adskillelse fra L2D kutikula (pilespids). Indimellem neglebånd foret udskillelseskanal af L2D etape (pil) ses stadig fastgjort til Dauer fremkaldning. Skalapanelerne, 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. sidebillede epifluorescerende mikrografier af et enkelt dyr, der udtrykker IL2- reporter P _KLP-6 :: tdTomato. Top, fuld længde billede af IL2 neuroner cirka 3 timer efter påbegyndelsen af fældningen i Dauer. Nedfældning viser del af IL2Q dendritceller på forskellige tidspunkter efter påbegyndelsen af ​​fældningen i Dauer. En hurtig udvidelse af IL2Q filialer sker starter cirka 5 timer efter påbegyndelsen af ​​fældningen i Dauer. Skalapanelerne, 10 um.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

En undersøgelse af Dauer-specifikke neuroplasticitet og andre Dauer-associeret morfologiske ændringer kræver styret og pålidelig dannelse af dauers enten ved genetisk mutation (dvs. daf-c-mutanter), eller ved udsættelse for vildtype-dyr feromon. Mens anvendelse af en genetisk mutation til at inducere dauers er praktisk, kan det forvirre resultaterne. Derfor indsamlede data med daf-C mutationer skal efterfølgende bekræftes med vildtype dyr induceret at indtaste Dauer scenen ved udsættelse for Dauer feromon.

Produktionen af rå Dauer feromon er forholdsvis enkel og variationer af denne protokol offentliggøres ^18. Med den mulige undtagelse af forurening, metoden præsenteres her er meget pålidelige. For at producere ekstraktet, bruger vi en standard metode til dyrkning af store tætheder af nematoder i S medier flydende kultur ^19. Der er en stor grad af fleksibilitet i mængden af ​​initial nematoder tilsat til flydende kultur. Startende med et større antal af nematoder vil fremskynde proceduren. Det er imidlertid vigtigt at sikre, at alle den oprindelige nematoder er fri for forurening. Både svampe og bakteriel kontaminering kan opstå under vækst i flydende medier. Svampekontamination let kan afsløres ved tilstedeværelsen af ​​hyfer. Bakteriel forurening er vanskeligere at vurdere. Typisk en bakteriel forurenende kan observeres, hvis den flydende kultur ikke afhjælper hurtigt efter de anførte inkubationsperioder. Der er fleksibilitet i den samlede rundorm befolkningstæthed nødvendig for at producere tilstrækkelig feromon. For eksempel kan en koncentration på 25.000 nematoder / ml er tilstrækkelig til at frembringe en feromon effektiv til at inducere dauers. En alternativ metode består i at overføre nematoder fra en flydende kultur til et lille volumen M9-puffer (~ 50 ml) efterfulgt af en O / N-inkubation ved stuetemperatur på en orbital omryster og efterfølgende oprensning af pheromone ved fremgangsmåderne beskrevet heri. Dette alternativ er effektive, men frembringer et feromon med en højere _EC50 (dvs. mindre kraftigt virkende).

Da hver batch af rå feromon kan variere i potens, er det vigtigt at teste en delprøve til effektivitet i induktion Dauer. For mange anvendelser en enkelt bioassay med én replikat for hvert feromon koncentration er tilstrækkelig til at give en generel vurdering af styrke. Dog kan der være betydelig variation mellem selvstændigt udført dosis-respons bioassays. Derfor, hvis eksperimenter kræver en hårfin balance mellem Dauer dannelse og ikke-Dauer udvikling, vil det være nødvendigt at udføre 2 - 3 replikater bioassays for at bestemme en nøjagtig effektiv dosis. I fremtiden, da det er vigtigt at ascarosides i nematoder biologi er mere almindeligt anerkendt, kan det være muligt at købe syntetiseret Dauer feromon til rimelig pris.

Konstateringen af ​​Dauer-specifikke neuRonal ombygninger i IL2s giver en platform for at studere de molekylære mekanismer i stress-induceret neuroplasticitet. For at identificere den mekanisme, som specifikke gener regulere neuroplasticitet, kan det være nødvendigt at følge remodelleringsprocessen i realtid. Metoden af IL2 in vivo imaging bygger på tidligere C. elegans metoder ^{22, 24, 25.} En hindring for billeddannelse under Dauer dannelse er muligheden for Dauer opsving. Den nemmeste løsning er i første omgang at bruge en DAF-c-mutationen. Bekræftelse af resultater kan derefter udføres på en ikke-daf-c baggrund ved hjælp af de metoder, der er beskrevet heri.

Singh og Sulston bemærkede adskillige hindringer for in vivo billeddannelse af Dauer dannelse ^25. Disse omfattede nydannede dauers flygter fra mikroskopobjektglasset og ukontrolleret bevægelse efter radiale svind. Anvendelsen af mikrokugleblærer har fjernet muligheden for flugt ^22. However den radiale svind, der opstår cirka 10 timer i Dauer fældningen stadig skaber vanskeligheder for den efterfølgende billedbehandling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving