Abstract
동물의 스트레스에 의한 표현형의 가소성을 조절 메커니즘은 생체 내에서 공부를 자주 복잡하고 어렵습니다. 스트레스에 의한 소성의 전형적인 예는 C의 영속 무대 엘레 간스. Dauers 박테리아 음식과 영속 페로몬의 높은 농도의 낮은 농도의 조건에서 형성된 대안 발달 애벌레 단계이다. Dauers 광범위한 발달 및 행동 가소성을 표시합니다. 예를 들어, 네 개의 내부 - 순측 사분면의 세트 (IL2Q) 뉴런 영속 형성 동안 광범위한 가역 리모델링을 겪는다. 대형 선충 액체 배양에서 원유 영속 페로몬의 생산을위한 잘 알려진 경로 환경을 미치는 영속 항목, 이전에 설정된 방법을 활용하는 것이 입증된다. 이 방법으로, 50000의 농도 - 배양액 75000 선충 / ㎖가 고도로 강력한 원유 영속 페로몬을 생산하기에 충분하다. 조 페로몬의 효능 dete입니다용량 반응 생물 검정법에 의해 rmined. 마지막으로, 영속 형성하는 동안 IL2Qs의 생체 시간 경과 영상에 사용되는 방법이 설명되어 있습니다.
Introduction
발달 및 행동 가소성을 포함 표현형 소성은 불리한 환경 조건에 적응하기위한 중요하고 진화 한 원동력으로 간주됩니다. C. 엘레 자주 개발 및 신경 생물학의 연구에 사용되는 모델 생물이다. 이상적인 조건에서, C. 엘레 성인 생식 단계에 들어가기 전에 사 애벌레 단계를 통해 개발하고 있습니다. 그러나, 낮은 음식 가용성과 높은 인구 밀도, C의 조건에서 엘레 발달 스위치를 받아야하고 수명이 긴 스트레스에 강한 영속 2 단계로 입력 할 수 있습니다. Dauers 가능성이 스트레스 저항을 중재 비 dauers에서 여러 형태 학적 및 행동의 차이를 표시합니다. 영속 항목을 규제하는 환경 단서 및 유전 적 경로가 광범위하고, 5, 4, 3 6, 7을 설명했다. 그러나, 각각의 표현형의 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 거라고 발생하는uring의 영속 형성이 덜 잘 이해된다.
영속 특정 표현형 검사는 영속 동물의 생산을 필요로한다. 이 세 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다 : 1) C의 결핍 문화 따기 엘레 간스, 2) 영속 형성 제정 (DAF-C) 돌연변이, 정제 페로몬을 통해 영속 형성 3) 유도의 사용. 그것은 C.있는 표준 NGM 플레이트에서 dauers을 선택하는 비교적 간단하다 그 박테리아의 식품 공급을 소진했다 elegans의 인구. 우리의 손으로, 표준 NGM 플레이트는 원래 삼일 성장이 허용 이후 3 접종 OP50 대장균의 50 μL, 시드 - 4 성인 자웅 동체는 일주 내에서 식량 공급을 배출하고 수천을 생산합니다 25 ° C로 유지 추가 3 일 이내 dauers (공복 수많은 비 dauers 이외에). 그러나,이 방법은 D로 탈피 중에 발생하는 검사 공정에 불만족AUER. 그것은 영속에 입력하는 일반적인 굶주린 접시에 수천의 동물을 결정하기가 어렵습니다. 또한, 고갈 플레이트의 사용은 동기화를위한 가능성을 제공하지 않는다. DAF-C 돌연변이 체의 사용은 동기화 및 dauers의 안정적인 생성을 허용한다. 그러나, 특정 DAF-C 돌연변이가 단독으로 또는 추가 돌연변이와 함께 다른 영속 특정 표현형에 영향을 미치지 않는다는 보장은 없습니다.
영속 페로몬의 존재는 첫째 Cassada 러셀에 의해 암시하고 나중에 황금과 수수께끼에 의해 입증되었다. 영속 페로몬은 이후 화학적, 열 9, 8,이 특징으로하고있다. 정제 된 페로몬은 다른 형태로 9, 원유 영속 페로몬 추출물 11. 사용이 가능 모두 행동 및 발달 과정을 조절 ascarosides의 복잡한 혼합으로 구성 야생형 백그라운드에서 동기화 dauers의 안정적인 제어 유도. 신경계 및 관련 아교 세포는 영속 유충 형성 12, 13, 14시 개장을받을. 이러한 변화 중 일부는 영속 13 일 14시 신경교 세포의 리모델링으로 되돌릴 수 있습니다. 그러나 다른 리모델링 이벤트가 유리한에 반환시 되돌릴 수 있습니다 환경 조건에 따른 것입니다. 수상 돌기 arborization, multidendritic 신경 세포와 축삭이 12 개조에 하나의 돌기에서 스위치 : 예를 들어, 네 IL2Q 뉴런의 집합을 포함 영속 형성하는 동안 신속하고 가역적 신경 리모델링을 거쳐. 방법은 여기에 모델 생물 스트레스에 의한 신경 가소성의 신뢰할 수있는 생체 내 이미징 할 수 있습니다. 원유 생산 및 영속 페로몬의 테스트를 위해 제시된 방법은 앞서 여러 소스 4, 8, 15, 16, 17, 18에서 설명한 컴파일된다.
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Protocol
1 원유 영속 페로몬 생산
- OP50 E. 성장 하나의 식민지 O에서 / N 37 ° C에서 대장균은 200 rpm에서 LB 배지 100 ㎖에 떨고있다. 참고 :이 O / N 문화가 사전에 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- N2 C. 성장 엘레 15 - 20 OP50 E.의 50 μL 시드 NGM 한천 (표 1의 레시피 참조) 6cm 배양 접시 대장균 박테리아까지 거의 19 고갈된다.
- 1 L 삼각에 S 미디어의 5 배 250 ㎖에 (표 1의 레시피를 참조하십시오) 확인은 19 플라스크. 참고 :이 솔루션은 사전에 할 수있다.
- OP50 E.의 문화를 성장 E.에서 OP50의 1 ㎖로 접종하여 LB 국물 O의 4 L / N에서 대장균 대장균 및 16 시간 동안 37 ° C에서 떨고.
- (S 기저 용액 (표 1의 제조법 참조) 및 단계 1.3에서 제조 된 S 미디어 4 일 L 삼각 플라스크 각각에 4 ~ 5 판에서 전송 선충 1 ㎖와 함께 접시 (단계 1.2)에서 4를 선충을 씻으 5 판각 실린더 용) 19.
- 10 분 동안 650 XG에서 단계 1.4에서 OP50을 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. S 기저 용액 10 ㎖ 중의 각 세균 펠렛을 재현 탁. 선충의 각 플라스크에 재 부유 세균의 같은 양을 전송합니다.
- 이 솔루션은 음식의 고갈을 나타내는 취소 시작할 때까지 5 일 - (- 25 ° C에서 20) 100 - 4 150 rpm으로 실온에서 진탕에 플라스크를 배치합니다.
- 음식이 고갈되면, OP50 E.의 또 다른 O / N 문화를 성장 LB 국물의 4 배 1 L에 대장균. 10 분 동안 650 XG에서 박테리아를 원심 분리기 및 선충류와 S 미디어 플라스크에 각각 한 플라스크에서 펠렛을 추가합니다. 음식이 다시 소진 될 때까지 추가 3~4일를 들어, 단계 1.7에서와 같이 진탕에 S 미디어 플라스크를 돌려줍니다.
- 각 플라스크 용액의 ~ 1 ㎖의 분취 량을 가지고 각 1 ㎖의 분취에서 1 μl를 서브가 샘플링 및 선충의 수를 계산하여 선충의 농도를 추정한다. 참고 :75,000 선충 / ㎖ - 선충 인구는 50,000 있어야합니다. 이 농도에서 선충 대부분 dauers이다.
- 오염 된 플라스크를 폐기하십시오. 참고 : 오염 자주 단계 1.9 동안 본 곰팡이 균사로 나타난다.
- 4 ° C에서 10 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기 선충. 선충 펠렛을 버리고 상층 액을 유지합니다. 대안 적으로, 낮은 - 역가 페로몬을 만들기 위해 동물을 사용하여 이들에 대한 설명을 참조.
- # 1 와트 만 여과지를 통해 뜨는을 필터링합니다. 주 : 진공 플라스크에이 과정을 촉진 할 것이다.
- 또한 0.45 μm의 멸균 진공 여과 장치를 통해 뜨는을 필터링 할 수 있습니다. 참고 : 여과 액은 4 ° C에서 O / N을 유지 또는 1.14로 진행 할 수 있습니다.
- 교반 막대와 2 L 비이커에 여과 액을 추가합니다. 가열 볶음 접시에 흄 후드에 배치합니다. 교반하면서 끓기 약 200 ㎖의 증발. 500 ㎖의 비이커에 용액을 전송. 약 50 ㎖를 제작 때까지 끓는 계속피트 NOTE : 용액 위에 비등하는 것이 가능한 한 용품은이 단계에서 수행되어야한다. 50 ml의 최종의 색은 어두운 갈색이다. 조리 과정 중에 언제든지 열이 해제 될 수 있고, 여과 액을 RT 또는 4 ℃에서 O / N을 기억.
- g 차가운하자 X 1000에서 5 분 동안 원심 분리. 100 ㎖의 비이커에 뜨는을 붓고 펠렛을 폐기합니다.
- 갈색 빵 껍질에 뜨는을 졸이다. 열에서 제거하고 주걱 지각을 휴식. 지각을 커버하기에 충분한 200 증거 에탄올을 추가합니다. 파라 필름으로 비이커를 커버하고 RT에서 O / N 앉아 보자. 깨끗한 비커에 에탄올을 붓고 옆에 넣어. 지각을 커버하는 신선한 에탄올을 추가합니다. O / N의 추출을 3 회 반복합니다. 추출물을 풀입니다.
- 에탄올 추출물을 건조 진공 펌프를 사용합니다. 진공 펌프를 사용할 수없는 경우 흄 후드에서 교반하면서, 50 ° C로 깨끗한 비커에 따뜻한로 에탄올 추출물을 추가합니다. 참고 : 에탄올 리터의 끈끈한 잔류 물을 증발되면광명 브라운 컬러는 유지되어야합니다. 가열이 사용되는 경우,주의가 너무 오랫동안 가열하여 용액을 구울주의해야한다.
- 멸균 증류수 10ml에 잔류 물을 용해. 필터는 1 ㎖의 분액에서 -20 ° C에서 0.22 μm의 주사기 필터 및 저장이 솔루션을 소독. 참고 : 물 1 ㎖의 원액 선충 문화의 100 ML에 대한 잔류 물을 용해하는 데 사용됩니다. 액체 배양 플라스크 중 하나는 오염으로 인해 폐기되는 경우, 예를 들어, 다음, 잔사를 용해하는 데 사용되는 물의 양을 조절한다.
페로몬 복용량 응답의 2 결정
- 펩톤없이 노블 한천로 NGM 미디어의 6 배 5 mL를하여 영속 페로몬을 준비하고, 50 / ㎖ 스트렙토 마이신, 황산 μg과 영속 페로몬의 범위와 보충. 4, 19 (표 1에서 제조법 참조) 13x100 mm의 구성 요소를 믹스 유리 문화 튜브, 분젠 버너를 통해 종기, 다음 3cm 페트리 접시에 붓는다.
- 오전의 무게를icrocentrifuge 관. E.의 O / N 문화의 한 ML을 추가 microcentrifuge 관에서 ~ 17,000 XG에 튜브와 원심 분리기에 대장균 OP50. 상층 액을 모두 제거합니다. 다시 튜브를 달아 세균 펠릿의 중량을 결정한다. 4 %의 최종 농도를 위해 M9 완충액 (표 1의 레시피를 참조) 펠렛을 재현 탁 (/ w v). 나누어지는 각 페로몬 판 (4)의 중심 상에 세균 현탁액 10 μL. 저장 판 O / RT에서 N.
- 페로몬 판 (4) 상에 성인으로 탈피 한 후 10 ~ 15 임신하는 N2 야생 형 자웅 동체에게 일일를 선택합니다. 4 시간 - 3 25 ° C에서 번호판을 저장합니다.
- 성인 자웅 동체의 모든를 선택합니다. 각 접시에 누워 계란의 수를 기록한다. 파라 필름과 판을 밀봉하고 삼일 (17)에 대해 25 ° C로 돌아갑니다.
- dauers의 비율을 계산한다 (그림 2). 참고 : 두 가지 방법의 경우는주의하는 것이 중요하다 dauers (그리고에 낮은 전십t 비 dauers)의 벽을 오르고, 페트리 접시의 뚜껑 위에 것이다. 이 선충에 대한 요리의 모든 표면을 검사하는 것이 중요하다.
- 용량 - 반응 곡선의 데이터를 장착하고도 3에 도시 된 바와 같이 (dauers을 형성하기 위해 동물의 90 %를 유도하기에 충분한 페로몬) 페로몬의 EC (90)의 농도를 추정 참고. 우리는 보통 EC (90)을 추정하기 위해 로지스틱 회귀 모델을 사용 하지만 서로 다른 통계 소프트웨어 패키지는 유사한 추정치를 생산하는 다른 방법이있을 수 있습니다.
영속 IL2 뉴런의 3 라이브 영상
- 단계 2.6에서 결정된 EC 90 값을 사용하여 프로토콜이 같이 영속 페로몬 판을 준비합니다.
- 통합 IL2 리포터 유전자를 운반하는 균주 (myIs13 [P의 KLP-6 :: GFP] myIs14 [P의 KLP-6 :: GFP] myIs16 [P와 프로토콜이있는 방법을 사용하여 dauers을 유도
- 달걀 누워 다음, 성인 자웅 동체를 제거 파라 필름과 번호판을 봉인하고 25 ° C 17에서 34 시간 동안 배양한다. 참고 : 영속 탈피에 시간의 길이는 개인 사이에서 약간 다릅니다. 영속 탈피의 시작 5 시간 (39 - - 수상 돌기 arborization의 가장 빠른 기간은 4를 시작합니다 (44)시간 포스트 달걀 누워 25 ° C) 12시.
- 촬영 전날, EC 90 농도의 영속 페로몬과 M9 버퍼에 10 %의 용액 (w / v)의 아가로 오스를 구성합니다. 나누어지는 아가로 오스의 약 100 μl의 현미경 슬라이드 상에 신속하게, 조심스럽게, 평면 아가로 오스 표면을 만들기 위해 상단에 다른 슬라이드를 배치합니다. 아가로 오스가 고형화 후, 습도 챔버 (젖은 종이 타월로 피펫 팁 상자)에 사란 랩 및 저장소에 슬라이드를 래핑합니다.
- 34 시간의 잠복기 후, 인두 펌핑을 중지 선충에 대한 페로몬 판을 검사합니다. 개별 슬라이드 한 슬라이드 일면에만 그것에 아가 갖도록. 10 % 아가로 오스 패드와 0.1 미크론 폴리스티렌 비즈 22의 한 μ 리터에 하나 이상의 선충을 선택합니다. 참고 : 잘 동기화 인구, 접시에 선충의 대부분은 L2D에서 영속에 털갈이로 입력됩니다. 그러나, 나는 사이에서 변동이있을 수 있습니다ndividuals. 그것은 동물이 영속 탈피 내왔다 시간 (예를 들어 대표적인 결과 참조)의 양을 추정하기 위해 추가 기능 (인공 항문 폐쇄, 인두 리모델링)을주의하는 것이 중요합니다.
- 선충의 방향을 (좌 / 우, 지느러미 / 복부)를 결정합니다. 가능한 최저 형광 강도와 100X 배율 매 15 분으로 IL2Q 덴 드라이트의 Z-스택 이미지를 캡처하거나 특정 실험에 필요한. (인두가 펌핑 시작) 선충은 L2D 표피에서 분리 될 때까지 캡처 이미지를 계속 동물이 영속을 복구하는 경우 고정이 불가능하거나. 적극적 묘화하지 않을 때, 습도 챔버에 슬라이드를 배치했다. 참고 : 우리는 전동 무대와 미분 간섭 대비 (DIC) 광학과 epifluorescent 현미경을 사용합니다.
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Representative Results
더위와 추위 안정적인있는 노란색 액체의 원유 영속 페로몬 결과 (그림 1)의 생산. 원유 페로몬 일정량 활동의 명백한 손실 무기한 -20 ° C에 저장됩니다. 페로몬의 제조에 이어, 단일 용량 - 반응 생물 검정법의 효능은 대략적으로 충분하다. 3 회, 각 실험으로부터 평균을 취 - 그러나, 대부분의 실험에는 생물 검정 2를 반복 할 필요가있다. 이 페로몬 생물 검정에서 대표 결과는 그림 3에 나와있다. EC 50, EC (90)가 계산 될 수있다 이러한 데이터에서.
도데 실 황산나트륨 (2)에 대한 내성 이외에, dauers는 폐색 장루, 횡 alae, 굴절 반사 바디 전방 피하 및 수축 인두 (도 2 및도 4a FO 등 여러 형태의 기능에 의해 인식 될 수있다R L2 유충). Dauers는 등 여러 가지 독특한 행동 특성이 있습니다. 성향 행동 적 대기 남아, nictation라는 가끔 분산 전략의 존재, 머리 꼴을 운동의 억제, 인두 펌프 억제하고 배설 덕트 23, 5, 2 펄스의 유도를 행동 특성은 개인 간의 변동성을 보여줍니다.
영속에 털갈이는 사전 영속 L2 단계 (L2D) 4의 끝에서 약 12 시간이 걸립니다. 이 기간은 IL2Q 아버의 전형적인 성장에 해당한다. 영속으로 탈피의 제 띄는 이벤트는 인두 펌핑의 억제이다. 펌프의 억제 C. 모든 molts에 공통적 인 엘레 간스. 그러나 인두 펌프의 억제는 영속 단계에 걸쳐 계속 유리한 환경 조건에 동물의 반환 다음 약 4 시간을 종료합니다. 인두 펌프의 초기 기간 동안억제, 인공 항문을 통해 표피 형태의 층. 이러한 변화는 영속에 털갈이의 발병 후 처음 시간 동안 발생합니다. 이 초기 기간 동안 자주 IL2Q 균체로부터 연장되는 추가적인 신경 돌기의 형성 공정이있다. 그러나,이 초기 추가적인 공정은 일반적으로 12 영속 탈피의 발병 다음 2 시간 내에 후퇴.
인두의 크기가 점진적으로 감소 (그림 4B)를 보여주는 개조하기 시작 영속에 털갈이의 발병 5 - 2 시간 동안. 부수적으로, 짧은 눈물 점의 형태와는 IL2Q 주 수상 돌기 (그림 5)을 따라 수축. 시간 4시 - 탈피의 발병 다음과 같은 8, 몸은 멀리 L2D 표피 (그림 4C)에서 선충의 당기의 결과로 점진적으로 반경 수축률. 이 기간은 주 수상 돌기에서 2 ° 수상 돌기의 부산물과의 설립과 상관 관계IL2Q의 세포 기관에서 뉴 부가 수상 돌기 (영속 별 주요 수상 돌기-1D °). 그림 5에 도시 된 바와 같이 돌기 성장은 일정한 것이 아니라 동적 생성 및 프로세스의 후퇴 모두 특징이 아니다. 수상 돌기 ° 2 ° 및 1D는 일반적으로 midlines (IL2Ds에 대한) (IL2Vs에 대한) 복부 또는 지느러미로 확장 할 수 있습니다. 영속 표피 완전히 L2D 표피로부터 분리되면, 형광등의 애플리케이션은 후속 촬상 도전있어 급속 종축에 스핀 동물시킨다. 기계적 슬라이드에서 개발하고 동물을 제거 L2D의 표피를 제거하고 여전히 영속 발전을 유지하는 것이 성공하지 동안 새 슬라이드에 동물을 마운트하려고 시도합니다.
그림 1 원유 영속 페로몬은-20 ° C에서 무한정 저장할 수있는 노란색 액체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
C.의 그림 2 DIC 현미경 사진 엘레 일반적인 영속 형태 학적 특징을 가진 dauers. 폐쇄 된 인공 항문 (화살표) 직사각형 단자 전구 수축 인두를 보여주는 영속의 (A) 지느러미 중간 본문보기 (빨강에 설명, 그림 4a에 도시 L2 유충과 비교). 새로 형성 dauers 자주 L2D 표피 (화살촉)의 일부를 유지합니다. 높은 굴절 반사기구 (화살표) dauers의 전형을 보여주는 하피의 (B) 지느러미보기를. 다시 L2D 표피는 분명 (화살촉)입니다.
원유 영속 페로몬에 그림 3 용량 반응 분석. 수정 NGM 미디어에 통합 영속 페로몬의 증가 수준에 노출 L1 동물 dauers을 형성 할 가능성이 높습니다. 데이터가 수집 한 번만 시험 하였다 다음 농도를 제외한 두 개의 별도 실험에서 풀링했다 : 0.05 %, 2 %, 4 %. 데이터는 S 자형 용량 반응 곡선을 맞게되었다. R 2 및 EC 값은 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 계산 하였다. N0 % N = 299, 0.05 %, N = 81, 0.1 %, N = 352, 0.5 %, N = 368, 1 % N = 241, 2 % N = 125, 4 % N을 다음과 같이 각각의 농도를 조사 동물 엄버이다 = 155. 오차 막대는 95 % 신뢰 구간을 나타냅니다.
그림 4는 DIC는 C. 오른쪽보기의 현미경 사진을 수사관 영속에 털갈이의 여러 단계 중 엘레. (A) (빨간색에서 설명) 일반적인 둥근 터미널 인두 전구와 L2 동물입니다. (B) 영속에 탈피 다음 약 3 시간은 터미널 전구 축소되고 L2D 표피가 시작된다 새로 형성된 영속 표피 (화살촉)에서 분리 할 수 있습니다. (C)를 영속 탈피의 발병 다음과 같은 약 10 시간을, 동물은 L2D 표피 (화살촉)에서 광범위한 반경 수축 및 박리를 시행하고있다. 때때로, 표피는 L2D 단계 (화살표)의 배설 덕트는 여전히 볼 수있는 현상 영속에 부착 할 수 늘어서있다. 스케일 바, 10 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 IL2 기자 P KLP-6 :: tdTomato. 최고를 표현하는 하나의 동물의 5 측면보기의 epifluorescent 현미경, IL2 뉴런의 전체 길이 이미지 영속에 털갈이의 개시로부터 약 3 시간. 인세는 영속에 털갈이의 발병 다음과 같은 다양한 시간 지점에서 IL2Q 덴 드라이트의 부분을 보여줍니다. IL2Q 가지의 급속한 확장은 영속에 털갈이의 발병 다음 약 5 시간을 시작 발생합니다. 스케일 바, 10 μm의.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
영속 별 신경 가소성 및 기타 영속 관련 형태 학적 변화를 검사 통제되고 하나 유전자 변이 (즉, DAF-C 돌연변이)를 통해 또는 페로몬 야생 형 동물의 노출에 의해 dauers의 안정적인 형성이 필요합니다. dauers를 유도하는 유전자 변이의 사용이 편리하지만, 그 결과를 혼란시킬 수있다. 따라서 DAF-C 돌연변이로 수집 된 데이터는 이후 영속 페로몬에 노출 영속 단계를 입력하도록 유도 야생형 동물과 확인해야합니다.
원유 영속 페로몬의 생산은 상대적으로 간단하고,이 프로토콜의 변화는 18을 게시됩니다. 오염 수를 제외하고, 여기에 제시된 방법은 매우 안정적입니다. 추출물을 생성하기 위해 S 미디어 배양액 19 선충 큰 밀도를 배양의 표준 방법을 사용한다. initia의 금액 유연성 다량 존재리터 선충 접종은 액체 배양에 추가됩니다. 선충의 큰 숫자로 시작하면 절차를 신속하게 처리됩니다. 그러나, 초기 선충 접종 모두 오염되지 않도록주의하는 것이 중요하다. 곰팡이와 세균 오염은 모두 액체 배지에서 성장하는 동안 발생할 수 있습니다. 진균의 오염을 쉽게 균사의 존재에 의해 검출 될 수있다. 세균 오염을 평가하는 것이 더 어렵다. 액체 배양 나열된 배양 기간 후 곧바로 취소하지 않는 경우 일반적으로 세균 오염이 관찰 될 수있다. 충분한 페로몬을 생산하는 데 필요한 전체 선충 인구 밀도의 유연성이있다. 예를 들어, 선충 25,000 / ml의 농도는 dauers를 유도하는데 효과적 페로몬을 생성하기에 충분하다. 다른 방법의 Phe의 오비탈 쉐이커 후속 정제에 RT에서 O / N의 인큐베이션 M9 완충액 (~ 50 ㎖)의 작은 볼륨으로 액체 배양에서 선충 전사 이루어져방법으로는 본원에 기재된 romone. 이 대안은 효과적이지만, 더 높은 EC 50 (즉, 덜 강력한)와 페로몬을 생산하고 있습니다.
원유 페로몬의 각 배치는 효능이 다를 수 있습니다, 그것은 영속을 유도에서 효과에 대한 표본을 테스트하는 것이 중요합니다. 많은 애플리케이션마다 페로몬 농도 복제에 대해 하나의 단일 생물 검정법의 효능은 일반적인 추정치를 제공하기에 충분하다. 그러나, 독립적으로 수행 용량 - 반응 생물 검정 사이에 상당한 차이가있을 수 있습니다. 정확한 유효 용량을 결정하기 위해 3 복제 생물 검정 - 실험 형성 영속 및 비 영속 개발 간의 미묘한 균형을 요구할 경우, 따라서, 이는 2를 수행하는 것이 필요하다. 선충 생물학 ascarosides의 중요성이 널리 인식되고 차후에, 그것은 합리적 비용으로 합성 영속 페로몬을 구입하는 것이 가능할 수있다.
영속 특정 NEU의 발견IL2s에서 로날 리모델링 스트레스에 의한 신경 가소성의 분자 메커니즘 연구를위한 플랫폼을 제공합니다. 특정 유전자가 신경 가소성을 조절하는 메커니즘을 파악하기 위해, 실시간으로 리모델링 과정을 수행 할 필요가있다. 생체 내 이미징 IL2의 방법은 이전 C. 토대로 엘레 방법 (22, 24)은, 25. 영속 형성시에 촬상 한 장애물 영속 복구 가능성이다. 가장 간단한 해결책은 처음 DAF-C 돌연변이를 사용하는 것이다. 어떤 결과의 확인은 본원에 기재된 방법을 이용하여 비 DAF-C 배경에서 수행 될 수있다.
싱 Sulston는 영속 형성 (25)의 생체 내 이미징을위한 몇 가지 장애물을 지적했다. 이 포함 새로 형성된 dauers는 반경 수축 다음 현미경 슬라이드 및 통제되지 않은 움직임을 탈출. 미세 비드의 사용은 탈출 (22)의 가능성을 제거했다. 하우영속 탈피에 약 10 시간을 발생 반경 수축 VER 여전히 후속 영상에 대한 어려움을 만듭니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N2 C. elegans Bristol strain | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III | Upon request from Schroeder lab | ||
| PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V | Upon request from Schroeder lab | ||
| JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Petri dishes | Tritech Research | 60 mm T3308, 35 mm T3501 | |
| NGM agar | Various | 3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4 | |
| S Media | Various | S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4. | |
| Dauer pheromone plates for dose-response assay | Various | Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml. Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube. Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying). | |
| Microsphere beads 0.1 micron | Polysciences Inc. | 00876-15 | |
| M9 buffer | Various | Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving |
References
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