In vivo de imagens de Dauer específica Neuronal Remodelação em C. elegans

Abstract

Os mecanismos que controlam a plasticidade fenotípica induzida por estresse em animais são muitas vezes complexas e difíceis de estudar in vivo. Um exemplo clássico de plasticidade induzida por estresse é a fase de Dauer C. elegans. Dauers estão numa fase de desenvolvimento larvar alternativa formada em condições de baixas concentrações de alimentos de bactérias e concentrações elevadas de uma feromona dauer. Dauers exibir extensa plasticidade do desenvolvimento e comportamental. Por exemplo, um conjunto de quatro quadrante interno-labial (IL2Q) neurônios passam por extensa remodelação reversível durante a formação Dauer. Utilizando a entrada de potenciais vias de regulação dauer bem conhecido, um método previamente estabelecido para a produção de dauer bruto feromona de culturas em larga escala de nematóides líquido é demonstrada. Com este método, uma concentração de 50.000 - 75.000 nemátodos / ml de líquido de cultura é suficiente para produzir uma altamente potente feromona dauer bruto. A potência de feromonas em bruto é determined por um bioensaio de resposta à dose. Por fim, os métodos utilizados para in vivo de lapso de tempo de imagem dos IL2Qs durante a formação Dauer são descritos.

Introduction

Plasticidade fenotípica, inclusive plasticidade do desenvolvimento e comportamental, é importante para as adaptações a condições ambientais adversas e é considerada uma força motriz na evolução ^1. C. elegans é um organismo modelo frequentemente utilizado para estudos em desenvolvimento e neurobiologia. Sob condições ideais, C. elegans, desenvolvido em quatro fases larvares antes de entrar na fase adulta reprodutiva. No entanto, em condições de baixa disponibilidade de alimentos e altas densidades populacionais, C. elegans pode sofrer uma chave de desenvolvimento e entrar em um estágio Dauer longa vida e estresse resistente ^2. Dauers exibir várias diferenças morfológicas e comportamentais de não-dauers que provavelmente medeiam esta resistência ao estresse. Os estímulos ambientais e vias genéticas que regulam a entrada Dauer têm sido amplamente descrito ^{3, 4, 5, 6, 7.} Contudo, os mecanismos moleculares que controlam alterações fenotípicas individuais que ocorrem dformação Dauer urante são menos conhecidas.

O exame de fenótipos específicos de Dauer requer a produção de animais dauer. Isto pode ser realizado de três maneiras: 1) colheita de uma cultura de C. fome elegans, 2) Utilização de formação dauer constitutiva (daf-c) mutantes, 3) indução da formação, através de feromonas dauer purificado. É relativamente simples para escolher dauers de uma placa com um padrão NGM C. população elegans que esgotou a sua bacteriana-abastecimento alimentar. Nas nossas mãos, uma placa NGM padrão originalmente semeada com 50 ul de OP50 Escherichia coli, deixou-se crescer durante 3 dias e em seguida inoculados com 3 - hermafroditas 4 adultos mantida a 25 ° C irá esgotar a fonte de alimento dentro de uma semana e produzem vários milhares dauers dentro de 3 dias adicionais (além de inúmeras não-dauers famintas). No entanto, este método não é satisfatório para os processos de exame que ocorrem durante a muda em dAuer. É difícil determinar qual dos vários milhares de animais em um prato típico faminto estão entrando em Dauer. Além disso, o uso de uma placa de fome oferece qualquer possibilidade de sincronização. A utilização de mutantes daf-c permite a sincronização e a geração segura de dauers. No entanto, não há qualquer garantia de que uma mutação daf-c em particular não irá afectar outros fenótipos específicos de Dauer sozinho ou em combinação com outras mutações.

A presença de um feromônio dauer estava implícito pela primeira vez por Cassada e Russell e mais tarde demonstrado por Dourado e Riddle. A feromona dauer já foi caracterizada quimicamente ^{2, 8, 9, 10.} A feromona purificado é constituído por uma mistura complexa de ascarosides, que em diferentes formas de regular a ambos os processos comportamentais e de desenvolvimento ^{9, 11.} Utilização de um extracto bruto de feromonas dauer permite a indução controlada fiável do dauers sincronizados num fundo de tipo selvagem. O sistema nervoso e as células gliais associadas sofrer remodelação durante Dauer larva formação ^{12, 13, 14.} Algumas dessas mudanças são irreversíveis, como a remodelação das células da glia durante Dauer ^{13, 14.} Porém outros eventos de remodelação são reversíveis após um retorno à favorável condições ambientais. Por exemplo, um conjunto de quatro neurônios IL2Q sofrer remodelação neuronal rápida e reversível durante a formação Dauer incluindo: arborização dendrito, a transferência do único dendrítica de neurônios e axônios multidendritic remodelação ^12. Os métodos aqui permitem a imagiologia in vivo de confiança de neuroplasticidade induzida pelo stress num modelo de organismo. Os métodos apresentados para a produção e teste de feromona dauer bruto são descritos anteriormente e compilada a partir de várias fontes de ^{4, 8, 15, 16, 17, 18.}

Protocol

1. Crude Dauer Feromônio Produção

1. Crescer OP50 E. coli a partir de uma única colónia O / N a 37 ° C, agitando, em 100 ml de caldo LB a 200 rpm. NOTA: Este cultura D / N pode ser feito com antecedência e guardadas a 4 ° C.
2. Crescer N2 C. elegans em junho 15-20 cm placas de Petri contendo ágar NGM (ver receita na Tabela 1) inoculadas com 50 ul de E. OP50 coli até que as bactérias está quase esgotada ^19.
3. Faça 5x 250 ml de S mídia (ver receita na Tabela 1) em 1 L frascos Erlenmeyer de ^19. NOTA: Esta solução pode ser feita com antecedência.
4. Crescer uma cultura de OP50 E. coli em 4 L de caldo LB S / N por meio da inoculação de 1 ml de OP50 em E. coli e agitação a 37 ° C durante 16 horas.
5. Lave os nematóides das placas (passo 1.2) com 1 ml de solução S basal (ver receita na Tabela 1) e nematóides de transferência de 4-5 placas em cada um dos quatro frascos de 1 L de Erlenmeyer com os meios de comunicação S preparada no passo 1.3 (4 5 placaspara cada frasco) ^19.
6. Centrifuga-se o passo de OP50 1,4 a 650 xg durante 10 min e remover o sobrenadante. Ressuspender cada sedimento bacteriano em 10 ml de solução de S basal. Transferir quantidades iguais de bactérias em suspensão para cada frasco de nematóides.
7. Colocar os frascos num agitador orbital, à temperatura ambiente (20 - 25 ° C) e 100 - 150 rpm durante 4-5 dias, até que a solução começa a limpar, indicando uma exaustão de alimentos.
8. Uma vez que a comida está esgotado, crescer outra cultura O / N de OP50 E. coli em 4x 1 L de caldo de LB. Centrifuga-se as bactérias a 650 xg durante 10 min e adicionar uma pelete a partir de um balão para cada um dos frascos S media com nematóides. Devolver os frascos S de mídia para o agitador orbital, como no passo 1.7, por mais 3-4 dias até que o alimento está esgotado novamente.
9. Tomar um ~ alíquota de 1 ml de solução de cada frasco e estimar a concentração de nemátodos por sub-amostragem de 1 ul de cada alíquota de 1 ml e a contagem do número de nemátodos. NOTA: Opopulação do nematóide deve ser 50.000 - 75.000 nematóides / ml. A esta concentração, a maior parte dos nemátodes são dauers.
10. Descarte qualquer frascos contaminados. NOTA: Contaminação frequentemente se manifesta como hifas fúngicas visto durante a etapa 1.9.
11. Nemátodos de centrifugar a 4000 xg durante 10 min a 4 ° C. Desprezar o pelete nemátodo e reter o sobrenadante. Alternativamente, consulte a discussão para o uso desses animais para fazer um feromônio de baixa potência.
12. Filtrar o sobrenadante com # 1 filtro de papel Whatman. NOTA: uma garrafa térmica vai acelerar este processo.
13. Além disso filtrar o sobrenadante através de unidades de filtração de 0,45 um vácuo estéril. NOTA: O filtrado pode ser mantido O / N a 4 ° C ou prosseguir para 1,14.
14. Adicionar-se o filtrado para uma proveta de 2 L com uma barra de agitação. Coloque em um exaustor em uma placa de aquecimento mexa. Deixe ferver, mexendo e evaporar a cerca de 200 ml. Transferir a solução para um copo de 500 ml. Prosseguir a ebulição até cerca de 50 ml são lepés NOTA: Cuidados devem ser tomados durante este passo como é possível que a solução para transbordar. A cor dos finais de 50 ml é um castanho escuro. Em qualquer altura durante o processo de cozimento, o calor pode ser desligado e o filtrado foi armazenado O / N à temperatura ambiente ou a 4 ° C.
15. Deixar arrefecer e centrifugar durante 5 minutos a 1000 x g. Verter o sobrenadante para uma proveta de 100 ml e descartar o sedimento.
16. Ferva o sobrenadante até uma crosta marrom. Retire do fogo e quebrar a crosta com uma espátula. Adicionar suficiente de etanol prova 200 para cobrir a casca. Cobrir o copo com Parafilm e deixe descansar O / N à temperatura ambiente. Deitar fora o etanol em um copo limpo e colocado para o lado. Adicionar etanol fresco para cobrir a casca. Repita extrações O / N 3 vezes. Reúnem-se os extratos.
17. Usar uma bomba de vácuo para secar os extractos de etanol. Se uma bomba de vácuo não está disponível, adicionar o extracto de etanol para um recipiente limpo e quente a 50 ° C com agitação numa hotte. NOTA: Uma vez que o etanol tenha evaporado um resíduo pegajoso de lcor marrom ight deve permanecer. Se o aquecimento é usado, deve ser tomado cuidado para não queimar a solução por meio de aquecimento por muito tempo.
18. Dissolve-se resíduo em 10 ml de água destilada estéril. Filtro de esterilizar a solução com um filtro de seringa de 0,22 um e armazenar a -20 ° C em alíquotas de 1 ml. NOTA: 1 ml de água é utilizada para dissolver o resíduo, para cada 100 ml de cultura inicial de nemátodos líquido. Por exemplo, se um dos frascos de cultura líquido é rejeitado devido a contaminação, em seguida, ajustar a quantidade de água utilizada para dissolver o resíduo.

2 Determinação do Feromônio Dose Response

1. Prepare dauer feromona fazendo 6x 5 ml de meio de agar com NGM Noble, sem peptona, e suplementado com 50 ug / ml de sulfato de estreptomicina e uma gama de dauer feromona (ver receita na Tabela 1) ^{4, 19.} Misturar os componentes num 13x100 mm tubo de cultura de vidro, ferver mais um bico de Bunsen, em seguida, despeje em 3 centímetros placas de Petri.
2. Pesar amtubo icrocentrifuge. Adicionar 1 ml de cultura O / N do E. coli OP50 para o tubo e centrifuga-se a 17.000 x g ~ em um tubo de microcentrífuga. Remover todo o sobrenadante. Pesa-se o tubo de novo e determinar o peso do sedimento de bactérias. Ressuspender o sedimento com tampão M9 (ver receita na Tabela 1) para uma concentração final de 4% ^(w / _v). Aliquota de 10 ul da suspensão bacteriana sobre o centro de cada placa ⁴ de feromonas. Placas de loja O / N à temperatura ambiente.
3. Escolha 10-15 grávidas N2 do tipo selvagem hermafroditas, um dia após a muda até a idade adulta para as placas de feromônio ^4. Armazenar as placas a 25 ° C durante 3-4 horas.
4. Escolha fora de todos os hermafroditas adultos. Registre o número de ovos postos por cada placa. Selar as placas com parafilme e regresso a 25 ° C durante 3 dias ^17.
5. Contagem da percentagem de dauers (Figura 2). Nota: Para ambos os métodos, é importante notar que dauers (e, em menor extenda não dauers) vai subir as paredes e na tampa de placas de Petri. Por isso, é importante examinar todas as superfícies do prato para nematóides.
6. Ajustar os dados a uma curva de dose-resposta e calcular a concentração de _EC90 de feromona (feromona suficiente para induzir 90% de animais para formar dauers) como mostrado na Figura 3 Nota:. Nós normalmente utilizam um modelo de regressão logística para estimar a CE ₉₀ , mas diferentes pacotes de software de estatística pode ter métodos alternativos que produzem estimativas similares.

3 Imagens ao vivo de Dauer IL2 Neurônios

1. Prepare pratos Dauer feromônio como no protocolo 2, utilizando o valor de EC ₉₀ determinou na etapa 2.6.
2. Induzir dauers usando os métodos no protocolo 2 com uma cepa carregando um IL2 repórter transgene integrado (myIs13 [P _klp-6 :: GFP], myIs14 [P _klp-6 :: GFP], myIs16 [P KLP-6 :: tdTomato] ou qIs56 [P _lag-2 :: GFP]) ^{12, 20, 21.} NOTA: Se q Is56 é usada, a expressão de GFP não será visível nos IL2Qs até várias horas para a muda Dauer e alguns dos eventos de remodelação iniciais não será visível. Além disso, enquanto o sinal de fluorescência a partir do _{desfasamento P-2} :: transgene GFP em última análise, é mais brilhante nos IL2s durante dauer que os _{P-6 klp} repórteres fluorescentes, o _{desfasamento P-2} :: transgene gfp também fracamente expressa nos músculos da cabeça que pode mascarar os ramos IL2 finas.
3. Após a postura dos ovos, remover os hermafroditas adultos, selar as placas com parafilme e incubar durante 34 horas a 25 ° C ^17. NOTA: O período de tempo para a muda Dauer varia ligeiramente entre os indivíduos. O período mais rápido de dendrito arborização começa 4-5 horas após o início da muda Dauer (39-44pós h a 25 ° C) ^12, que estabelece-ovo.
4. O dia antes da imagem, formam uma solução de 10% ^(w / _v) de agarose em tampão M9 com dauer feromona para a concentração _EC90. Alíquota de aproximadamente 100 mL de agarose numa lâmina de microscópio e rapidamente, mas com cuidado, coloque outro slide na parte superior para criar uma superfície plana agarose. Após a agarose solidificou, enrole os slides em saran wrap e armazenar em uma câmara de umidade (caixa ponteira com papel-toalha molhada).
5. Após o período de incubação 34 h, examinar as placas de feromônio para nematóides que pararam de bombeamento da faringe. Lâminas separadas de tal forma que apenas uma superfície de uma lâmina de agarose tem nele. Escolher um ou mais nematóides numa almofada de agarose a 10% e 1 μ l de 0,1 micron esferas de poliestireno de ^22. NOTA: Com uma população bem sincronizados, a maioria dos nematóides sobre a placa será entrar na muda de L2D de dauer. No entanto, pode haver variação entre indivíduos. Por isso, é importante observar características adicionais (oclusão do estoma, a remodelação da faringe) para estimar a quantidade de tempo que os animais tenham sido dentro da muda Dauer (ver resultados representativos, por exemplo).
6. Determinar a orientação (esquerda / direita, dorsal / ventral) do nematóide. Capturar imagens Z-stack de um dendrito IL2Q em 100x com a menor intensidade de fluorescência possível a cada 15 minutos ou quando necessário para o experimento específico. Continue a captura de imagens até que o nematóide se separou da cutícula L2D e imobilização é impossível ou se o animal se recupera de Dauer (faringe começa bombeamento). Quando não imaginando ativamente, coloque o slide em uma câmara de umidade. NOTA: Nós usamos um microscópio de epifluorescência com uma motorizada contraste fase e de interferência diferencial (DIC) óptica.

Representative Results

A produção de resultados Dauer bruto feromônio em um líquido amarelo (Figura 1) que é tanto calor e frio estável. Alíquotas de feromona bruto são armazenadas a -20 ° C indefinidamente sem qualquer perda na actividade óbvia. Após a produção da feromona, um único bioensaio de dose-resposta é suficiente para uma estimativa da potência. No entanto, para a maioria das experiências, é necessário repetir o bioensaio de 2 - 3 vezes e ter uma média de cada experimento. Os resultados representativos de dois ensaios biológicos feromonas são apresentados na Figura 3. Partir destes dados um EC ₅₀ e EC ₉₀ podem ser calculados.

Além disso a resistência ao sulfato de dodecilo e sódio ^2, dauers podem ser reconhecidos por várias características morfológicas, incluindo um estoma oclusa, asa lateral, corpos refractários na hipoderme anterior e uma faringe encolhido (Figura 2 e Figura 4A for larvas L2). Dauers também têm várias características comportamentais distintas incluindo:. Uma propensão para permanecer comportamentalmente quiescente, a presença de uma estratégia ocasional dispersão chamado nictation, supressão de movimentos da cabeça de forragem, a supressão de bombeamento da faringe e da indução do ducto excretório pulsando ^{2, 5, 23} A características comportamentais mostram variabilidade entre os indivíduos.

A muda em dauer demora cerca de 12 horas a partir do fim da fase de pré-L2 dauer (L2D) ^4. Este período corresponde ao crescimento estereotipada dos mandris IL2Q. O primeiro evento notável da muda em Dauer é a supressão de bombeamento da faringe. Supressão de bombeamento é comum a todas as mudas em C. elegans. No entanto, a supressão da faringe de bombagem continua durante toda a fase dauer e termina a cerca de 4 horas, após o retorno do animal às condições ambientais favoráveis. Durante o período inicial de bombeamento da faringesupressão, uma camada de cutícula mais formas do estoma. Essas alterações ocorrem durante a primeira hora após o início da muda em dauer. Durante este período inicial existe frequentemente a formação de um processo adicional de neurites que se estende desde os corpos celulares IL2Q. No entanto, este processo adicional inicial geralmente retrai dentro de 2 horas após o início da muda em dauer ^12.

Durante as horas de 2-5 após o início da muda em Dauer faringe começa a remodelar mostrando uma redução gradual no tamanho (Figura 4B). Concomitantemente, a forma e pontos lacrimais curto retrair ao longo do dendrito primário IL2Q (Figura 5). Durante as horas de 4-8 após o início da muda, o corpo é submetido a uma contracção radial gradual resultando na separação do nemátodo da cutícula L2D (Figura 4C). Este período é correlacionado com conseqüência de 2 ° dendrites dos dendritos primários e o estabelecimento de umdendrites ADICIONAIS dos corpos celulares IL2Q (específico do Dauer primário ° dendrites-1D). O crescimento dendrítico não é constante, mas em vez caracteriza-se por tanto a dinâmica de formação e de retracção de processos, tal como ilustrado na Figura 5. Do 2 ° e 1d ° dendritos geralmente se estendem para ventral (por IL2Vs) ou dorsal (por IL2Ds midlines). Uma vez que a cutícula dauer está completamente separada da cutícula L2D, a aplicação de luz fluorescente faz com que o animal se rapidamente girar sobre o seu eixo longitudinal, fazendo imagiologia subsequente desafio. As tentativas para remover o animal a desenvolver a partir do slide, mecanicamente remover a cutícula L2D, e montar o animal em um novo slide, mantendo desenvolvimento Dauer não foram bem sucedidos.

Figura 1 bruto é dauer feromonaum líquido amarelo que pode ser armazenado indefinidamente a -20 ° C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 micrografias DIC de C. elegans dauers com Dauer típico características morfológicas. vista (A) dorsal meio do corpo de um dauer demonstrando um estoma oclusa (seta) e uma faringe encolhido com bulbo terminal de forma rectangular (descrito no vermelho, comparar com larva L2 mostrada na Figura 4A). Dauers recém-formados freqüentemente retêm parte da cutícula L2D (seta). View (B) Dorsal da hipoderme que mostram corpos altamente refrácteis (seta) típico de dauers. Novamente a cutícula L2D é evidente (ponta de seta). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura ensaio resposta 3. Dose para Dauer bruto feromônio. L1 animais expostos a níveis crescentes de feromônio dauer incorporados mídia NGM modificados são mais propensos a formar dauers. Os dados foram recolhidos e agrupados a partir de duas experiências separadas, excepto para as seguintes concentrações, que apenas foram testados uma vez: 0,05%, 2% e 4%. Os dados foram ajustados a uma curva dose-resposta sigmoidal. Os valores de R ² e EC foram calculados por meio de regressão logística. O número de animais analisados ​​para cada concentração é a seguinte: 0% n = 299, 0,05% de n = 81, 0,1% de n = 352, 0,5% de n = 368, 1% de n = 241, 2% n = 125, 4% n = 155. As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95%.

Figura 4 DIC lateral direito vista micrografias de C. elegans, durante diferentes fases da muda em dauer. (A) L2 animal com bulbo típico do terminal arredondada da faringe (descrito em vermelho). (B) Cerca de 3 horas após a muda em dauer, a lâmpada de terminal está a diminuir e a cutícula L2D começa para separar a cutícula dauer recém-formado (ponta de seta). (C) Cerca de 10 horas após o início da muda dauer, o animal foi submetido a contracção radial extensiva e descolamento da cutícula L2D (ponta de seta). Ocasionalmente, o cutícula alinhado ducto excretório da fase L2D (seta) pode ser visto ainda ligado ao desenvolvimento dauer. Barras de escala, 10 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 laterais micrografias de epifluorescência vista de um único animal que expressa a IL2 repórter P _klp-6 :: tdTomato. Top, imagem de corpo inteiro de neurônios IL2 aproximadamente 3 horas após o início da muda em Dauer. Inset mostra a parte da IL2Q dendrito em vários pontos de tempo-após o início da muda em Dauer. A rápida expansão dos ramos IL2Q ocorre começando cerca de 5 horas após o início da muda em Dauer. As barras de escala, 10 ^ m."target =" ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Um exame de neuroplasticidade específicos de dauer e outras alterações morfológicas associadas à Dauer requer controlada e fiável a formação de dauers quer através de mutação genética (mutantes ou seja, daf-c) ou por exposição de animais de tipo selvagem de feromona. Enquanto a utilização de uma mutação genética para induzir dauers é conveniente, pode confundir os resultados. Assim, os dados coletados com mutações daf-C deve ser posteriormente confirmada com tipo selvagem animais induzidos a entrar na fase Dauer pela exposição a Dauer feromônio.

A produção de crude Dauer feromônio é relativamente simples e variações deste protocolo são publicados ^18. Com a possível exceção de contaminação, o método aqui apresentado é muito confiável. Para produzir o extrato, usamos um método padrão de cultura de grandes densidades de nematóides em S meios líquidos de cultura ^19. Existe uma grande quantidade de flexibilidade na quantidade de INITIAl nemátodo inoculo adicionado para a cultura líquida. Começando com um maior número de nemátodos vai acelerar o processo. No entanto, é importante assegurar que todo o inoculo inicial nematóide é livre de contaminação. Tanto a contaminação fúngica e bacteriana podem surgir durante o crescimento em meios líquidos. Contaminação por fungos pode ser facilmente detectada pela presença de hifas. A contaminação bacteriana é mais difícil de avaliar. Normalmente, um contaminante bacteriana pode ser observado se a cultura líquida não limpar logo após os períodos de incubação listados. Há flexibilidade no total de densidade populacional do nematóide necessária para produzir feromônio suficiente. Por exemplo, uma concentração de 25.000 nemátodos / ml é suficiente para produzir uma feromona eficaz na indução dauers. Um método alternativo consiste em transferir os nemátodos a partir de uma cultura líquida com um pequeno volume de tampão M9 (~ 50 ml) seguido por uma O / N de incubação à TA num agitador orbital e subsequente purificação do pheRomone pelos métodos aqui descritos. Esta alternativa é eficaz, mas produz uma feromona com um EC ₅₀ mais elevado (isto é, menos potente).

À medida que cada lote de feromonas em bruto pode variar em potência, é importante testar uma subamostra para eficácia na indução de dauer. Para muitas aplicações um único bioensaio com uma réplica para cada concentração de feromônio é suficiente para fornecer uma estimativa geral de potência. No entanto, pode haver uma variação significativa entre os bioensaios de dose-resposta realizados independentemente. Portanto, se as experiências exigem um delicado equilíbrio entre a formação e desenvolvimento dauer não dauer, será necessário executar 2-3 bioensaios replicados para determinar uma dose exacta eficaz. No futuro, como a importância da ascarosides em biologia do nematóide é mais amplamente reconhecido, pode ser possível comprar sintetizado feromônio dauer a um custo razoável.

O achado de neu-specific Dauerremodelação ronal nos IL2s fornece uma plataforma para o estudo dos mecanismos moleculares da neuroplasticidade induzida pelo estresse. Para identificar o mecanismo pelo qual os genes específicos regulam neuroplasticidade, pode ser necessário para seguir o processo de remodelação em tempo real. O método de IL2 in vivo de imagens baseia anterior C. métodos elegans ^{22, 24, 25.} Uma dificuldade para a imagem durante a formação Dauer é a possibilidade de recuperação Dauer. A solução mais fácil é usar inicialmente uma mutação daf-c. Confirmação de quaisquer resultados pode então ser realizada em um daf-c fundo não utilizando os métodos aqui descritos.

Singh e Sulston observou vários obstáculos para a imagem in vivo da formação Dauer ^25. Estes dauers recém-formados incluídos escapar para fora da lâmina de microscópio e movimento descontrolado seguinte encolhimento radial. O uso de microesferas eliminou a possibilidade de fuga ^22. However o encolhimento radial que ocorre cerca de 10 horas para a muda Dauer ainda cria dificuldades para imagem seguinte.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
N2 C. elegans Bristol strain	Caenorhabditis Genetics Center
PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III	Upon request from Schroeder lab
PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V	Upon request from Schroeder lab
JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V	Caenorhabditis Genetics Center
OP50 E. coli	Caenorhabditis Genetics Center
Petri dishes	Tritech Research	60 mm T3308, 35 mm T3501
NGM agar	Various		3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4
S Media	Various		S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4.
Dauer pheromone plates for dose-response assay	Various		Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml.  Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.  Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).
Microsphere beads 0.1 micron	Polysciences Inc.	00876-15
M9 buffer	Various		Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving