Abstract
Hayvanlarda stres ile indüklenen fenotipik esneklik kontrol mekanizmaları incelemek için in vivo olarak çoğunlukla kompleks ve zordur. Stres ile indüklenen plastisite klasik bir örneği, C Dauer aşamasıdır elegans. Dauers bakteriyel gıda ve Dauer feromon yüksek konsantrasyonlarının düşük konsantrasyonlarda koşulları altında oluşan alternatif bir gelişim larva bulunmaktadır. Dauers kapsamlı gelişimsel ve davranışsal plastisite gösterir. Örneğin, dört iç dudak kadran bir dizi (IL2Q) nöronları Dauer oluşumu sırasında Reverzibl remodeling tabi tutulur. Büyük ölçekli sıvı nematod kültürlerinden ham Dauer feromonunun üretimi için iyi bilinen çevre yollarını düzenlemeye Dauer girişi, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntemle, 50,000 'lik bir konsantrasyon - sıvı kültürü 75,000 nematod / ml bir yüksek ölçüde kuvvetli ham Dauer feromon üretmek için yeterlidir. Ham feromon gücü olan deteBir doz-tepki biyo-tahlil ile rmined. Son olarak, Dauer oluşumu sırasında IL2Qs in vivo zaman atlamalı görüntüleme için kullanılan yöntemler tarif edilmiştir.
Introduction
Gelişimsel ve davranışsal plastisite fenatipik plastisite, olumsuz çevre koşullarına adaptasyonları için önemlidir ve evrim 1 itici bir güç olarak kabul edilir. C. elegans sık geliştirme ve nörobiyoloji çalışmalar için kullanılan bir model organizmadır. İdeal koşullar altında, C. elegans yetişkin üreme aşamasına başlamadan önce dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Ancak, düşük gıda kullanılabilirlik ve yüksek nüfus yoğunluğu, C koşulları altında elegans gelişimsel anahtarı geçmesi ve uzun ömürlü ve stres dayanıklı Dauer evre 2 içine girebilirsiniz. Dauers olasılıkla bu stres direnci aracılık olmayan dauers birkaç morfolojik ve davranışsal farklılıklar gösterecektir. Dauer girişi düzenleyen çevre kuyrukları ve genetik yollar yoğun oldu, 5, 4, 3 6, 7 nitelendirdiler. Ancak, bireysel fenotipik değişiklikleri kontrol eden moleküler mekanizmalar d meydana olduğunurada Dauer oluşumu daha az iyi anlaşılmaktadır.
Dauer özgü fenotiplerinin incelenmesi Dauer hayvanların üretimini gerektirir. Bu üç şekilde yapılabilir: 1) C bir açlıktan kültüründen Çekme elegans, 2) Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutantlar, arıtılmış feromon sayesinde Dauer oluşumu 3) ndüksiyonunun kullanımı. Bir C ile standart bir NGM plaka ikinci dauers almak için nispeten basit onun bakteriyel gıda arzını tükenmiş elegans nüfus. Elimizde olanlar, standart bir NGM plaka orjinal 3 gün büyümeye bırakıldı ve daha sonra 3 ile aşılanmış Escherichia coli OP50, 50 ul ile tohumlanmış - 4 ergin hermafrodit bireyler bir hafta içinde gıda kaynağı dışarı atmasını sağlar ve birkaç bin üretecek 25 ° C'de tutuldu İlave bir 3 gün içinde dauers (çok sayıda açlıktan olmayan dauers ek olarak). Bununla birlikte, bu yöntem, d içine molt sırasında meydana gelen incelenmesi işlemleri için tatmin edici değildirauer. Bu Dauer girmektedir tipik bir açlıktan plaka üzerinde bir kaç bin hayvan belirlemek zordur. Ayrıca, hasret plaka kullanımı senkronizasyonu için hiçbir imkanı sunuyor. DAF-C mutantlarının kullanımı senkronizasyon ve dauers güvenilir oluşturulmasına izin verir. Ancak, belirli bir Daf-c mutasyonu tek başına veya ek mutasyonlar ile birlikte diğer Dauer özgü fenotipleri etkilemez garantisi yoktur.
Bir Dauer feromon varlığı ilk Cassada ve Russell tarafından ima ve daha sonra Altın ve Riddle tarafından gösterilmiştir. Dauer feromon yana kimyasal olarak 9, 10 8, 2 karakterize edilmiştir. Arıtılmış feromon farklı şekillerde 9, bir ham özü Dauer feromon 11. Kullanımlar sağlar hem hareketsel hem de gelişim süreçleri düzenleyen ascarosides karmaşık bir harmanından oluşur doğal tipte bir arka senkronize dauers güvenilir kontrol indüksiyonu. Sinir sistemi ve ilişkili glial hücreler Dauer larva oluşumu 12, 13, 14 sırasında biçimlenme geçmesi. Bu değişikliklerin bazıları, Dauer 13, 14 sırasında glia hücrelerinin yeniden olarak, geri döndürülemez. Ancak, başka biçimlenme olayları olumlu bir dönüş üzerine geri dönüşümlüdür çevre koşulları. Dendrit arborization, multidendritic nöronlar ve akson 12 biçimlenme tek dendritik bir anahtarı: Örneğin, dört IL2Q nöronların bir dizi dahil Dauer oluşumu sırasında hızlı ve geri dönüşümlü nöronal biçimlenme tabi. Buradaki yöntemler, bir model organizmada strese bağlı nöroplastisitesi güvenilir bir in vivo görüntüleme için izin verir. Üretim ve ham Dauer feromon testleri için sunulan yöntemler, daha önce çeşitli kaynaklardan 4, 8, 15, 16, 17, 18 tarif edilen ve derlenmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ham Dauer Feromon Üretimi
- OP50 E. büyütün Tek bir koloni, O / N 37 ° C 'de E. coli 200 rpm'de LB suyu 100 ml çalkalandı. NOT: Bu göre O / N kültür önceden yapılmış ve 4 ° C'de saklanabilir.
- N2 C büyütün elegans, 15 - 20 OP50 E: 50 ul NGM ağarma (Tablo 1 'de tarif bak) ile 6 cm Petri kapları coli bakteri kadar neredeyse 19 tükenmiş.
- 1 L Erlenmeyer'de S medya 5x 250 ml (Tablo 1 tarifi görün) Marka 19 şişeleri. NOT: Bu çözüm önceden yapılabilir.
- OP50 E. kültürünü büyütün E. coli 'de OP50 1 ml LB suyu aşılayarak O 4 L / K coli E. coli ve 16 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak.
- , (S bazal çözeltisi (Tablo 1 'de tarif bak) ve Aşama 1.3' de hazırlanan media, 4: 1 L'lik Erlenmeyer kaplanna her birinin içine, 4-5 plakalarından buraya nematod 1 ml levhalar (adım 1.2) için 4- nematodları yıkayın 5 plakalarıHer şişe için) 19,.
- 10 dakika boyunca 650 x g'de aşama 1.4 OP50 santrifüj ve supernatant çıkarın. G taban çözeltisi 10 ml her bir bakteri pelletini. Nematodların her şişeye yeniden süspansiyon haline getirildi bakteri eşit miktarda aktarın.
- Çözelti, yiyecek tükenmesi gösteren temizlemek için başlayana kadar 5 gün - (- 25 ° C'de 20) ve 100 - 4 150 rpm'de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde şişeler yerleştirin.
- Gıda bitince, OP50 E. başka bir O / N kültür büyümek LB suyu 4x 1 L E. coli. 10 dakika boyunca 650 x g'de santrifüj ve bakteri, nematodlar ile media şişelere her bir şişeye bir pelet ekleyin. Gıda daha bitene kadar ilave 3-4 gün boyunca, Aşama 1.7 gibi orbital çalkalayıcıya S ortam şişeler dönün.
- Her bir şişeden bir çözelti ~ 1 ml lik bir alın ve her biri 1 ml'lik bir 1 ul alt-numûne alma ve nematodların sayısını sayarak nematod konsantrasyonu tahmin ediyoruz. NOT:75,000 nematodlar / mL - nematod popülasyonu 50,000 olmalıdır. Bu konsantrasyonda nematod çoğunluğu dauers bulunmaktadır.
- Kirlenmiş şişeleri atın. NOT: Kirlilik sık adımı 1.9 sırasında görülen hyphe'nin olarak tezahür eder.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüje nematodlar. Nematod pelet atın ve süpernatant saklayın. Alternatif olarak, düşük potens feromon yapmak için bu hayvanları kullanarak tartışma bakın.
- # 1 Whatman filtre kağıdı ile süpernatantı Filtresi. NOT: Bir termos bu süreci hızlandırmak olacaktır.
- Ayrıca 0.45 mikron steril vakumlu filtrasyon üniteleri ile süpernatant süzün. Not: Filtrat, 4 ° C'de O / N ya da muhafaza 1,14 devam edilebilir.
- Bir karıştırma çubuğu ile bir 2 L'lik bir kap için filtrat ekleyin. Bir ısıtma karıştırma plakası üzerinde bir çeker ocak içinde yerleştirin. Karıştırılarak bir taşım kaynatın ve yaklaşık 200 ml buharlaşır. 500 ml'lik bir behere çözeltisini. Yaklaşık 50 ml le kadar kaynar Devamft. NOT: çözüm taşmak için mümkün olduğu gibi Bakım bu adım sırasında alınmalıdır. Son 50 ml'lik rengi koyu kahverengi. Pişirme işlemi sırasında herhangi bir zamanda, ısı kapatılabilir ve süzülen madde, oda sıcaklığında ya da 4 ° C 'de O / N saklanır.
- G soğuması ve x 1000 de 5 dakika süreyle santrifüj. 100 ml'lik bir beher içine dökün ve süpernatant pelet atılır.
- Kahverengi bir kabuk yüzer aşağı kaynatın. Ateşten alın ve bir spatula ile kabuk kırmaya. Kabuk karşılamak için yeterli 200 derece etanol ekleyin. Parafilm ile beher örtün ve oda sıcaklığında O / N bekletin. Temiz bir beher içine dökün ve etanol tarafına yerleştirin. Kabuk kapağı taze etanol ekleyin. O / N Extractions 3 kez tekrarlayın. Ekstraktları havuzda toplayın.
- Etanol ekstraktları için bir vakum pompası kullanılır. Bir vakum pompası mevcut değilse, bir çeker ocak içinde, bir taraftan karıştırılırken 50 ° C'ye kadar temiz bir cam deney ve sıcak etanol ile özü ekleyin. NOT: etanol l yapışkan bir kalıntı buharlaştırılarak sonraIght kahverengi kalmalıdır. Isıtma kullanıldığı takdirde, çok uzun süre bakım ısıtılarak çözelti yakmak için özen gösterilmesi gerekmektedir.
- Damıtılmış steril su içinde 10 ml bir tortu çözülür. Filtre 1 ml alikotlar içinde -20 ° C'de bir 0.22 um şırınga filtre ve mağaza bu solüsyon sterilize edin. Not: 1 ml su esas sıvı nematod kültürünün her 100 ml için en eritilmesi için kullanılır. Sıvı kültür şişelerinden bir kirlenme nedeniyle göz ardı edilir, örneğin, daha sonra bir tortu çözmek için kullanılan su miktarını ayarlayın.
Feromon Doz Tepki 2. belirlenmesi
- Peptonu olmadan Noble agar NGM ortamı 6x 5 ml yaparak Dauer feromon hazırlanmakta ve 50 ug / ml streptomisin sülfat ug ve dayanıklı feromon bir dizi ile takviye edilmiştir. 4, 19 (Tablo 1 'de tarife bakınız), bir 13x100 mm Karışım bileşenleri cam kültürü tüp, bir Bunsen beki taşmak, ve daha sonra 3 cm Petri kaplarına dökün.
- Am tartılıricrocentrifuge tüpü. E. göre O / N kültürün 1 ml ekleyin mikrosantrifüj tüp içinde ~ 17.000 x g'de tüp ve santrifüj coli OP50. Yüzer sökün. Yine tüp tartılır ve bakteryel tanelerin ağırlığını belirler. % 4'lük bir konsantrasyon için M9 tampon (Tablo 1 'de tarif bakınız) pelletini (a / h). Her bir kısım feromon plaka 4 merkezinin üzerine bakteri süspansiyonundan 10 ul. Mağaza plakaları O / N, oda sıcaklığında.
- Feromon plakalar 4 üzerine yetişkinliğe molt sonra 10-15 gebe N2 vahşi tip çift cinsiyetli bir gün seçin. 4 saat için 3 - 25 ° C'de plakalar saklayın.
- Yetişkin çift cinsiyetli tüm koparmak. Her plaka için bıraktıkları yumurta sayısını kaydedin. Parafilm ile sızdırmaz şekilde kapatılır ve plakaları, 3 gün 17 boyunca 25 ° C'de geri döner.
- Dauers yüzdesini Sayısı (Şekil 2). Not: her iki yöntem için, dikkat edilmelidir ki dauers (ve daha az bir exÇadır olmayan dauers) duvarlara tırmanmaya ve Petri yemekler kapağın üzerine olacaktır. Bu nematod için yemeğin tüm yüzeyini incelemek için bu nedenle önemlidir.
- Bir doz-tepki eğrisi için verilerin Fit ve Şekil 3'te gösterildiği gibi (dauers meydana getirmek üzere hayvanların% 90 uyarılması için yeterli bir feromon) feromonun EC90 konsantrasyonu tahmin Not:. Normal olarak, AK 90 tahmin etmek için bir lojistik regresyon modeli kullanmak ama farklı istatistiksel yazılım paketi benzer tahminler üretmek alternatif yöntemleri olabilir.
Dauer IL2 Nöronlar 3. Canlı Görüntüleme
- Adım 2.6 belirlenen AT 90 değerini kullanarak protokolü 2 gibi Dauer feromon tabak hazırlayın.
- Entegre IL2 muhabiri transgenini taşıyan bir suş (myIs13 [P klp-6 :: GFP], myIs14 [P klp-6 :: GFP], myIs16 [P protokol 2'de yöntemleri kullanarak dauers Uyarmaktadır
- Yumurtlama izlenerek, ergin hermafrodit bireyler çıkarmak Parafilm ile sızdırmaz plakalar 25 ° C de 17 34 saat boyunca inkübe edilir. NOT: Dauer molt için zaman uzunluğu bireyler arasında biraz değişir. Dauer molt başlangıcından itibaren 5 hr (39 - - dendrit arborization en hızlı dönemdir 4 başlıyor 44saat sonrası yumurtlama 25 ° C) 12,.
- Görüntüleme bir gün önce, EC90 konsantrasyonunda Dauer feromonu ile M9 tampon% 10 ihtiva eden bir çözelti (ağ / hac) agaroz oluşturur. Agaroz kısım yaklaşık 100 ul bir mikroskop lamı üzerine ve hızlı bir şekilde, ancak, hafifçe düz bir yüzey oluşturmak için agaroz üzerine başka bir slayt yerleştirin. Agaroz katılaşmış sonra bir nem odasına (ıslak kağıt havlu ile pipet kutusu), saran sargısına ve mağaza slaytlar sarın.
- 34 saat kuluçka döneminden sonra, yutak pompalamayı durdurdu nematod için feromon plakaları inceleyin. Ayrı slaytlar bir sürgünün sadece bir yüzü üzerinde agaroz sahip bileşimleri içerir. % 10 agaroz pad ve 0.1 mikron polistiren boncuklar 22 1 μ l üzerine bir veya daha fazla nematod seçin. Not: iyi senkronize nüfusu ile plaka üzerinde nematodların çoğunluğu L2D gelen Dauer için molt giren edilecektir. Ancak, i arasında değişimi olabilirndividuals. Bu hayvanlar Dauer molt içinde olmuştur süre (örneğin temsili sonuçlar bakınız) miktarını tahmin etmek için ek özellikler (stoma tıkanıklığı, boğaz yeniden şekillenme) dikkat etmek önemlidir.
- Nematod yönünü (sol / sağ, dorsal / ventral) belirleyin. Mümkün olan en düşük floresan ile 100x büyütmede her 15 dakika bir IL2Q dendritin Z-yığın görüntüleri yakalayabilir veya belirli bir deney için gerektiği gibi. (Yutak pompalama başlar) nematod L2D manikür ayrılmış kadar görüntü yakalamayı devam edin ve hayvan Dauer kurtarır eğer hareketsizlik imkansız ya. Aktif görüntüleme zamanlarda, bir nemlilik bölmesi içinde slayt yerleştirin. NOT: Bir motorlu sahne ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik bir epifluorescent mikroskop kullanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isı, soğuk ve stabil olarak sarı bir sıvı ham Dauer feromon sonuçları (Şekil 1) üretimi. Ham feromon alikotlar aktivitesinde belirgin bir kayıp olmadan, süresiz olarak -20 ° C'de saklanır. Feromonun üretiminin ardından, tekli bir doz-yanıt potens biyolojik tayin, kaba bir tahmin için yeterlidir. 3 kez ve her deneyde bir ortalamasını alın - Bununla birlikte, çoğu deneyleri için bu biyo-analizi tekrar 2 için gereklidir. Iki feromon biyoanalizlere Temsilcisi sonuçları Şekil 3'te verilmiştir. EC 50 ve AK 90 hesaplanabilir Bu verilerden.
Sodyum dodesil sülfat 2 olan dirence ek olarak, dauers kapatılmış bir stoma yanal ala, kırılır cisimlerin ön hipodermiste ve küçülmüş farenks (Şekil 2 ve Şekil 4A fo dahil olmak üzere çeşitli morfolojik özellikleri ile fark edilebilirRL2 larva). Dauers da dahil olmak üzere birçok farklı davranış özelliklerine sahip: a. Eğilimi davranışsal hareketsiz kalmasını, nictation adı verilen bir zaman dağılması stratejisinin varlığında, baş, yem hareketlerinin bastırılması, yutak pompalama bastırılması ve boşaltım borusu 23, 5, 2, palslama indüksiyonu davranışsal özellikleri bireyler arasında değişkenlik göstermektedir.
Dauer içine deri değiştirme öncesi Dauer L2 aşama (L2D) 4 sonundan yaklaşık olarak 12 saat sürer. Bu dönem IL2Q milleri basmakalıp büyüme ile gelir. Dauer içine molt ilk göze çarpan olay faringeal pompalama bastırılması. Pompalama Bastırma C bütün molts için ortak elegans. Ancak, yutak pompalama bastırılması Dauer dönemi boyunca devam eder ve olumlu çevre koşullarına hayvanın bir dönüş sonra yaklaşık 4 saat bitiyor. Faringeal pompalama başlangıç dönemindebastırılması, üst deri üzerindeki stoma formları bir tabaka. Bu değişiklikler, Dauer içine molt başlangıcından sonraki ilk bir saat içinde meydana gelir. Bu ilk dönemde sık sık IL2Q hücre gövdelerinden uzanan ek bir nörit sürecinin bir formasyonu oluşur. Bununla birlikte, bu ilk işlem genellikle ek Dauer 12 içine molt hücumunu takip eden 2 saat içinde geri çekilir.
Yutak boyutunda tedrici bir azalma (Şekil 4B) gösteren pişmanlık başlar Dauer içine molt başlangıcından itibaren 5 - saat 2 sırasında. Eş zamanlı olarak, kısa punktumlarda formu ve IL2Q birincil dendrit (Şekil 5) boyunca geri çekin. 4 saat boyunca - eriyiğinden hücumunu takip eden 8, vücudun uzak L2D kütikül (Şekil 4C) için nematod çekilmesi ile sonuçlanan bir kademeli radyal büzülme geçirmektedir. Bu dönem birincil dendritler 2 ° dendritler akıbet ve kurulması ile ilişkilidirIL2Q hücre gövdeleri dditional dendritler (Dauer özel ilköğretim dendritler- 1d °). Şekil 5'te gösterildiği gibi, dendritik büyümesi sürekli değil, dinamik bir oluşum ve işlemlerin her ikisi de geri çekilmesi ile karakterize değildir. Dendrit ° 2 ° ve 1d, genellikle midlines (IL2Ds için) (IL2Vs için) ventral ve dorsal kadar uzanır. Dauer üst deri tamamen L2D kütikül ayrılır sonra, floresan ışık uygulaması sonraki görüntüleme zor bir hale getirmektedir, hızlı bir şekilde kendi boyuna ekseni etrafında döndürmek için hayvan neden olur. Mekanik, slayt gelişen hayvan kaldırmak L2D manikür kaldırmak ve hala Dauer gelişimini sürdürmek başarılı değil ise yeni bir slayt üzerinde hayvana binmek çalışır.
Şekil 1. Ham Dauer feromon olan-20 ° C'de süresiz olarak saklanabilir sarı sıvı. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
C. Şekil 2. DIC mikrografiler elegans tipik Dauer morfolojik özellikleri ile dauers. tıkalı bir stoma (ok) ve dikdörtgen terminali ampul ile büzülmüş bir yutak gösteren bir Dauer (A) dorsal orta vücut görünümü (kırmızı özetlenen, Şekil 4A gösterilen L2 larva ile karşılaştırın). Yeni oluşturulan dauers sık L2D manikür (ok başı) kısmını muhafaza eder. Yüksek refraktil organları (ok) dauers tipik gösteren hipodermis (B) Dorsal görünümü. Yine L2D manikür belirgin (ok ucu) 'dir.
Ham Dauer feromon Şekil 3. Doz yanıt deneyi. Modifiye NGM ortamı içine dahil Dauer feromon seviyelerinin arttırılması maruz L1 hayvanlar dauers oluşturmak için daha fazladır. Veriler toplanmış ve bir kez test edilmiştir, şu konsantrasyonlarda haricinde iki ayrı deneyden elde edilen edilmiştir:% 0.05,% 2 ve% 4. Veriler bir sigmoidal doz tepki eğrisi uyduruldu. R2 ve EC değerleri lojistik regresyon kullanılarak hesaplandı. N% 0, n = 299,% 0.05, n = 81, 0.1%, n = 352, 0.5%, n = 368,% 1, n = 241,% 2, n = 125,% 4 N:, aşağıdaki gibi her bir konsantrasyonu için incelenen hayvanların, toprak rengi bir Erime noktası: 155. Hata çubukları,% 95'lik güven aralıklarını gösterir.
Şekil 4. DIC C sağ görünümü mikrograflannı yanal Dauer içine molt farklı aşamalarında elegans. (A) (kırmızı özetlenen) tipik yuvarlak terminali yutak ampul ile L2 hayvan. (B) Dauer içine molt aşağıdaki Yaklaşık 3 saat, terminal ampul daralıyor ve L2D manikür başlıyor Yeni oluşan Dauer manikür (ok ucu) ayrılacak. (C) Dauer molt başlangıcından aşağıdaki Yaklaşık 10 saat, hayvan L2D manikür (ok ucu) adlı kapsamlı radyal büzülme ve dekolmanı uğramıştır. Bazen, manikür L2D aşamasında (ok) boşaltım kanalı hala görülmektedir gelişen Dauer eklenebilir kaplı. Ölçek bar, 10 mikron. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil IL2 raportör p KLP-6 :: tdTomato. En ifade eden bir tek hayvanın 5. yanal görünüşüdür epifluorescent mikrograflar IL2 nöronların tam uzunlukta bir görüntü Dauer içine molt başlangıcından sonra yaklaşık 3 saat. Ankastre Dauer içine molt başlangıcından sonra çeşitli zaman noktalarında IL2Q dendrit bölümünü gösterir. IL2Q şube hızlı bir uzantısı Dauer içine molt başlangıcından sonra yaklaşık 5 saat başlayarak oluşur. Ölçek bar, 10 mikron.ove.com/files/ftp_upload/51834/51834fig5highres.jpg "target =" _blank "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dauer özgü nöroplastik Dauer ve diğer ilişkili morfolojik değişikliklerin bir inceleme kontrol edilebilir ve her iki genetik mutasyon (örneğin, DAF,-C mutantları) vasıtasıyla veya feromon vahşi tip hayvanların maruz bırakılarak dauers güvenilir oluşturulmasını gerektirir. Dauers ikna etmek için bir genetik mutasyon kullanımı uygun olsa da, bu sonuçlar yanıltabilecek. Bu nedenle Daf-c mutasyonlar ile toplanan veriler daha sonra Dauer feromon maruz Dauer sahne girmek için uyarılan vahşi tip hayvanlar ile teyit edilmelidir.
Ham Dauer feromon üretimi nispeten basittir ve bu protokol varyasyonları 18 yayınlanmaktadır. Kirlenme olası hariç, burada sunulan yöntemi çok güvenilirdir. Özü üretmek için, biz S medya sıvı kültüründe 19 nematodların büyük yoğunlukları kültüre standart bir yöntem kullanın. Inisiyatif miktarındaki bir esneklik büyük miktarda bulunmaktadırL. nematod aşı, sıvı kültüre ilave edildi. Nematod büyük sayılar ile başlayan prosedürü hızlandırmak olacaktır. Bununla birlikte, başlangıç nematod Inokulum kirlenmez olduğundan emin olmak için önemlidir. Fungal ve bakteriyel kontaminasyon Hem sıvı ortam içinde büyüme sırasında ortaya çıkabilir. Mantar kirlenme kolaylıkla hif varlığı ile tespit edilebilir. Bakteriyel bulaşma değerlendirmek daha zordur. Sıvı kültür listelenen kuluçka dönemleri hemen sonra temizleyin yoksa Tipik bir bakteri kirletici görülebilir. Yeterli feromon üretmek için gerekli toplam nematod nüfus yoğunluğu esneklik vardır. Örneğin, 25.000 nematodlar / ml 'lik bir konsantrasyon dauers yol açma bakımından etkin bir feromon üretmek için yeterlidir. Alternatif bir yöntem, Phe bir yörüngesel karıştırıcıda ve daha sonra saflaştırma ile oda sıcaklığında bir O / N inkübasyon takip M9 tampon (~ 50 mi) bir küçük hacimli bir sıvı kültürden nematodları aktarılması oluşmaktadıryöntemlerle Romone burada anlatıldığı gibidir. Bu alternatif etkilidir, fakat daha yüksek bir EC 50 (yani, daha az güçlü) bir feromon üretir.
Ham feromon her parti kuvvetinde farklılık olarak, Dauer indükleyici etkinlik için bir alt örnek test edilmesi önemlidir. Birçok uygulama için, her bir konsantrasyon için feromon bir tekrar tek bir biyo-deney potansiyeli genel bir tahminini yapmak için yeterlidir. Bununla birlikte, bağımsız bir şekilde gerçekleştirilir doz-yanıt biyo-deneyler arasında önemli bir değişiklik olabilir. Bir doğru, etkili dozu belirlemek için 3 suret biyoanalizlere - deneyler Dauer oluşumu ve non-Dauer gelişimi arasında hassas bir dengeyi gerektirir, bu nedenle, bu 2 gerçekleştirmek için gerekli olacaktır. Nematod biyolojide ascarosides önemi daha yaygın olarak kabul edilmektedir gibi gelecekte, makul maliyetle sentezlenmiş Dauer feromon satın almak mümkün olabilir.
Dauer özgü neu'nun bulguIL2s içinde ronal yeniden şekillenme stres kaynaklı nöroplastisitesi moleküler mekanizmaları çalışmak için bir platform sağlar. Spesifik genler nöroplastisiteyi düzenleyen bir mekanizma belirlemek için, gerçek zamanlı olarak yeniden şekillenme süreci takip etmek gerekli olabilir. In vivo görüntüleme IL2 yöntemi önceki C üzerine inşa elegans yöntemleri 22, 24, 25. Dauer oluşumu sırasında görüntüleme için bir engel Dauer iyileşme olasılığıdır. Kolay çözüm, ilk olarak bir DAF-c mutasyon kullanmaktır. Herhangi bir sonuç teyidi daha sonra burada tarif edilen yöntemler kullanılarak C-olmayan DAF arka planda gerçekleştirilebilir.
Singh ve Sulston Dauer oluşumu 25 in vivo görüntüleme için çeşitli engeller kaydetti. Bunlar yeni kurulan dauers radyal daralma aşağıdaki mikroskop lamı ve kontrolsüz hareketin kapalı kaçan. Mikrokürecik boncuk kullanımı kaçış 22 olasılığını ortadan kaldırmıştır. HoweDauer molt içine yaklaşık 10 saat oluşur radyal daralma ver hala sonraki görüntüleme için zorluklar yaratır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| N2 C. elegans Bristol strain | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III | Upon request from Schroeder lab | ||
| PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V | Upon request from Schroeder lab | ||
| JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Petri dishes | Tritech Research | 60 mm T3308, 35 mm T3501 | |
| NGM agar | Various | 3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H2O autoclaved cooled to 55°C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl2, 1 ml of 1 M MgSO4 | |
| S Media | Various | S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4 •7 H2O, 0.2 g MnCl2•4 H2O, 0.29 g ZnSO4 •7 H2O, 0.025 g CuSO4 •5 H2O, H2O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl2, and 0.75 ml of 1 M MgSO4. | |
| Dauer pheromone plates for dose-response assay | Various | Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 µl of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 ml. Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 °C. Add 125 µl 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 µl 0.1 M CaCl2, 50 µl 0.1 M MgSO4 and 50 µl of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube. Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying). | |
| Microsphere beads 0.1 micron | Polysciences Inc. | 00876-15 | |
| M9 buffer | Various | Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving |
References
- West-Eberhard, M. J. Developmental Plasticity and Evolution. , Oxford University Press. (2003).
- Cassada, R. C., Russell, R. L. The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).
- Riddle, D. L., Albert, P. S. C. elegans II. Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. 739-768 (1998).
- Golden, J. W., Riddle, D. L. The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature. Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).
- Riddle, D. L. The Nematode C. elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. 393-412 (1988).
- Fielenbach, N., Antebi, A. C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity. Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).
- Hu, P. J. WormBook. , 1-19 (2007).
- Golden, J. W., Riddle, D. L. A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans. Science. 218, 578-580 (1982).
- Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans. Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).
- Jeong, P., et al. Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone. Nature. 433, 541-545 (2005).
- Srinivasan, J., et al. A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans. Nature. 454, 1115-1118 (2008).
- Schroeder, N., et al. Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin. Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).
- Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans. Development. 138, 1371-1381 (2011).
- Albert, P. S., Riddle, D. L. Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva. J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).
- Vowels, J. J., Thomas, J. H. Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans. Genetics. 130, 105-123 (1992).
- Vowels, J. J., Thomas, J. H. Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 303-316 (1994).
- Ailion, M., Thomas, J. H. Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans. Genetics. 156, 1047-1067 (2000).
- Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. Pheromone Signaling. , Springer. 273-283 (2013).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Ouellet, J., Li, S., Roy, R. Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans. Development. 135, 2583-2592 (2008).
- Blelloch, R., et al. The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, (2012).
- Nelson, F. K., Riddle, D. L. Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery. J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).
- Singh, R., Sulston, J. Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans. Nematologica. 24, 63-71 (1978).
