Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In vitro Rekonstituering af lys-høst komplekser af planter og grønne alger

Published: October 10, 2014 doi: 10.3791/51852
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physics and Astronomy, VU University Amsterdam

Abstract

I planter og grønne alger, er lys fanget af lys-høst komplekser (LHCs), en familie af integrale membranproteiner, der koordinerer chlorophyler og carotenoider. In vivo er disse proteiner foldes med pigmenter til at danne komplekser, der er indsat i thylakoid membran af kloroplast. Den høje lighed i de kemiske og fysiske egenskaber af medlemmer af familien, sammen med det faktum, at de nemt kan miste pigmenter under isolering, der gør deres oprensning i en indfødt tilstand udfordrende. En alternativ fremgangsmåde til at opnå homogene præparater af LHCs blev udviklet af Plumley og Schmidt i 1987 1, som viste, at det var muligt at rekonstruere disse komplekser in vitro begyndende fra oprensede pigmenter og ufoldede apoproteiner, hvilket resulterer i komplekser med egenskaber meget lig den for nativ komplekser. Dette åbnede vejen for anvendelsen af bakterielle udtrykte rekombinante proteiner til in vitro (f.eks pigment bindende sites) eller proteindomæne (f.eks, protein-protein-interaktion, foldning). Denne metode er blevet optimeret i flere laboratorier og anvendes til de fleste af lys-høst komplekser. Den her beskrevne protokol detaljer metoden til rekonstituering lys-høst komplekser in vitro i øjeblikket anvendes i vores laboratorium, og eksempler beskriver anvendelser af fremgangsmåden er tilvejebragt.

Introduction

Den fotosyntetiske apparat af planter og alger omfatter integrerede membranproteiner, som binder klorofyl a (CHL a), b (CHL b) og carotenoider (bil). Disse pigment-protein-komplekser er aktive i høst lysenergi og overføre denne excitationsenergi til reaktionen centre, hvor det bruges til at fremme ladningsadskillelse 2. De er også involveret i regulatoriske feedback-mekanismer, der beskytter den fotosyntetiske apparat af høj lys skader 3,4. De lys høst komplekser (LHCs) består af en stor familie af beslægtede proteiner i planter og alger 5.

Den homogene oprensning af hvert medlem af familien har været kompliceret af den meget lignende kemiske og fysiske egenskaber af komplekserne. Desuden oprensningsprocedurer ofte resultere i tab af pigmenter eller andre potentielle cofaktorer såsom lipider. In vitro rekonstitution repræsents en kraftfuld metode til at overvinde disse problemer. LHC forbundet med fotosystem II (LHC-II) blev først rekonstitueret in vitro med Plumley og Schmidt i 1987 1. Forskerne ekstraheret delipiderede protein og pigmenter adskilt fra vegetabilske chloroplaster, og derefter kombineret varmedenatureret protein med pigmenter i nærværelse af lithium sulfat (LDS), efterfulgt af tre cyklusser af frysning og optøning 1. De viste, at de spektrale egenskaber af den opløste LHC komplekser var meget lig komplekser oprenset fra planter. Den lethed rekonstituering LHC pigment-protein-komplekser, sandsynligvis på grund af nogle iboende selv-samling, indgår sammen med vanskeligheden ved at isolere oprensede komplekser fra organismer, førte til en hurtig vedtagelse af metoden af ​​andre forskere. Rekonstituering af fotosyntetiske proteiner overudtrykt i Escherichia coli (E. coli) blev opnået ved Paulsen og hans kolleger i 1990 6. I E.coli, overudtrykt membranproteiner typisk er indeholdt i inklusionslegemer, som faciliteter deres rensning. Rekonstituering opnås ved varmedenaturering af inklusionslegemer indeholdende det rekombinante protein i nærvær af SDH, efterfulgt af tilsætning af pigmenter, som initierer proteinfoldning. Foldning af LHCII komplekset er en to-trins proces: det første er klorofyl bundet i mindre end 1 min; sekund, klorofyl B bundet og stabiliseret over adskillige minutter 7.

Ud over at give indsigt i de folde dynamik, har in vitro rekonstitution kombineret med mutagenese tillod identifikation af specifikke aminosyrer er vigtige for stabilitet (fx 8,9) eller pigmenter koordination (fx 10). Manipulation af genfoldningsbetingelser ved at justere parametre såsom pigment sammensætning eller rengøringsmidler har også identificeret elementer critical for korrekt foldning, såsom kravet om xanthophyll for LHCII kompleks (fx 1,11). Desuden har undersøgelser af egenskaberne af de enkelte pigmenter til komplekserne bundne været muligt ved hjælp af komplekser rekonstitueret in vivo (fx 10).

Den her beskrevne metode begynder med isolering af pigmenter (klorofyler og carotenoid) fra spinat og grønalgen Chlamydomonas reinhardtii. Udtrykket og rensning af LHC protein fra E. coli i form af inklusionslegemer derefter beskrevet, efterfulgt af rekonstituering af LHC og efterfølgende rensning ved Ni-affinitetssøjle. I det sidste trin er de rekonstituerede komplekser oprenses yderligere ved sucrosegradientcentrifugering at fjerne frie pigmenter og udfoldede apoprotein. Denne protokol udgør en optimeret procedure omfatter adskillige ændringer, som er blevet indført af forskellige laboratorier overtid 1,6,10,12 -14.

Protocol

1. Samlet Pigment Udtræk fra spinatblade

  1. Homogeniseres en håndfuld spinatblade (~ 20 g) i 100 ml kold Slibning Buffer (se tabel 1) under anvendelse af en blender i 20 sekunder.
  2. Opløsningen filtreres gennem en to lag af nylonklæde med en porediameter på 20 um og centrifugeres filtratet ved 1.500 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  3. Resuspender pelleten indeholder chloroplaster med en blød kunstnere pensel i 1 ml kold vaskebuffer (se tabel 1). Når pelleten resuspenderes, tilsættes 50 ml vaskebuffer og centrifugeres opløsningen ved 10.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  4. Fjern supernatanten og forsigtigt pellet resuspenderes (thylakoids) i 50 ml vaskebuffer (se tabel 1).
  5. Centrifugeres opløsningen ved 10.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten fuldstændig. På dette tidspunkt, udføre følgende trin i den mørke, for at undgå pigment oxidation. Tilføj ~ 20 ml 80% acetone bufret med Na 2 CO 3 (se tabel 1) til at udtrække pigmenter. Lad løsning på is i 10 min, vortexbehandling lejlighedsvis.
  6. Pellet de cellulære bestanddele ved centrifugering ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
    BEMÆRK: Hvis pigmenterne ikke er fuldstændig udvindes, vil pillen har en grøn farve og trin 1.6 skal gentages.
  7. Opsaml supernatanten i en skilletragt. Tilføj 0,4 volumener diethylether, rystes kraftigt og åbne ventilen at udlufte gas.
  8. Tilsæt 0,8 rumfang 0,33 M NaCl og der blandes grundigt. Tillad ~ 10 min for lagene er adskilt. Etherfasen oven indeholder de ekstraherede pigmenter. Fjern den klare nedre fase.
    BEMÆRK: Hvis adskillelse ikke er klar, fryse og tø den løsning til at forbedre den faseadskillelse.
  9. Fjern etheren ved at hælde det fra toppen af ​​skilletragten i en passende glasbeholder. Tør ved at tilføje en skefuld granular vandfrit natriumsulfat. Swirl opløsningen og tillade ~ 5 min for tørremidlet til at absorbere vand fra ether.
    BEMÆRK: Gentag dette trin, hvis natriumsulfat synes helt klumpet sammen; der skulle være nogle fritflydende krystaller når ether tørres tilstrækkeligt. Hvis en vandlaget former fjerne dette med en Pasteur-pipette, før tilsætning af yderligere vandfrit natriumsulfat.
  10. Dekanteres ether til en ny glasbeholder forlader natriumsulfat fast bag.
  11. Etheren afdampes i en roterende Speedvac eller under en strøm af N2.
  12. Opløs pigmenter fuldstændigt i 10 ml 100% acetone.
  13. Fortynd en lille mængde (~ 3 ul) i 1 ml 80% acetone og måle absorptionsspektre og bestemme Chl a / b-forholdet og Chl koncentration beskrevet af Porra et al. (1989) 15.
  14. Alikvot og tørre pigmenter i en roterende Speedvac eller under N2 strøm, indtil acetonen erhelt fordampet. Opbevar de tørrede pigmenter ved -80 ° C.

2. Ekstraktion af carotenoider fra Spinat

  1. Følg trin 1.1 til 1.5. På dette tidspunkt, udføre følgende trin i den mørke, for at undgå pigment oxidation.
  2. Resuspender thylakoid pellet i ~ 50 ml 96% ethanol pufret med Na 2 CO 3 (se tabel 1) til at udtrække pigmenter. Lad opløsningen på is i 5 minutter.
  3. Pellet de cellulære bestanddele ved centrifugering ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
    BEMÆRK: Hvis pigmenterne ikke er fuldstændig udvindes, vil pillen har en grøn farve og trin 2.2 skal gentages.
  4. Indsamle supernatanten, og der tilsættes 0,1 volumen 80% KOH (vægt / vol) for at starte forsæbning.
  5. Lad opløsningen ved 4 ° CO / N, tæt lukket og beskyttet mod lys.
  6. Opsaml opløsningen i en skilletragt. Tilsæt 1 volumen af ​​diethylether og blandes forsigtigt.
  7. Tilsæt 0,8 voltydeligt bevis på 0,33 M NaCl og bland forsigtigt. Tillad ~ 10 min for lagene er adskilt. Den orange Etherfasen oven indeholder forsæbede carotenoider. Fjern den grønne nedre fase ved afdrypning gennem stophanen af ​​tragten.
  8. Tilføj 3 rumfang vand og bland forsigtigt for at fjerne kaliumhydroxid. Lad lagene er adskilt. BEMÆRK: Hvis den øverste fase er uklar, tilsættes en lille mængde af NaCl (fx 3 g NaCl i 200 ml opløsning) og bland forsigtigt for at opløse.
  9. Fjern den nedre fase ved afdrypning gennem stophanen af ​​tragten.
  10. Følg trin 1,10-1,13.
  11. Fortynd en lille mængde (~ 3 ul) i 1 ml 80% acetone og måle absorptionsspektret ved 440 nm i 80% acetone. For at bestemme koncentrationen anvendes den gennemsnitlige koefficient udslettelse for carotenoider (ε 440 = 255) 16 i følgende formel: Bil [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (optisk sti) = 1 cm.
  12. Alikvot og tør carotenoids en Speedvac eller under N2 strøm, indtil al diethylether er fordampet. Opbevar de tørrede pigmenter ved -80 ° C.

3. I alt Pigment og carotenoid Udtræk fra Chlamydomonas reinhardtii

  1. Grow C. reinhardtii på fast TAP medium 17 i en petriskål ved at sprede en lille mængde af flydende kultur på overfladen. Vokse under kontinuerlig belysning flux på 20 pmol billeder PSA m -2 sek -1 indtil en grøn lag af celler er synlig.
  2. Ved hjælp af en steril podenål, høste en lille mængde C. reinhardtii fra den faste TAP medium og sætte cellerne i 500 ml TAP medium 17 i en 1 liters kolbe. Dyrk kulturen ved 25 ° C med 170 rpm omrøring under en kontinuerlig belysning flux på 20 pmol billeder PSA m -2 sek -1.
  3. Efter 5-6 dage, bør kulturen nå slutningen af den logaritmiske fase (6 x 10 6 celler / mleller 2-2,5 optisk densitet ved 750 nm). Centrifugeres kulturen ved 4.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
  4. For total pigment udvinding, følg trin 1,6-1,15.
  5. Udbyttet af den samlede pigment ekstrakt ud fra 500 ml fuld vækst dyrkning af C. reinhardtii er omkring 5 ml opløsning med en koncentration på 0,5 mg CHL a + b / ml.
  6. For carotenoider udvinding, følg trin 2,2-2,12.

4. Oprensning af inklusionslegemer

  1. Klon den kodende sekvens af LHC protein af interesse i en ekspressionsvektor, der resulterer i et fusioneret C-terminalt His-tag ved anvendelse af standard molekylærbiologiske procedurer. Omdan denne konstruktion i E. coli-værtsstamme såsom BL21 (DE3).
  2. Forbered lysepuffer, detergentbuffer Triton-buffer, TE (tabel 1), 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) og LB-medium 18 med de passende antibiotika.
  3. Pick en singlE E. coli-koloni indeholdende ekspressionsklon fra en frisk udstrøget plade i ~ 5 ml LB-medium med passende antibiotika ved hjælp af standard procedurer 6. Dyrk ved 37 ° C med 220 rpm omrøring i mindst 16 timer.
  4. Tilføj 2,5 ml O / N-kulturen i en 1 L Erlenmeyer-kolbe med 250 ml LB suppleret med passende antibiotika.
  5. Dyrk cellerne i 2-3 timer (eller indtil OD600 er ~ 0,6) ved 37 ° C ved 220 rpm.
  6. Tilføj IPTG til en slutkoncentration på 1 mM. Fortsæt med at dyrke cellerne ved 37 ° C med 220 rpm 3-4 timer.
  7. Centrifugeres kulturen i 10 min ved 5000 xg ved 4 ° C i en forvejet centrifugerør. Supernatanten grundigt og vejning pelleten ved vejning igen og fratrække centrifugerøret vægt.
  8. Resuspender E. coli-celle pellet i 0,8 ml / g lysepuffer ved kraftig omhvirvling.
    BEMÆRK: Alternativt kan cellepelleten nedfryses ved -80C til senere brug. Hvis man starter med en frossen pille, tillade at tø helt, før du tilføjer lysisbuffer.
  9. Tilsæt 2 mg lysozym pr gram celler, og der inkuberes på våd is med lejlighedsvis vortex-blanding i 30 minutter.
  10. Tilsæt 20 ug / ml DNAse, 10 mM MgCl2, 1 mM NaCI, 20 ug / ml RNAse. Vortex og lagt på is i 30 min.
  11. Tilsæt 2 ml kold detergentbuffer per gram celler. Bland godt og holde RT i 5 min.
  12. Overførsel til 2 ml centrifugerør (opdelt i to rør om nødvendigt). Der centrifugeres i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C for at pelletere inklusionslegemerne.
  13. Der tilsættes 1 ml kold Triton buffer og helt pellet resuspenderes ved lydbehandling (3 pulser x 5 sek x 50% effekt med 20 sek intervaller). BEMÆRK: Hav røret i et lille bæger omgivet af is vand for at holde det koldt i løbet af lydbehandling. I tilfælde af flere rør, kombinere de resuspenderede inklusionslegemer i et rør efter resuspension.
  14. Centrifugeres i 10 minutter ved 12.000xg ved 4 ° C for at pelletere inklusionslegemerne.
  15. Gentag trin 4.13 og 4.14 to gange.
  16. Resuspendere ligene i 1 ml kold TE med lydbehandling inklusion for en sidste vask for at fjerne Triton buffer. Der centrifugeres i 10 minutter ved 12.000 xg ved 4 ° C for at pelletere inklusionslegemerne.
  17. Pellet resuspenderes i 1 ml kold TE efter lydbehandling.
  18. Vurdere proteinkoncentrationen ved standardmetoder, såsom Bradford assay 19. Store portioner af inklusionslegemer ved -20 ° C.

5. Rekonstituering

Denne protokol giver typisk 1-2 ml rekonstitueret protein med en OD på 4, når absorbansen måles i Qy område (600-750 nm). Mængde kan justeres efter ønske, selv om der bør drages omsorg for at opretholde den rette forhold under proceduren.

  1. Forbered følgende løsninger som beskrevet i tabel 1: 2x rekonstitutionsbuffer, 20% OG, 2 M KCI, TE. Udfør følgende sbeskæftigelsespagter i dæmpet belysning.
  2. Resuspender 800 ug LHC inklusionslegemer i alt 400 ul TE i et 2 ml mikrofugerør. Tilsæt 400 ul af 2x rekonstitutionsbuffer og vortex kortvarigt.
  3. Tilføj 0.6 pi β-mercaptoethanol (lager 14,8 M) til at have en endelig koncentration på 10 mM. Varm proteinet i 1 min ved 98 ° C. Vortex kortvarigt og sted ved stuetemperatur i 3 min.
  4. Resuspender 500 ug af den samlede tørrede klorofylpigmenter plus 80 ug carotenoidpigmenter i 30 pi 100% EtOH ved kraftig hvirvelbehandling i 1 min eller sted i en badsonikator 1-2 min.
  5. Spin pigment blanding ~ 30 sekunder ved 15.800 xg ved 4 ° C og bekræfte, at der ikke er nogen pellet. Hvis der er en pellet, gentag hvirvelblanding og / eller sonikering. VIGTIGT: Efter resuspension og centrifugering, straks tilføje pigment til proteinet, eller det kan aggregere og skal rystes op igen.
  6. Langsomt tilføje pigment mix til den afkølede protein mens vortex. Fortsæt til vortex 5-10 sEF og anbring røret på våd is. Vær forsigtig med ikke at Vortex for voldsomt, da proteinet kan flyde over toppen af ​​røret.
  7. Tilføj 94 pi 20% Octyl β-D-glucopyranosid (OG) (slutkoncentration 2%), vortex kortvarigt og holde på is 10 min.
  8. Tilføj 90 ul KCI 2 M (slutkoncentration 150-200 mM), vortex kortvarigt og holde på is 20 min. Kan indledes forberedelse søjle (afsnit 6) på dette tidspunkt: BEMÆRK.
  9. Spin i 10 minutter ved 15.800 xg ved 4 ° C. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten (udfældet LDS) til et 10 ml rør. Hold koldt og beskyttet mod lys.

6. Nikkel søjleoprensning

  1. Klargør følgende opløsninger som beskrevet i tabel 1: OG-buffer, OG skyllepuffer, Elueringsbuffer.
  2. Tilslut en Ni-Sepharosesøjle (1 ml), eller svarende til en peristaltisk pumpe der sikrer, at ingen luft kommer ind i kolonnen under dette trin, og de følgende trin.
  3. Indstil hastigheden af ​​than pumpe til 1 ml / min og skylles søjlen med 5-10 ml vand for at fjerne opbevaringsopløsningen.
  4. Ækvilibrer søjlen med 3-4 ml OG puffer.
  5. Tilføj 3-4 ml OG puffer til proteinet prøven og belastning til kolonnen. NB: hvis proteinet er blevet siddende på is i længere tid end 10 minutter efter fjernelse af SDH, spinde ved 15.800 xg ved 4 ° C i 1 min for at fjerne eventuelle yderligere SDH udfældning.
  6. Søjlen skylles med 5 ml OG puffer.
  7. Søjlen skylles med 2 ml OL skyllepuffer.
  8. Elueres det bundne protein med 3 ml elueringspuffer. Saml de grønne eluat, som indeholder den rekonstituerede protein. BEMÆRK: Dette er normalt omkring 1 ml i alt.

7. sucrosegradientcentrifugering

  1. Klargør følgende opløsninger som beskrevet i tabel 1: Saccharose opløsning, 0,06% β-DM, 0,01 M HEPES, pH 7,6.
  2. Fyld ultracentrifugerør med rørsukkeropløsningen og fryse ved -20 ° CO / N or -80 ° C i mindst 1 time.
  3. Glasset fjernes fra fryseren og tillade at optø uforstyrret ved 4 ° C. BEMÆRK: frysning / optøning proces skaber en gradient fra 0,1 til 1 M saccharose. En 15 ml rør typisk smelter i omkring 3 timer.
  4. Fjern forsigtigt fra toppen samme volumen som den grønne fraktion, der elueres fra nikkel Sepharosesøjle i trin 6.8. Derefter indlæse rekonstituerede prøve på toppen langsomt for at undgå at forstyrre forløbet.
  5. Balance rør og centrifugering ved 200.000 xg ved 4 ° C i en ultracentrifuge ved hjælp af en SW-41 eller SW-60 svingende spand rotor til 18 timer, skal du indstille til langsom acceleration og stoppe uden bremser.
  6. Forsigtigt tage ud gradient fra røret indehaveren med en pincet. Brug en sprøjte med en lang nål, der har en stump åbning til opsamling af fraktionen fra toppen. BEMÆRK: Alternativt indsamler fraktioner fra bunden ved gennemboring af rør med en nål og indsamle dråber.

Representative Results

Denne protokol beskriver en metode til at rekonstruere chorophyll A / B-proteiner in vitro. Denne teknik tillader foldning af disse pigment-protein-komplekser in vitro begyndende fra apoproteinet, som kan opnås ved overekspression i et heterologt system samt pigmenter udvundet fra planter eller alger. Efter rekonstitution refoldede pigment-proteinkompleks oprenset fra overskuddet af pigmenter og udfoldede apoproteinet i to trin. Det første trin (figur 1 AB) er baseret på tilstedeværelsen af His-tag ved C-terminalen af proteinet, som muliggør fjernelse af en stor del af de ubundne pigmenter. Det andet oprensningstrin anvender sucrose densitetsgradientcentrifugering (figur 2), hvor udfoldet protein normalt migrerer langsommere end grønt bånd med den rekonstituerede protein. Målet med rekonstitution in vitro til opnåelse af komplekser med samme korrektbånd, som de indfødte dem. For at illustrere dette resultat, er den spektroskopiske egenskaber af en in vivo lys høst kompleks sammenlignet med samme LHC kompleks rekonstitueret in vitro 13,20,21. Den absorptionsspektrum LHCs i det synlige område (350 nm og 750 nm) afhænger af pigmentsammensætningen af ​​komplekset, samt på pigmentet miljø (som omfatter proteinet), og det er således et følsomt værktøj til at kontrollere kvaliteten af rekonstitution. I figur 3 absorptionsspektret for CP24, en klorofyl a / b-bindende protein fra Arabidopsis thaliana, rekonstitueret in vitro sammenlignes med spektret for det samme kompleks oprenset fra Arabidopsis thylakoids 21. I spektrene, er det muligt at genkende Qy og Soret overgang Chl a (toppe ved 671/439 nm), og Chl b (toppe ved 649/466 nm). De indfødte, og som rekonstitueres komplekser viser identisk ABSOrption spektre, hvilket indikerer en næsten identisk pigment-sammensætning og organisation. Fluorescensspektroskopi kan bruges til at vurdere kvaliteten af ​​den rekonstituerede kompleks. Fluorescensemissionsspektrer Den måles ved excitation ved forskellige bølgelængder, som exciterer fortrinsvis forskellige pigmenter: Chl a ved 440 nm, Chl b ved 475 nm og xanthophyll ved 500 nm. I et korrekt foldet protein-pigment kompleks, Chl b og xanthophyll overfører deres excitationsenergi primært Chl en inden for et par picosekunder, og fluorescensen stammer fra et termisk ækvilibreret system, hvilket resulterer i en enkelt top med den samme form og maksima ved alle tre excitation bølgelængder (figur 4A-B). Tilstedeværelsen af Chl B ikke koordineret til proteinet kan genkendes af en ekstra top eller skulder omkring 650 nm på 475 nm excitation (figur 4C). Tilstedeværelsen af frit Chl en stedet førertil yderligere emission omkring 675 nm, hvilket er hovedsageligt til stede ved 440 nm excitation. Den fluorescensemissionsspektrer på 475 nm excitation af både rekonstituerede og de ​​native CP24 komplekser (figur 4D) viser en enkelt top ved 681 nm, hvilket indikerer, at rekonstitueret kompleks er korrekt foldet. En yderligere bekræftelse af, at pigment-protein-kompleks rekonstitueres korrekt kommer fra cirkulær dikroisme (CD) målinger. CD-signalet i det synlige område afhænger af de excitonic interaktioner mellem pigmenter, og det er derfor meget følsom over for selv små ændringer i organiseringen af kromoforerne 22. Figur 5 viser CD-spektre af rekonstitueret og indfødte CP24, med de typiske fingeraftryks topper ved 681 nm, 650 nm og 481 nm. Konklusionen er, at stor lighed mellem de spektroskopiske egenskaber af rå og det rekonstituerede CP24 bekræfter, at Rekonstitutionsproceduren udbytter native-lignende komplekser suita Ble til in vitro-undersøgelse af lys-høst proteiner.

Figur 1
Figur 1. Repræsentation af oprensning af rekombinante LHC proteiner med et His-tag ved hjælp af en nikkel-kolonne. (A) I løbet af oprensningen, His-mærket protein, der består af både rekonstituerede komplekser (grøn sekskant) og un-opløste / aggregeret protein (orange sekskant) er bundet til overfladen af ​​Ni-Sepharose (blå plet), mens ubundne pigmenter (små farvede pletter) flyde igennem. (B) Når kolonnen vaskes med elueringsbufferen indeholdende imidazol, bliver de rekonstituerede og un-rekonstituerede proteiner opsamlet i gennemstrømningen.

hres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. saccharosegradient rekonstitueret LHCII efter rensning ved nikkel-kolonne. De rekonstituerede komplekser separeres fra den frie pigment densitetsgradienten. Den mørkegrønne bånd repræsenterer rekonstitueret LHCII og bleg grøn baggrund er sammensat af frie pigmenter.

Figur 3
Figur 3. Absorptionsspektra rekonstitueret protein CP24 (rCP24, rød linje) og det native en (nCP24, sort linie) isoleret fra Arabidopsis thaliana. I begge spektre, er det muligt at genkende Qy og Soret overgang Chl a (toppe ved 671/439 nm), og Chl b (toppe ved 649/466 nm). Dette tal er blevet ændret fra Passarini et al. 2014 21.


Figur 4. fluorescensemissionsspektrer. Den fluorescensemissionsspektrer rekonstitueret CP24 vildtype kompleks (A) og normaliseret til det maksimale (B) viser effektiv energioverførsel fra Chl b og Xanthophyls at CHL en. (C) fluorescensemissionsspektrer af rekonstitueret CP24 (rCP24) og indfødte kompleks (nCP24) isoleret fra Arabidopsis thaliana. Spektrene er normaliseret til det maksimale af peak (D). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. cirkulærdikroisme Spectra. Rekonstitueret CP24 (rCP24, rød linje) og den indfødte kompleks (nCP24, sort linje) er isoleret fra Arabidopsis thaliana viser meget ens spektre.

Figur 6
Figur 6. Absorptionsspektra af CP29 vildtype (CP29_WT) og muterede CP29 (CP29_A2). Den grønne linje viser forskellene mellem de to parceller.

px; "> Saccharose n-dodecyl-p-D-maltoside (β-DM)
Alle buffere kan opbevares ved 4 ° C.
Komponenter Slutkoncentration Yderligere bemærkninger
Grinding Buffer Sorbitol 0,4 M
Tricin 0,1 M pH 7,8
NaCl 10 mM
MgCl2 5 mM
Mælkepulver 0,5% vægt / volumen
Vaskebuffer Sorbitol 50 mM
5 mM pH 7,8
EDTA 10 mM pH 8
Lysis Buffer Tris 50 mM pH 8
Saccharose 2,5% vægt / volumen
EDTA 1 mM pH 8
Detergentbuffer NaCl 200 mM NaCI
Deoxycholsyre 1% vægt / volumen
1% vægt / volumen
Tris 20 mM pH 7,5
EDTA 2 mM pH 8
beta-mercaptoethanol 10 mM
Triton Buffer Triton X-100 0,5% vægt / volumen
Tris 20 mM pH 7,5
beta-mercaptoethanol 1 mM
Buffer TE Tris 50 mM pH 8
EDTA 1 mM pH 8
Rekonstitutionsbuffer HEPES 200 mM
Saccharose 5% w / v
Lithiumdodecylsulfate (LDS) 4% w / v
Benzamidine 2 mM
Aminocapronsyre 10 mM
OG Buffer Octylglucosid 1% vægt / volumen
12,5% w / v
NaCl 0,2 M
HEPES 20 mM
Imidazol 10 mM
OG skyllepuffer n-dodecyl-p-D-maltoside (β-DM) 0,06% vægt / volumen
HEPES 40 mM pH 7,5-9
NaCl 0,2 M
Elution Buffer Imidazol 0,5 M
0,06% vægt / volumen
HEPES 40 mM pH 8
NaCl 0,2 M
Sucroseopløsning Saccharose 20% vægt / volumen
n-dodecyl-p-D-maltoside (β-DM) 0,06% vægt / volumen
HEPES 0,01 M pH 7,6
Acetone 80% bufferet med natriumkarbonat Acetone 80% v / v Natriumcarbonat 1 M
Ethanol 96% bufferet med natriumkarbonat Ethanol 96% v / v
Natriumcarbonat 1 M

Tabel 1. Liste over buffere og opløsninger, der anvendes i denne protokol.

"> 9 pt, bredde: 48pt "width =" 64 "> rCP26
Chla a / b-mix Chla Chl a Chl B Neo Viola Lut Chl Tot Chl / Bil
nCP26 - 2,2 ± 0,05 6.2 2.8 0,61 0.38 1.02 9 4,5 ± 0,1
rCP26 8 2,71 ± 0,05 6.57 2.43 0,72 0.32 0.97 3,9 ± 0,04
rCP26 5.5 2.25 ± 0.05 6.23 2,77 0.77 0,3 0.96 9 4,0 ± 0,1
rCP26 3 2,08 ± 0,04 6.08 2.92 0.76 0,3 1.04 9 4,1 ± 0,1
rCP26 1 1,7 ± 0,05 5.7 3.3 0.7 0,3 0.9 9 4,3 ± 0,05
rCP26 0,3 1,11 ± 0,04 4.7 4.28 0.7 0,3 0.9 9 4,2 ± 0,2
0.05 0,23 ± 0,01 1.4 5.6 0,58 0.24 1.11 7 3,1 ± 0,06
rCP26 <0,01 0,11 ± 0,01 0.7 0,64 0,3 1.08 7 3,06 ± 0,06

Tabel 2. Pigment indholdet af CP26 Native kompleks i forhold til rekonstituerede protein-pigment komplekser med forskellige Chl a / b-Nøgletal 39.

Discussion

Membranproteiner er ikke så let at studere. Isolering af native membranproteiner kompliceres af nødvendigheden af ​​at opløse lipiddobbeltlaget med rengøringsmidler, der kan beskadige protein og fjerne æteriske cofaktorer. Disse proteiner kan også være til stede i lave niveauer i biologiske membraner, eller blive blandet med de nært beslægtede proteiner, som i tilfældet af de lette høst komplekser, som gør oprensning af enkelte komplekser vanskelig. Heterolog proteinekspression i E. coli og in vitro-rekonstitution giver mulighed for at undgå disse problemer. in vitro rekonstitution og oprensning af foldede proteiner resulterer i komplekser, der besidder egenskaber, der meget ligner dem af de native komplekser 20,21,23 og dermed kan anvendes til at studere komplekser, der ikke kan renses til homogenitet 24 - 27.

Denne metode bruger spinat, som er let attainable året rundt, som en kilde til den samlede pigment og carotenoidpræparater. For nogle reconstitutions proteiner native for alger, er anvendelse af pigmenter oprenset fra alger foretrækkes på grund af forskellige pigmentsammensætninger. CHL a / b-forholdet og Chl / bil-forholdet forbliver den samme uanset pigment kilde.

Det er vigtigt at indse, at effektiviteten af rekonstituering er normalt omkring 35% 28. Det er derfor nødvendigt at fjerne ikke-bundne pigmenter og den udfoldede apoprotein fra opløsningen efter rekonstitution. En to-trins oprensningsprotokol præsenteres i denne protokol (se også resultater). Imidlertid bør det bemærkes, at saccharosegradienten trin ikke tillader fuldstændig adskillelse af Apo og holo-proteinet. Til de fleste analyser er dette ikke et problem, da apoproteinet ikke indeholder pigmenter og dermed ikke forstyrrer de funktionelle målinger. Men hvis det er nødvendigt fuldt ud at fjerne apoproteinet fra frhandling med den rekonstituerede kompleks (for eksempel, til at beregne pigmentet til protein støkiometri), kan der anvendes en anionisk bytning søjle (se Passarini et al. 2009 29 for detaljer).

Evnen til at refolde rekombinante lys høst proteiner med isolerede pigmenter in vitro giver en mulighed for at "manipulere" komplekserne ved at modificere rekonstituering "miljø" på forskellige måder, og derved ændre de særlige kendetegn ved det resulterende kompleks. For eksempel kan ændre pigmentsammensætningen under rekonstitution resultere i et kompleks med ændret pigmentsammensætning. Denne funktion kan anvendes til at undersøge indflydelsen af ​​forskellige pigmenter har struktur og stabilitet af komplekset. Normalt præparatet opnåede pigment fra spinat har et Chl a / b-forhold på 3: 1 og en Chl / bil-forhold på 2,9: 1. Dette forhold giver typisk en rekonstitueret protein med de samme egenskaber som ntiv én. Imidlertid kan justering af Chl a / b-forhold ved tilsætning af oprenset Chl a eller b påvirke bindingen af forskellige pigmenter skyldes varierende selektivitet bindingsstederne 30 - 33. Dette er muligt, fordi de fleste af pigment bindingssteder er ikke helt selektive for Chl a eller Chl b, men kan rumme både, men med forskellig affinitet 10,30,34. På en tilsvarende måde blev carotenoid bindingssteder også vist sig at være i stand til at rumme mere end en xanthophyll arter 8,35 - 38. Forskellige reconstitutions af CP26, en anden pigment-protein-kompleks af højere planter, ved hjælp af forskellige pigmentsammensætninger er vist i tabel 2 39. Disse reconstitutions blev anvendt til at vurdere affiniteten af bindingssteder for bestemte pigmenter 39. Det er interessant at bemærke, at for at opnå et kompleks med samme pigment cAMMENSÆTNING som det native ene skal Chl a / b mellem pigment blanding være 3: 1. Dette synes at være tilfældet for alle LHC komplekser af højere planter 20,40.

Kombinationen af ​​molekylær biologi med rekonstituering teknik muliggør egenskaberne af et Chl-bindende kompleks, der skal undersøges nærmere. Betydningen af forskellige protein domæner på stabilitet og foldning af komplekserne eller deres engagement i protein-protein interaktioner, er blevet bestemt ved trunkering apoproteinet eller udfører tilfældig mutagenese 8,41 - 44. Enkelt aminosyrerester vigtige for samordningen af de forskellige pigmenter kan ændres gennem mutagenese for at analysere egenskaberne af de enkelte pigmenter eller vurdere deres bidrag til funktion og stabilitet af komplekset 10,28,29,45 - 52. Figur 6 viser rekonstituerede Lhcb4 (CP29) meden mutation af histidin i position 216 53. En sammenligning af pigmentsammensætningen af vildtype og mutant komplekser viser, at mutationen inducerer tab af et Chl et molekyle, der angiver, at målstedet rumme et Chl a i WT komplekset. Forskellene i absorptionsspektre af WT og mutant ved normalisering til indholdet pigment, viser også absorptionsegenskaber tabte pigment. I dette tilfælde kan forskellen ses i de vigtigste top ved 680 nm, hvilket indikerer, at Chl en koordineret af His216 absorberer ved denne bølgelængde (for flere detaljer om denne mutant og spektroskopiske egenskaber se Mozzo et al. 2008 53). Mutation analyse kan også anvendes til at bestemme virkningen af miljøet på de spektroskopiske egenskaber af pigmenter 54.

Som konklusion kan lyshøstende proteiner let rekonstitueres in vitro resulterer i pigment-Protein komplekser med meget lignende egenskaber til indfødte komplekser. På denne måde er de vanskeligheder isolere native proteiner elimineres, samtidig med at levere præparatet protein med højt udbytte og renhed til yderligere undersøgelse. Betydningen af en 3: 1 Chl a / b-forhold i fremstilling af en autentisk kompleks understreges, og eksempler på rekonstitueret vildtype og mutant LHCs er tilvejebragt for at illustrere anvendelser af teknikken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HisTrap HP GE Healthcare 17-5247-01
Nylon cloth  20 μm pores
Soft artists paint brush 
NONIDET P-40 Sigma 74385
Beta-DM Sigma D4641
DNAase ThermoScientific EN0525
Milk Powders
RNAase ThermoScientific EN0531
Sonicator
Octyl β-D-glucopyranoside Sigma O8001 
Ultracentrifuge XL Beckman-Coulter
TAP medium see reference 17
LB medium see reference 19

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Plumley, F. G., Schmidt, G. W. Reconstitution of chlorophyll a/b light-harvesting complexes: Xanthophyll-dependent assembly and energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 146-150 (1987).
  2. Croce, R., van Amerongen, H. Light-harvesting and structural organization of Photosystem II from individual complexes to thylakoid membrane. Journal of photochemistry and photobiology B Biology. 104 (1-2), 142-153 (2011).
  3. Li, Z., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and responding to excess light. Annual review of plant biology. 60, 239-260 (2009).
  4. De Bianchi, S., Ballottari, M., Dall’osto, L., Bassi, R. Regulation of plant light harvesting by thermal dissipation of excess energy. Biochemical Society transactions. 38 (2), 651-660 (2010).
  5. Neilson, J. A. D., Durnford, D. G. Structural and functional diversification of the light-harvesting complexes in photosynthetic eukaryotes. Photosynthesis research. 106 (1-2), 57-71 (2010).
  6. Paulsen, H., Rümler, U., Rüdiger, W. Reconstitution of pigment-containing complexes from light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein overexpressed in Escherichia coli. Planta. 181 (2), 204-211 (1990).
  7. Horn, R., Grundmann, G., Paulsen, H. Consecutive binding of chlorophylls a and b during the assembly in vitro of light-harvesting chlorophyll-a/b protein (LHCIIb). Journal of molecular biology. 366 (3), 1045-1054 (2007).
  8. Cammarata, K. V., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of a light-harvesting gene product: deletion mutagenesis and analyses of pigment binding. Biochemistry. 31 (10), 2779-2789 (1992).
  9. Paulsen, H., Hobe, S. Pigment-binding properties of mutant light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 205 (1), 71-76 (1992).
  10. Bassi, R., Croce, R., Cugini, D., Sandonà, D. Mutational analysis of a higher plant antenna protein provides identification of chromophores bound into multiple sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (18), 10056-10061 (1999).
  11. Paulsen, H., Finkenzeller, B., Kühlein, N. Pigments induce folding of light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein. European journal of biochemistry / FEBS. 215 (3), 809-816 (1993).
  12. Caffarri, S., Croce, R., Cattivelli, L., Bassi, R. A look within LHCII differential analysis of the Lhcb1-3 complexes building the major trimeric antenna complex of higher-plant photosynthesis. Biochemistry. 43 (29), 9467-9476 (2004).
  13. Giuffra, E., Cugini, D., Croce, R., Bassi, R. Reconstitution and pigment-binding properties of recombinant CP29. European journal of biochemistry / FEBS. 238 (1), 112-120 (1996).
  14. Rogl, H., Kosemund, K., Kühlbrandt, W., Collinson, I. Refolding of Escherichia coli produced membrane protein inclusion bodies immobilised by nickel chelating chromatography. FEBS letters. (1-2), 21-26 (1998).
  15. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975 (3), 384-394 (1989).
  16. Davies, B. H. Identification of carotenoids by their absorption characteristics. Biochem J. 103 (2), (1967).
  17. Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
  18. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  20. Wientjes, E., Croce, R. The light-harvesting complexes of higher-plant Photosystem I Lhca1/4 and Lhca2/3 form two red-emitting heterodimers. The Biochemical journal. 433 (3), 477-485 (2011).
  21. Passarini, F., Xu, P., Caffarri, S., Hille, J., Croce, R. Towards in vivo mutation analysis knock-out of specific chlorophylls bound to the light-harvesting complexes of Arabidopsis thaliana - the case of CP24 (Lhcb6). Biochimica et biophysica acta. , (2014).
  22. Georgakopoulou, S., van der Zwan, G., Bassi, R., van Grondelle, R., van Amerongen, H., Croce, R. Understanding the changes in the circular dichroism of light harvesting complex II upon varying its pigment composition and organization. Biochemistry. 46 (16), 4745-4754 (2007).
  23. Croce, R., Müller, M. G., Caffarri, S., Bassi, R., Holzwarth, A. R. Energy transfer pathways in the minor antenna complex CP29 of photosystem II a femtosecond study of carotenoid to chlorophyll transfer on mutant and WT complexes. Biophysical journal. 84 (4), 2517-2532 (2003).
  24. Schmid, V. H., Cammarata, K. V., Bruns, B. U., Schmidt, G. W. In vitro reconstitution of the photosystem I light-harvesting complex LHCI-730 heterodimerization is required for antenna pigment organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (14), 7667-7672 (1997).
  25. Castelletti, S., Morosinotto, T., Robert, B., Caffarri, S., Bassi, R., Croce, R. Recombinant Lhca2 and Lhca3 subunits of the photosystem I antenna system. Biochemistry. 42 (14), 4226-4234 (2003).
  26. Storf, S., Jansson, S., Schmid, V. H. R. Pigment binding, fluorescence properties, and oligomerization behavior of Lhca5, a novel light-harvesting protein. The Journal of biological chemistry. 280 (7), 5163-5168 (2005).
  27. Mozzo, M., Mantelli, M., Passarini, F., Caffarri, S., Croce, R., Bassi, R. Functional analysis of photosystem I light-harvesting complexes (Lhca) gene products of Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et biophysica acta. 1797 (2), 212-221 (2010).
  28. Remelli, R., Varotto, C., Sandonà, D., Croce, R., Bassi, R. Chlorophyll binding to monomeric light-harvesting complex. A mutation analysis of chromophore-binding residues. The Journal of biological chemistry. 274 (47), 33510-33521 (1999).
  29. Passarini, F., Wientjes, E., Hienerwadel, R., Croce, R. Molecular basis of light harvesting and photoprotection in CP24 unique features of the most recent antenna complex. The Journal of biological chemistry. 284 (43), 29536-29546 (2009).
  30. Giuffra, E., et al. Analysis of some optical properties of a native and reconstituted photosystem II antenna complex, CP29 pigment binding sites can be occupied by chlorophyll a or chlorophyll b and determine spectral forms. Biochemistry. 36 (42), 12984-12993 (1997).
  31. Pagano, A., Cinque, G., Bassi, R. In vitro reconstitution of the recombinant photosystem II light-harvesting complex CP24 and its spectroscopic characterization. The Journal of biological chemistry. 273 (27), 17154-17165 (1998).
  32. Kleima, F. J., et al. Decreasing the chlorophyll a/b ratio in reconstituted LHCII structural and functional consequences. Biochemistry. 38 (20), 6587-6596 (1999).
  33. Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et biophysica acta. 1556 (1), 29-40 (2002).
  34. Hobe, S., Trostmann, I., Raunser, S., Paulsen, H. Assembly of the major light-harvesting chlorophyll-a/b complex Thermodynamics and kinetics of neoxanthin binding. The Journal of biological chemistry. 281 (35), 25156-25166 (2006).
  35. Croce, R., Weiss, S., Bassi, R. Carotenoid-binding sites of the major light-harvesting complex II of higher plants. The Journal of biological chemistry. 274 (42), 29613-29623 (1999).
  36. Hobe, S., Niemeier, H., Bender, A., Paulsen, H. Carotenoid binding sites in LHCIIb. Relative affinities towards major xanthophylls of higher plants. European journal of biochemistry / FEBS. 267 (2), 616-624 (2000).
  37. Jahns, P., Depka, B., Trebst, A. Xanthophyll cycle mutants from Chlamydomonas reinhardtii indicate a role for zeaxanthin in the D1 protein turnover. Plant Physiology and Biochemistry. 38 (5), 371-376 (2000).
  38. Wehner, A., Grasses, T., Jahns, P. De-epoxidation of violaxanthin in the minor antenna proteins of photosystemII, LHCB4, LHCB5, and LHCB6. The Journal of biological chemistry. 281 (31), 21924-21933 (2006).
  39. Croce, R., Canino, G., Ros, F., Bassi, R. Chromophore organization in the higher-plant photosystem II antenna protein CP26. Biochemistry. 41 (23), 7334-7343 (2002).
  40. Caffarri, S., Passarini, F., Bassi, R., Croce, R. A specific binding site for neoxanthin in the monomeric antenna proteins CP26 and CP29 of Photosystem II. FEBS letters. 581 (24), 4704-4710 (2007).
  41. Hobe, S., Förster, R., Klingler, J., Paulsen, H. N-proximal sequence motif in light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein is essential for the trimerization of light-harvesting chlorophyll a/b complex. Biochemistry. 34 (32), 10224-10228 (1995).
  42. Kuttkat, A., Hartmann, A., Hobe, S., Paulsen, H. The C-terminal domain of light-harvesting chlorophyll-a/b-binding protein is involved in the stabilisation of trimeric light-harvesting complex. European journal of biochemistry / FEBS. 242 (2), 288-292 (1996).
  43. Rupprecht, J., Paulsen, H., Schmid, V. H. Protein domains required for formation of stable monomeric Lhca1- and Lhca4-complexes. Photosynthesis research. 63 (3), 217-224 (2000).
  44. Yang, C., et al. The negatively charged amino acids in the lumenal loop influence the pigment binding and conformation of the major light-harvesting chlorophyll a/b complex of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (11), 1463-1470 (2008).
  45. Rogl, H., Kühlbrandt, W. Mutant trimers of light-harvesting complex II exhibit altered pigment content and spectroscopic features. Biochemistry. 38 (49), 16214-16222 (1999).
  46. Yang, C., Kosemund, K., Cornet, C., Paulsen, H. Exchange of pigment-binding amino acids in light-harvesting chlorophyll a/b protein. Biochemistry. 38 (49), 16205-16213 (1999).
  47. Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. Mutation analysis of Lhca1 antenna complex. Low energy absorption forms originate from pigment-pigment interactions. The Journal of biological chemistry. 277 (39), 36253-36261 (2002).
  48. Morosinotto, T., Breton, J., Bassi, R., Croce, R. The nature of a chlorophyll ligand in Lhca proteins determines the far red fluorescence emission typical of photosystem I. The Journal of biological chemistry. 278 (49), 49223-49229 (2003).
  49. Ballottari, M., Mozzo, M., Croce, R., Morosinotto, T., Bassi, R. Occupancy and functional architecture of the pigment binding sites of photosystem II antenna complex Lhcb5. The Journal of biological chemistry. 284 (12), 8103-8113 (2009).
  50. Croce, R., et al. Origin of the 701-nm fluorescence emission of the Lhca2 subunit of higher plant photosystem I. The Journal of biological chemistry. 279 (47), 48543-48549 (2004).
  51. Morosinotto, T., Mozzo, M., Bassi, R., Croce, R. Pigment-pigment interactions in Lhca4 antenna complex of higher plants photosystem I. The Journal of biological chemistry. 280 (21), 20612-20619 (2005).
  52. Mozzo, M., Morosinotto, T., Bassi, R., Croce, R. Probing the structure of Lhca3 by mutation analysis. Biochimica et biophysica acta. 1757 (12), 1607-1613 (2006).
  53. Mozzo, M., Passarini, F., Bassi, R., van Amerongen, H., Croce, R. Photoprotection in higher plants the putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of photosystem II. Biochimica et biophysica acta. 1777 (10), 1263-1267 (2008).
  54. Wientjes, E., Roest, G., Croce, R. From red to blue to far-red in Lhca4 how does the protein modulate the spectral properties of the pigments. Biochimica et biophysica acta. 1817 (5), 711-717 (2012).

Tags

Biokemi rekonstituering Fotosyntese klorofyl carotenoider lyshøstende Protein,
<em>In vitro</em> Rekonstituering af lys-høst komplekser af planter og grønne alger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Natali, A., Roy, L. M., Croce, R.… More

Natali, A., Roy, L. M., Croce, R. In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae. J. Vis. Exp. (92), e51852, doi:10.3791/51852 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter