Summary
Calcium is betrokken bij tal van fysiologische en pathofysiologische signaalwegen. Live cell imaging vereist gespecialiseerde apparatuur en kan tijdrovend zijn. Een snelle, eenvoudige werkwijze met een flow cytometer om relatieve veranderingen in cytosolische calcium in hechtende epitheelcellen gebracht suspensie bepalen geoptimaliseerd.
Introduction
Calcium is een belangrijke tweede messenger verantwoordelijk voor de overdracht van cellulaire fysiologische en pathofysiologische signalen 1. Cytosolische calciumconcentraties worden door de activiteit van calcium pompen en uitwisselaars calcium laag gehouden. De sarcoplasmatisch / endoplasmatisch reticulum calcium ATPase (SERCA) vult het endoplasmatisch reticulum (ER) calcium opslag als onderdeel van een "pomp lek" systeem dat het plasmamembraan calcium ATPase (PMCA) extrudeert calcium aan het extracellulaire compartiment, zowel ATP-afhankelijke manieren 2. Fysiologische boodschappers, zoals hormonen of neurotransmitters, geven hun signalen via G-eiwit gekoppelde receptoren, activering van fosfolipase C, dat fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PIP2) in de plasmamembraan hydrolyseert om diacylglycerol en inositol-trifosfaat (IP3) 3 gegenereerd. Terwijl diacylglycerol blijft in de plasmamembraan, IP3 diffundeert in het cytosol en bindt aan IP3 receptors (IP3R), die ligand geactiveerde calciumkanalen in het ER membraan en calcium vrij uit het ER luminale winkel afgesloten met een toename van cytosolische calciumconcentraties 4. Een alternatieve route voor calcium naar het cytosol te bereiken is door calciumkanalen en warmtewisselaars in de plasmamembraan. Crosstalk tussen deze twee compartimenten zijn beschreven: calcium geïnduceerde calcium vrijstelling (CKP) waar extracellulair calcium induceert calcium vrijlating uit ER winkels 5, en op te slaan bediend calciumentryblokkade (SOCE) waar het legen van de ER-winkels wordt waargenomen door STIM en veroorzaakt opening van Orai calciumkanalen op het plasmamembraan naar hervullen van de ER winkels 6 promoten.
Onder pathofysiologische omstandigheden, de cellulaire calcium respons gedereguleerd en cytosolische calcium verhogingen in afwezigheid van fysiologische stimulatoren 1. De calcium respons kan worden beïnvloed op een aantal manieren langdurige calciumsignaal vertraagd calcium verwijdering uit het cytosol, uitputting van calcium winkels of gelocaliseerde veranderingen in calcium. Bovendien de mitochondriën nemen een centrale rol in buffering en vrijgeven calcium 7. Langdurige en / of supramaximale cytosolische calcium verhoging leidt tot celdood. In feite, calcium meestal niet betrokken bij de cellulaire respons pathofysiologische en is een belangrijke gebeurtenis in een breed scala aan ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekte, hartziekte, kanker, botziekte en nierziekten, die voornamelijk worden geassocieerd met celdood en verlies of wijziging van orgaan of weefsel functie 8-10. Bovendien heeft verstoring van calciumsignalen gekoppeld aan cellulaire aanpassing en veranderingen in cellulaire functies en reacties.
Traditioneel worden calcium gemeten signalen met een negatief geladen fluorescente calcium indicator die in cellen is geplaatst in een cel permeabele acetoxymethyl (AM) estervorm. Eenmaal gesplitst door cellulaire esterases, de fluorescente indicatoren blijven binnen het intracellulaire compartiment en de toename in fluorescentie-intensiteit als calcium gebonden. De meest bekende en gebruikte calcium indicator is de ratiometrische Fura-2 ontwikkeld door Roger Tsien en collega 11. Calcium indicatoren met verschillende affiniteiten voor calcium toe verschillende calcium zwembaden worden bewaakt. Detectiemethoden zijn live cell imaging, fluorescentie microplaataflezer en flowcytometrie. De relatief snelle kinetiek van calcium signalen (gewoonlijk binnen enkele seconden tot minuten) maakt beeldvorming van levende cellen de beste werkwijze voor het verkrijgen van de informatie over de kenmerken van de calcium signaal. Naast de snelle kinetiek van calciumsignalen (binnen milliseconden), live cell imaging is een betere methode voor het bestuderen van cellulaire compartimentering van calcium signalering binnen een enkele cel 12. Absolute calciumconcentraties kunnen worden berekend door de minimum en maximum van de fluorescentie calcium indicator door toevoeging van een calcium chelator en permeabiliserende de cellen, respectievelijk, zoals beschreven door Grynkiewicz et al. 11.
Het gebruik van flowcytometrie calcium signalen te meten werd eerst ontwikkeld in de jaren 1980 in immunologische cellen waarin de mogelijkheid vele parameters, zoals membraan integriteit en gescheiden celpopulatie, en het vereiste van cellen in suspensie in combinatie met de ontwikkeling van enkele golflengte meten calcium indicatoren gemaakt flowcytometrie een ideale en convenientdetection methode 13-15. In hechtende cellen beeldvorming van levende cellen verschaft de informatie over calcium signalering, vooral de kinetiek, maar vereist een ingewikkelde installatie omvattende een fluorescentie microscoop, een perfusiesysteem, onderhoud van de cellulaire omgeving, zoals temperatuur, en gespecialiseerde software microscoop voor het verwerven en analyseren van gegevens. Alternatieve methoden zoals fluorescentie microplaat lezer of Pharmacological middel door het gebruik van calciumvangers zijn onvergelijkbaar qua opgedaan informatie. Flowcytometrie wordt op grotere schaal gebruikt cytosolische calcium in hechtende cellen volgen echter in de meeste studies slechts eindpunt metingen worden uitgevoerd. Volgens de methode oorspronkelijk ontwikkeld door Gergely et al. In immunologische B-cellen 16 zijn wijzigingen in cytosolische vrije calciumconcentratie door flowcytometrie met real-time kinetiek en monitoren van de fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke cellen uit een monster populatie succes gemeten in kankercellen epitheelcellen en kanker stamcellen hybriden 17. Deze werkwijze werd verder aangepast voor gebruik in hechtende epitheelcellen die moeilijk te beladen met calcium indicatoren 18 zijn.
Hier, met behulp van een onsterfelijk aanhanger epitheliale cellijn afgeleid van de S1-segment van de rat nier proximale tubulus (WKPT-0293 Cl.2) 19 beschrijven we een geoptimaliseerde vereenvoudigd methode voor het meten van veranderingen in cytosolische calciumconcentratie door flowcytometrie. Aangezien veel epitheelcellen een aantal organische transporteurs voor anionische verbindingen bezitten, kan het laden van de cellen met een calcium indicator blijken te zijn een uitdaging. Om de uitstroom van calcium indicatoren, probenecide, de prototypische remmer van organische aniontransporters en oorspronkelijk ontwikkeld om de renale uitscheiding van penicilline 20 afnemen voorkomen, wordt gelijktijdig toegepast in de incubatie medium. De cellen worden gehandhaafd in monolagen op calcium indicator laden gebracht suspensie en calcium signalen direct na toevoeging verbinding gedetecteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia en oplossingen
- Bereid een gemodificeerde Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) (in mm: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, zonder fenolrood). Bewaren bij 4 ° C.
- Voeg 1,5 M CaCl2 en 2 M 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES) (pH 7,2) voorraadoplossingen met gedestilleerd water.
- Bereid een 250 mM voorraad oplossing van probenecide. Voor het vrije zuur (vaak aangeduid als water oplosbaar), ontbinden probenecide poeder in 1 N NaOH, vul tot driekwart van het uiteindelijke volume met gedestilleerd water en langzaam titreren tot pH 7,4 met 1 N HCl. Bewaren bij 4 ° C.
- Los fluorescente membraan permeabel calcium bindende kleurstof in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) een voorraad concentratie van 1 mM. Bewaar bij -20 ° C in het donker.
- Voorafgaand aan elk experiment vers bereid, bevattende probenecide HBSS flux (PHF) buffer door combineren gemodificeerd met HBSS (in uiteindelijke concentraties) 1,5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% foetaal runderserum, 2 mM probenecide en 5.55 mM glucose. Warm tot 37 ° C.
2. Celkweek
- Plaat 2,5 x 10 5 nier proximale tubulus cellen (WKPT-0293 Cl.2) per putje van een 6 well plaat of schaal van 35 mm in standaard kweekmedium en te groeien voor 2 dagen het bereiken van een samenvloeiing van ongeveer 70%.
3. Calcium Dye Loading
- Voor elk putje of schaal, meng 1 ml kweekmedium dat 5% foetaal runderserum, 4 uM celpermeabel calciumbindende kleurstof en 2 mM probenecide.
- Vervang het kweekmedium met 1 ml loading dye mengsel in elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Bedek de plaat met aluminiumfolie om het bleken van de fluorescerende indicator voorkomen.
4. Bereiding van CeLLS voor flowcytometrie
- Warm 0,05% trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing 37 ° C.
- Zuig calcium loading dye oplossing uit elk putje en voeg 1 ml trypsine langs de wand van de put.
- Incubeer bij 37 ° C totdat alle cellen losgemaakt.
- Overdracht cellen om een 1,5 ml buis en pellet door centrifugeren in een microcentrifuge bij 10.000 g gedurende 1 min.
- Zuig het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren.
- Was de cellen door toevoeging van 1 ml PHF buffer en resuspendeer door en neer te pipetteren.
- Pellet cellen door centrifugeren bij 10.000 g gedurende 1 min.
- Herhaal stap 4.6. en 4.7. nog twee keer.
- Resuspendeer cellen in een eindvolume van 500 pl buffer PHF en gebruik de cellen voor experimenten binnen 1 uur.
- Optioneel: Aantal cellen naar de cel concentratie te bepalen en te gebruiken 5 x 04-01 oktober x 10 5 cellen per meting.
5. Flow Cytometer Setup
- Start de flowcytometer, opent de fluïdica lade en draai de ventilatieklep tuimelschakelaar om de luchtdruk van de schede vloeistoftank verhogen.
- "Prime" het instrument om potentiële wonende luchtbellen vanuit de binnenbanden en de stroom kamer te verwijderen.
- In de flowcytometrie software, opent twee puntdiagram ramen.
- De eerste puntdiagram vereist voorwaartse strooilicht (FSC) voor de parameter X en zijkant diffuus licht (SSC) voor de parameter Y te controleren voor de kwaliteit van de cellen in het monster door respectievelijk grootte en granulariteit.
- De tweede dot plot meet de fluorescentie-intensiteit van de calcium gebonden kleurstof. Selecteer de juiste fluorescentie detectie kanaal voor de parameter Y met behulp van een logaritmische schaal en tijd in seconden voor de parameter X op een lineaire schaal.
- Stel de snelheid in op 'high'.
6. flowcytometrie Measurement
- Voer de metingen bij KT. In een flowcytometrie monsterbuis (11,5 x 75 mm), voeg 480 ul buffer PHF.
- Voeg 20 ul celsuspensie en kort vortex te mengen.
- Verplaats de tube draagarm aan de kant en plaats het monster buis over het injecteren van een monster buis totdat er een goede afdichting wordt gevormd. Zet de buis draagarm naar zijn oorspronkelijke positie gecentreerd.
- Optimaliseren meting door aanpassing van de fluorescentie kanaal zodanig dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het monster op ongeveer 10 2 op de y-as. Slaan en te gebruiken voor verdere experimenten.
- Om een experiment te beginnen, herhaalt u de stappen 6,1-6,3.
- Record basislijnfluorescentie 50 sec.
- Pauze meting, verwijder het monster buis, voeg verbinding van interesse, vortex kort en terug te keren naar de monsterinjectie buis. Deze stap niet meer dan 15 seconden duren.
- Hervat meting en gedurende een totaal van 204,8 sec.
- Gebruik een calcium ionophore zoals ionomycine (10 uM) en een calcium chelator, zoals ethyleenglycol-azijnzuur (EGTA), MnCl2 of CoCl2 (2 mM), positieve en negatieve controles, respectievelijk.
7. Data Analyse
- Analyseren van gegevens met behulp van speciale flowcytometrie software voor offline analyse, zoals WinMDI (Windows Multiple Document Interface voor flowcytometrie), een gratis software pakket ontwikkeld door Joe Trotter bij het Scripps Institute, flowcytometrie Core Facility.
- Open een dot plot met SSC en FSC parameters.
- Selecteer de regio van cellen voor analyse met behulp van de "Regio" tool (klik met de rechtermuisknop op de afbeelding) om dode cellen of cel puin gevonden in de linker benedenhoek van de data-analyse (figuur 1) uit te sluiten.
- Kwadrant analyse (figuur 2)
- Open een dichtheid perceel tijd op de x-as en fluorescentie-intensiteit op de y-as. Gebruik alle evenementen.
- Onse dezelfde gating regio als in 7.3.
- Kwantificeren van de data met behulp van de "Quadrant" tool.
- Stel het kwadrant afscheiders zodat de verticale lijn wordt geplaatst ten tijde van verbinding toevoeging en de horizontale lijn in het middelpunt van de basislijn fluorescentie in de controles. Waarborgen dat de positionering van het kwadrant afscheiders gelijk in alle monsters.
- Het percentage cellen in elk kwadrant wordt weergegeven in elke hoek (figuur 2). Vergelijk het kwadrant rechtsboven (UR) tussen de monsters.
- Histogram analyse (Figuur 3)
- Open de besturingsgegevens in een histogram raam met fluorescentie-intensiteit op de x-as en evenementen op de y-as. Gebruik alle evenementen.
- Voor een picturaal overzicht, voeg de testgegevens te worden vergeleken met de controle plot als overlay percelen (ga naar Bestand → Open File → Archief → Overlay).
- Voor kwantitatieve analyse enkele histogram winnendows worden gebruikt. Gate de celpopulatie met behulp van de regio R1 vanaf stap 7.3.
- In de niet behandelde controle, gebruikt de markering functie ("Markers") om het gebied voor ze vanuit het midden tussen de minimum en maximum fluorescentie van de controle piek en eindigt bij de maximale fluorescentie-intensiteit markeren. Het percentage cellen in dit gebied wordt berekend.
- Ophalen gegevens uit de statistieken venster. Herhaal dit voor de overige data bestanden met dezelfde gemarkeerde gebied voor analyse.
- Fluorescentie-intensiteit analyse (Figuur 4)
- Open een puntenplot tijd op de x-as en fluorescentie-intensiteit op de y-as. Gebruik alle evenementen.
- Enable "Kinetics Mode" en "Overlay Kinetics Line". Een blauwe lijn verschijnt in de dot plot die de gemiddelde fluorescentie-intensiteit.
- Kwantificeren van de relatieve instroom van calcium door het creëren van meerdere rechthoekige regio. Elke regio moet aw hebbenidth van ongeveer "50", hetgeen overeenkomt met "10 sec". Definieer tot 15 rechthoekige gebieden.
- Ophalen kwantificering van de statistieken venster en kopieer in een spreadsheet.
- Gebruik de y-gemiddelde gegevens voor analyse. Bereken het gemiddelde van R2 tot R6, wat overeenkomt met 20 tot 50 sec. Dit is de uitgangswaarde.
- Kies een geschikte tijdsinterval voor calciuminflux analyse (afhankelijk van aanvang, de duur en intensiteit).
- Bereken de calcium signalen van elk gebied binnen het tijdsinterval van het gemiddelde uitgangswaarde, dat wil zeggen, het fluorescentiesignaal voor verbinding toevoeging, die is ingesteld op 100%. Bepaal het gemiddelde en de standaarddeviatie van de regio's te posten verbinding toevoeging; Dit is de gemiddelde calcium signaal opgewekt door de verbinding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om cytosolische calcium te verhogen, werden twee farmacologische verbindingen toegepast op renale proximale tubulus cellen (WKPT-0293 Cl.2) geladen met celpermeabel calcium binden kleurstof, Fluo-3-AM. Niet-behandelde controlemonsters werden beladen met calcium bindende kleurstof in aanwezigheid van probenecide en gemengd zonder toevoeging van verbindingen. Thapsigargine (TG) is een klassieke remmer van de SERCA pomp leidt tot lekkage van de ER en resulteert in een verhoogde cytosolische calcium. Tunicamycine (TUN) blokkeert N-glycosylering van eiwitten die leiden tot activering van het ongevouwen eiwit reactie maar verhoogt cytosolische calcium 18,21. Als een positieve controle, ionomycine (IONO), calcium ionofoor die het plasmamembraan permeabel voor extracellulair calcium, werd gebruikt. Voor analyse werd de celpopulatie afgesloten door het selecteren van een gebied in de SSC / FSC puntdiagram (R1 in figuur 1). Een dichtheid plot voor fluorescentie-intensiteit versus tijd werd gemaakt voor elk gegevensbestand. Door het kwadrant functie werd puntenplot verdeeld in vier gebieden die Fluo-3 fluorescentie-intensiteit vóór en na toevoeging verbinding en boven en onder de basislijn fluorescentie. Kwantificering als percentage van gated cel populatie in elk kwadrant maakt bepaling van verhoogde cytosolische calciumconcentratie. In dit voorbeeld, 3 uM TG veroorzaakt een toename van het percentage cellen in het kwadrant rechtsboven aangeeft dat een calcium signaal geïnduceerd. Het percentage cellen stijgt van 42,8% in de controle tot 51,3% (1,20 maal) in TG behandelde cellen. Evenzo, 6 uM TUN verhoogt het percentage cellen met verhoogde calcium fluorescentie-intensiteit van 49,9% (1,17 maal). Toepassing van 10 uM IONO resulteerde in 65,5% (1,53 maal) cellen in het bovenste rechter kwadrant (Figuur 2). Het histogram analyse resulteerde in 1,41 maal, 1,36 maal en 2,11 maal door TG, TUN en IONO, respectievelijk (figuur 3) (voor statistiek, zie <sup> 18). Ten slotte, wordt de meervoudige analyse regio modus TG, TUN en IONO veroorzaakt 1.55 voudig, 1,29 maal en 4,54 maal toename in calcium signaal over controle, respectievelijk (figuur 4).
De meest gevoelige analyse-modus was de meerdere regio analyse. In tegenstelling tot het kwadrant en histogram-modi, waarbij de verdeling van de celpopulatie wordt gekwantificeerd, de verschillende regio analysemodus kwantificeert de verandering in fluorescentie signaal van de totale celpopulatie. Het grootste verschil in de resultaten van de verschillende analyses wijzen was ionomycine die varieerden van 1,53 voudige toename boven controle van het kwadrant analyse 4,54 maal de meerdere regio analyse. De geteste verbindingen vertoonden geen dergelijke variantie. Echter, in alle-modi, de omvang van de calcium signaal evoked gelijk gebleven hoewel de absolute waarden verschilden, dwz IONO had het grootste effect gevolgd door TG en vervolgens TUN. Toepassing van TG, TUN of IONO tot blijvende veranderingen in cytosolische calcium. Om te bepalen of fysiologische calcium signalen, die van voorbijgaande aard zijn, kan worden gemeten met behulp van deze methode, werd ATP toegepast op WKPT-0293 Cl.2 cellen. ATP opgeroepen een snelle en voorbijgaande calcium signaal dat niet geheel kan worden opgenomen door de flowcytometrie methode. ATP concentraties 20-100 pM waren moeilijk te detecteren dan de concentratie gereduceerd tot "vertragen" de calcium signalen. Zoals getoond in figuur 5, kan een verandering in cytosolische calcium worden gemeten na toevoeging van 5 uM ATP. Toch werd de piek van fluorescentie verandering niet opgenomen. Met het kwadrant analyse (Figuur 5B) en histogram-modi (figuur 5C), geen verschil in calciumsignalen in ATP kan worden gedetecteerd door de voorbijgaande aard van de calcium signaal. Echter, met geselecteerde delen van het spoor, de meervoudige rectangulaopgenomen r regio analysemodus 1,85 voudige toename calciumsignaal onmiddellijk hervat na meting (figuur 5A).
Figuur 1. SSC versus FSC dot plot. De integriteit van de celpopulatie wordt bepaald met zijwaartse verstrooiing (SSC) en voorwaartse verstrooiing (FSC). Een gebied wordt geselecteerd (R1) voor verdere analyse. Dode cellen en celafval, die lichtverstrooiing verminderde, zijn uitgesloten. Een representatieve dot plot wordt getoond.
Figuur 2. Quadrant analyse. Baseline fluorescentie van calcium binden-dye geladen WKPT-0293 Cl.2 cellen werd gemeten gedurende 50 sec. Meting gestopt, verbinding of diluent werd toegevoegd, gewerveld om te mengen en meten werd onmiddellijk hervat voor een totaal van 204,8 sec. Kwantificatie werd uitgevoerd met behulp van kwadrant analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Histogram analyse. Histogram perceel van calcium binden-dye geladen WKPT-0293 Cl.2 cellen behandeld met TG, TUN of IONO. Het gebruik van de marker-functie, het percentage van de gated cellen met een hoge calcium binden kleurstof fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd door het plaatsen van het beginpunt van de marker op het hoogtepunt van de controle curve en eindigt bij de maximale fluorescentie. Klik hier om een larg bekijkenre versie van deze figuur.
Figuur 4. Meerdere regio analyse. Baseline fluorescentie van calcium binden-dye geladen WKPT-0293 Cl.2 cellen werd gemeten gedurende 50 sec. Meting gestopt, verbinding of verdunningsmiddel werd toegevoegd, gewerveld om te mengen en meten werd onmiddellijk hervat voor een totaal van 204,8 sec. Kwantificatie werd uitgevoerd met behulp van meerdere rechthoekig gebied analyse. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Analyse van ATP-geïnduceerde calcium signalen. Baseline fluorescentie of calciumbindende-dye geladen WKPT-0293 Cl.2 cellen werd gemeten gedurende 50 sec. Meting werd gestopt, 5 uM ATP werd toegevoegd, gewerveld om te mengen en meten werd onmiddellijk hervat totaal 204,8 sec. De gegevens werden gekwantificeerd met meerdere rechthoekige gebied analyse (A), kwadrant analyse (B) of histogram analyse (C). Voor de verschillende regio analyse werd alleen het voorbijgaande calcium signaal geanalyseerd. Representatieve gegevens of analyse van n = 3 -. 7 worden getoond Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Calcium is een belangrijke gebeurtenis in verschillende cellulaire processen als een tweede boodschapper signaalmolecule en ook als een middel voor communicatie tussen de ER en mitochondria. Het vermogen om veranderingen in vrije cytosolische calciumconcentraties meten is een nuttige techniek die kan worden toegepast op alle gebieden van celbiologie. Er zijn verschillende methoden om cytosolische calcium signalen te detecteren. Klassiek, signalen van een ratiometrische calcium indicator, zoals Fura-2, worden bewaakt in levende cellen met behulp van een fluorescentie beeldvorming setup en absolute calciumconcentraties worden ontleend bepalen minimum en maximum fluorescentie-intensiteiten. Deze techniek vereist gespecialiseerde apparatuur, zoals een fluorescentie microscoop, een live cell imaging opgezet en analysesoftware. We beschrijven hier een eenvoudige werkwijze voor calcium detectie in het cytosol van hechtende epitheelcellen middels flowcytometrie, die toegankelijk is voor de meeste laboratoria.
Epitheel zijn in possession van een array van transporters die verantwoordelijk is voor het transport van metabolieten, xenobiotica en drugs. Van bijzonder belang is de SLC22A superfamilie, waarbij organisch kation en een organisch anion transporters behoren 22 en de ATP-bindende cassette (ATP) superfamilie, die de multidrug resistentie-P-glycoproteïne ABCB1 en multidrug resistentie eiwitten (MRP) zijn leden 23 telt . Initiële experimenten met ratten nier proximale tubulus cellijn WKPT-0293 Cl.2 werden uitgevoerd zoals beschreven in het artikel van Gergely et al. 16. De cellen werden in suspensie gebracht en geladen met Fluo-3:00. Er werd echter slechts een bescheiden verandering waargenomen met 10 uM ionomycine (38,14% versus 50,95% in controle door kwadrant analyse of 1,78 maal door meerdere regio analyse). Onze hypothese was dat epitheliale transporters waren verantwoordelijk voor de slechte laden van de cellen met Fluo-3:00. Om dit probleem, probenecide en PSC833, remmers van organische een te omzeilennion transporteurs en de multidrug resistentie P-glycoproteïne, respectievelijk, gelijktijdig aangebracht met het calciumbindende kleurstof cel monolagen. Probenecide verbeterde calcium bindend pigment laden, zoals aangegeven door een verhoging van de basislijn fluorescentie-intensiteit, terwijl PSC833 geen effect, dit in tegenstelling tot een eerder rapport in Chinese hamster ovariumcellen 24 had. Dit verschil ligt waarschijnlijk in de niveaus van ABCB1 in de verschillende cellijnen; de WKPT-0293 Cl.2 cellijn herbergt een lage endogene niveau van ABCB1, die kan worden veroorzaakt door giftige stoffen, zoals toxische metalen 25,26. Het gebruik van probenecide calcium pigment laden verbeterd kan worden uitgebreid naar andere celtypes die probenecide gevoelige transportsystemen vertonen, zoals cellen van het zenuwstelsel, bloed-hersenbarrière en de lever, waar calcium signalering een rol spelen bij intracellulaire signalering trajecten.
De eenvoudige detectie van calcium binden aan Fluo-3 leugens in zijn requirement van slechts één golflengte (506 nm) en een emissie golflengte (525 nm). De gegenereerde met enkele golflengte calcium bindende kleurstoffen als niet-ratiometrische kleurstof gegevens kan alleen worden gebruikt om de relatieve toename in cytosolische calcium dan onbehandelde controles kwantificeren. Om absolute calcium concentraties te bepalen, een ratiometrisch kleurstof is nodig omdat een spectrale verschuiving optreedt na calciumbindende dat zorgt voor correctie van ongelijke kleurstof laden en bleken. De ratiometrische kleurstof Indo-1 is gebruikt bij de detectie van calcium mobilisatie in immunologische cellen door flowcytometrie 27,28 maar tot nu toe is dit niet uitgevoerd in epitheelcellen. Gebruik van de twee emissiespectra van UV-exciteerbare Indo-1 (400 nm wanneer calcium gebonden en 475 nm wanneer calciumvrije), absolute cytosolische calciumconcentraties worden bepaald zoals beschreven door Grynkiewicz et al. 11.
Ons voorbeeld data gebruikt farmacologische verbindingen die ap inducerenermanente verandering in cytosolische calcium. Fysiologische calcium signalen zijn van lage intensiteit, weer snel kinetiek en van voorbijgaande aard zijn, dus de vraag blijft of de flowcytometrie methode is gevoelig genoeg om fysiologische calcium signalen te detecteren. Experimenten met ATP werden uitgevoerd met de WKPT-0293 Cl.2 cellijn, die purinergische receptoren herbergt zoals aangetoond door een verhoogde calcium signaal op verzoek van ATP (gemeten door live-cell imaging). Met de flowcytometer, kan verhoogde cytosolische calcium worden waargenomen met 1-100 uM ATP, maar de snelle aard van het signaal in combinatie met de vertraging hervatting meting na verbinding Bovendien betekende dat slechts een gedeelte van het signaal worden geregistreerd. Dus een groot nadeel van de flowcytometrie methode is de beperkte capaciteit om snelle (<10 sec) opnemen en voorbijgaande calcium signalen; veeleer de methode is geschikt voor stimuli die leiden tot langzamere transiënte signalen (> 10 sec) of aanhoudend verhoogd calc gevenium signalen. Deze beperkingen kunnen worden omzeild doordat stimulator concentratie of door remmers van calcium heropname mechanismen om de vrij calcium in het cytosol behouden maar voorzichtigheid moeten worden genomen om een remmer concentratie die geen verhoging cytosolische calcium per se selecteren.
De informatie verkregen door live-cell imaging en flowcytometrie zijn heel verschillend. Met live cell imaging, hoge resolutie betekent dat spatiële veranderingen in calcium kan worden gemeten door het selecteren intracellulaire gebieden van enkele cellen voor beeldvorming. Bovendien worden fluorescentiesignalen verkregen aanhoudend iedere 1-2 sec derhalve snelle calcium signalen kunnen worden opgenomen. Daarentegen flowcytometrie is geschikt voor langzamere en langdurig calciumsignalen en meet calcium signalen van gehele celpopulatie. Alleen relatieve veranderingen in calcium signalen kunnen worden gekwantificeerd met flowcytometrie methode. Maar de flowcytometrie werkwijze een aantal voordeTages opzichte van conventionele live cell imaging: 1) high throughput screening van verbindingen (stimulatoren en remmers van calcium signalering) kan worden uitgevoerd; 2) specifieke imaging expertise is niet nodig; 3) onderzoek technici kunnen de metingen uit te voeren; 4) klinische en niet-klinische laboratoria die niet de middelen hebben om een hoge resolutie imaging en ratiometrisch calcium metingen kunnen calcium signalering onderzoeken uit te voeren. Het geheel van flowcytometrie methode nuttig indien de onderzoeker aanvankelijk wil een rol voor calcium te bepalen en kan gemakkelijk remmers toepassing stroomopwaartse en stroomafwaartse signaaltransductieroutes bepalen, terwijl beeldvorming van levende cellen zouden moeten de calcium signaal karakteriseren (bijv., Kinetiek , intensiteit, ruimtelijke veranderingen) in meer detail.
Samengevat beschrijven we een snelle, eenvoudige en gevoelige methode voor de detectie van real-time relatieve veranderingen in cytosolische calcium in moeilijk te laden hechtende epitheliale niercellen, die in suspensie zijn gebracht. Voor onderzoekers zonder toegang tot een stroomcytometrie, kan deze werkwijze gemakkelijk worden toegepast op een spectrofluorimeter met de celsuspensie in een cuvet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Onderzoek in de laboratoria wordt gefinancierd door de Fritz-Bender Foundation, München, Duitsland (TD) en de Universiteit van Witten / Herdecke intern onderzoek subsidie (tot W.-KL). We willen graag Prof Dr. Dr. Frank Thévenod bedanken (Instituut voor Fysiologie, Pathofysiologie en toxicologie, Universiteit van Witten / Herdecke) voor nuttige tips.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
