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Biology

Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux

Published: October 28, 2014 doi: 10.3791/51857
Automatic Translation
1, 2
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

Summary

Le calcium est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Imagerie des cellules vivantes nécessite un équipement spécialisé et peut prendre du temps. Une méthode simple et rapide à l'aide d'un cytomètre de flux pour déterminer les changements relatifs au calcium cytosolique dans les cellules épithéliales adhérentes mises en suspension a été optimisée.

Introduction

Le calcium est un second messager important de responsable de la transmission de signaux physiopathologiques 1 et physiologique cellulaire. Les concentrations de calcium cytosolique sont maintenus bas grâce à l'activité des pompes et des échangeurs de calcium de calcium. Le sarcoplasmique / endoplasmique ATPase du réticulum calcium (SERCA) remplit le réticulum endoplasmique (RE) magasin de calcium dans le cadre d'un système de «pompe de fuite" alors que le calcium ATPase de la membrane plasmique (PMCA) expulse calcium dans le compartiment extracellulaire, à la fois dans les mœurs dépendant de l'ATP 2. Messagers physiologiques, telles que des hormones ou des neurotransmetteurs, transmettent leurs signaux à G récepteurs couplés aux protéines, l'activation de la phospholipase C, qui hydrolyse le phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) dans la membrane plasmique à générer diacylglycérol et l'inositol triphosphate (IP3) 3. Bien diacylglycérol reste dans la membrane plasmique, IP3 diffuse dans le cytosol et se lie à un récepteur d'IP3s (IP3Rs), qui sont activés ligand canaux calciques, qui se trouvent dans la membrane du RE et le calcium est libéré du magasin ER luminale a abouti à une augmentation de la concentration en calcium cytosolique 4. Une autre voie pour le calcium pour atteindre le cytosol est à travers les canaux calciques et des échangeurs présents dans la membrane plasmique. Diaphonie entre ces deux compartiments ont été décrites: la libération de calcium de calcium induite (CICR) où le calcium extracellulaire induit la libération de calcium à partir de ER magasins 5 et magasin exploité entrée de calcium (SOCE) où la vidange des magasins à l'urgence est détectée par la STIM et provoque l'ouverture de Orai les canaux de calcium dans la membrane plasmique afin de promouvoir le remplissage des magasins ER 6.

Dans des conditions physiopathologiques, la réponse calcique cellulaire est l'augmentation de calcium cytosolique déréglementés et en l'absence de stimulateurs physiologiques 1. La réponse du calcium peut être affectée à un certain nombre de façons: calcium prolongésignal retardé élimination du calcium du cytosol, l'épuisement des réserves de calcium ou des changements localisés de calcium. En outre, les mitochondries ont un rôle central dans la mémoire tampon et la libération de calcium 7. Prolongé et / ou supramaximal augmentation de calcium cytosolique entraîne la mort cellulaire. En fait, le calcium est le plus souvent impliqué dans la réponse physiopathologique cellulaire et est un événement clé dans un large éventail de maladies, comme les maladies neurodégénératives, les maladies cardiaques, le cancer, les maladies osseuses et les maladies du rein, qui sont principalement associée à la mort cellulaire et la perte ou l'altération des organes ou de tissus fonction 8-10. En outre, la perturbation des signaux du calcium a été liée à l'adaptation cellulaire et des changements dans les fonctions cellulaires et des réponses.

Traditionnellement, les signaux calciques sont mesurés avec un indicateur de calcium fluorescent chargé négativement qui est chargé dans les cellules sous forme d'un ester d'acétoxyméthyle cellule perméable (AM). Une fois clivée par esteras cellulaireses, les indicateurs fluorescents restent dans le compartiment intracellulaire et augmentent l'intensité de fluorescence lorsque le calcium est lié. L'indicateur de calcium le plus connu et utilisé est le quotientométrique Fura-2 développé par Roger Tsien et ses collègues 11. indicateurs de calcium ayant des affinités différentes pour le calcium permettent à différents pools de calcium à surveiller. Les méthodes de détection comprennent l'imagerie des cellules vivantes, fluorescence lecteur de microplaques et la cytométrie de flux. La cinétique relativement rapide de signaux calciques (généralement au bout de quelques secondes à quelques minutes) fait Imagerie de cellules vivantes la meilleure méthode pour gagner le plus d'informations sur les caractéristiques du signal de calcium. Mis à part la cinétique rapide de signaux calciques (quelques millisecondes), imagerie de cellules vivantes est une meilleure méthode pour étudier la compartimentation cellulaire de la signalisation calcique dans une seule cellule 12. Les concentrations de calcium absolues peuvent être calculées par la détermination de la fluorescence minimale et maximale du calcium indicator par addition d'un chélateur de calcium et perméabilisation des cellules, respectivement, comme décrit par Grynkiewicz et al., 11.

L'utilisation de la cytométrie en flux pour mesurer des signaux de calcium a été développé dans les années 1980 dans des cellules immunologiques où la possibilité de mesurer des paramètres tels que l'intégrité de la membrane et la séparation de la population de cellules, et l'exigence de cellules en suspension combinée avec le développement de la longueur d'onde unique indicateurs de calcium fait cytométrie de flux une méthode idéale et convenientdetection 13-15. Dans les cellules adhérentes, imagerie des cellules vivantes fournit le plus d'informations sur la signalisation calcique, surtout la cinétique, mais nécessite une installation complexe comprenant un microscope à fluorescence, un système de perfusion, l'entretien de l'environnement cellulaire, telles que la température, et un logiciel de microscope spécialisé pour l'acquisition et l'analyse des données. Des méthodes alternatives comme un lecteur de microplaques à fluorescence ou pharmacolmoyens giques grâce à l'utilisation de chélateurs de calcium sont incomparables en termes d'information acquise. La cytométrie en flux est de plus en plus largement utilisés pour surveiller calcium cytosolique dans les cellules adhérentes si, dans la majorité des études, ne finissent point les mesures sont effectuées. En utilisant le procédé développé initialement par Gergely et al., Dans les cellules B immunologiques 16, les variations de concentration de calcium libre cytosolique par cytométrie en flux avec une cinétique en temps réel et le contrôle de l'intensité de fluorescence dans des cellules individuelles à partir d'une population d'échantillon ont été mesurés avec succès dans des cellules épithéliales cancéreuses et les hybrides de cellules souches du cancer 17. Cette méthode est en outre adapté pour une utilisation dans des cellules épithéliales adhérentes, qui sont difficiles à charger avec des indicateurs de calcium 18.

Ici, en utilisant une lignée de cellules épithéliales immortalisées adhérente dérivée du segment S1 du rein de rat tubule proximal (CL.2 WKPT-0293) 19, nous décrivons un m simplifié optimisééthode pour la mesure de l'évolution de la concentration en calcium cytosolique par cytométrie de flux. Depuis de nombreuses cellules épithéliales possèdent un certain nombre de transporteurs organiques pour les composés anioniques, le chargement des cellules avec un indicateur de calcium peut se révéler être un défi. Pour éviter que l'efflux de calcium, les indicateurs de probénécide, l'inhibiteur prototype de transporteurs d'anions organiques et développé à l'origine pour diminuer l'excrétion rénale de la pénicilline 20, est appliquée simultanément dans le milieu d'incubation. Les cellules sont maintenues dans des monocouches de chargement indicateur de calcium, mis en suspension et des signaux de calcium peuvent être détectés immédiatement après l'addition du composé.

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Protocol

1. Préparation des réactifs et des solutions

  1. Préparer une solution de Hank équilibrée en sel modifié (HBSS) (en mM: NaCl 136,9, KCl 5,37, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, sans rouge de phénol). Conserver à 4 ° C.
  2. Ajouter 1,5 M de CaCl2 2 M et l'acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7,2) des solutions de réserve avec de l'eau distillée.
  3. Préparer une solution 250 mM d'achat d'actions de probénécide. Pour la forme de l'acide libre (souvent désigné comme insoluble dans l'eau), dissoudre la poudre dans le probénécide 1 N NaOH, remplir aux trois quarts du volume final avec de l'eau distillée et titrer lentement à pH 7,4 avec HCl 1. Conserver à 4 ° C.
  4. Dissoudre membrane perméable calcium fluorescent colorant de liaison dans diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) à une concentration stock de 1 mM. Conserver à -20 ° C dans l'obscurité.
  5. Avant chaque expérience, fraîchement préparer H contenant le probénécide,BSS flux (FSP) en combinant un tampon modifié avec du HBSS (en concentrations finales) 1,5 mM de CaCl2, 10 mM d'HEPES, pH 7,2, 5% de sérum bovin fœtal, 2 mM de probénécide de, et 5,55 mM de glucose. Chaud à 37 ° C.

2. Culture Cellulaire

  1. Plate cellules 2,5 x 10 5 rénaux proximaux des tubules (WKPT-0293 CL.2) par puits d'une boîte 6 de la plaque ou bien 35 mm dans un milieu de culture standard et se développent pendant 2 jours pour atteindre un confluence d'environ 70%.

3. Calcium Dye Chargement

  1. Pour chaque plat bien ou, mélanger milieu de culture de 1 ml contenant 5% de sérum de veau fœtal, 4 cellules uM perméable colorant de liaison de calcium et 2 mM de probénécide.
  2. Remplacer le milieu de culture avec 1 ml de mélange chargement de colorant dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 30 min dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. Couvrir la plaque avec une feuille d'aluminium pour empêcher le blanchiment de l'indicateur fluorescent.

4. Préparation de CeLLS pour cytométrie en flux

  1. 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétra-chaud (EDTA), solution à 37 ° C.
  2. Solution de colorant de chargement de calcium Aspirer chaque puits et ajouter 1 ml de trypsine long de la paroi du puits.
  3. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que toutes les cellules sont décollées.
  4. les cellules de transfert à un tube de 1,5 ml et culot par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 10 000 g pendant 1 min.
  5. Aspirer soigneusement le surnageant sans déranger le culot.
  6. Laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon de PHF et remettre en suspension par pipetage de haut en bas.
  7. Pellet les cellules par centrifugation à 10000 g pendant 1 min.
  8. Répétez les étapes 4.6. et 4.7. encore deux fois.
  9. Remettre en suspension les cellules dans un volume final de 500 ul de tampon de PHF et en utilisant les cellules à l'intérieur de l'expérimentation 1 heure.
  10. Facultatif: cellules de comptage pour déterminer la concentration de cellules et utilisent 5 x 10 4 - 1 x 10 5 cellules par mesure.

5. Débit CytOmeter Setup

  1. Lancer le cytomètre en flux, ouvrez le tiroir fluidique et appuyer sur l'interrupteur à bascule valve de ventilation pour augmenter la pression d'air du réservoir de liquide de gaine.
  2. "Premier" l'instrument pour éliminer les bulles d'air éventuelles résidant à l'intérieur des chambres à air et la chambre d'écoulement.
  3. Dans le logiciel de cytométrie de flux, d'ouvrir deux fenêtres points de l'intrigue.
    1. Le premier tracé de points nécessite la lumière diffusée vers l'avant (FSC) pour le paramètre X et la lumière de côté dispersé (SSC) pour le paramètre Y pour contrôler la qualité des cellules dans l'échantillon par leur taille et leur granularité, respectivement.
    2. Le deuxième tracé de points de mesure l'intensité de fluorescence du colorant lié au calcium. Sélectionnez le canal de détection de fluorescence appropriée pour le paramètre Y en utilisant une échelle logarithmique et le temps en secondes pour le paramètre X sur une échelle linéaire.
  4. Réglez le taux de «haute» de flux.

6. cytométrie en flux Mesure

  1. Effectuer les mesures à température ambiante. Dans un tube de cytométrie de flux de l'échantillon (11,5 x 75 mm), ajouter du tampon de PHF 480 ul.
  2. Ajouter 20 ul suspension de cellules et de vortex brièvement pour mélanger.
  3. Déplacer le bras de support de tube vers le côté et positionner le tube à échantillon sur le tube d'injection d'échantillon jusqu'à ce que un joint étanche est formé. Remettre le bras de support de tube à sa position centrée originale.
  4. Optimisation de mesure en réglant le canal de fluorescence de telle sorte que l'intensité moyenne de la fluorescence de l'échantillon est d'environ 10 2 sur l'axe des y. Enregistrer et utiliser pour des expériences ultérieures.
  5. Pour commencer une expérience, répétez les étapes 6.1 à 6.3.
  6. Enregistrez fluorescence de base pour 50 sec.
  7. Pause mesure, retirer le tube d'échantillon, ajouter composé d'intérêt, vortex brièvement et revenir au tube d'injection d'échantillon. Cette étape ne devrait pas prendre plus de 15 secondes.
  8. Reprendre la mesure et continuer pour un total de 204,8 sec.
  9. Utilisez un i de calciumonophore, tel que l'ionomycine (10 uM), et d'un chélateur du calcium, tel que l'éthylèneglycol tétraacétique (EGTA), MnCl 2 ou CoCl 2 (2 mM), des contrôles, respectivement positive et négative.

Analyse 7. données

  1. Analyser les données en utilisant un logiciel de cytométrie en flux dédié pour l'analyse en ligne, tels que WinMDI (Multiple Document Interface Windows pour cytométrie en flux), un logiciel gratuit développé par Joe Trotter à l'Institut Scripps, Cytométrie en flux Core.
  2. Ouvrez un tracé de points avec les paramètres de la SSC et FSC.
  3. Sélectionnez la région de cellules pour l'analyse à l'aide de l'outil "des régions" (clic droit sur ​​l'image) d'exclure les cellules mortes ou les débris cellulaires trouvé dans le coin inférieur gauche de l'analyse des données (Figure 1).
  4. Analyse Quadrant (Figure 2)
    1. Ouvrir un diagramme de densité en fonction du temps sur l'axe des x et l'intensité de fluorescence sur l'axe des y. Utilisez tous les événements.
    2. Nousenvoyer la même région de déclenchement comme dans 7.3.
    3. Quantifier les données en utilisant l'outil "Quadrant".
    4. Régler les séparateurs quadrants de telle sorte que la ligne verticale est placé au moment de l'addition du composé et de la ligne horizontale est placée au centre de la fluorescence de ligne de base chez les témoins. Assurez-vous que le positionnement des séparateurs de quadrant est égale dans tous les échantillons.
    5. Le pourcentage de cellules dans chaque quadrant est affichée dans chaque coin (figure 2). Comparer le quadrant supérieur droit (UR) entre les échantillons.
  5. analyse de l'histogramme (figure 3)
    1. Ouvrir les données de commande dans une fenêtre de l'histogramme de l'intensité de fluorescence sur l'axe des x et des événements sur l'axe des y. Utilisez tous les événements.
    2. Pour une vue d'ensemble pictural, ajouter les données de test pour être comparé à l'intrigue comme parcelles de superposition de commande (allez dans Fichier → Ouvrir Fichier → → Sélectionnez le fichier Overlay).
    3. Pour l'analyse quantitative, seul histogramme gagnerDow doivent être utilisés. Porte le population de cellules à l'aide de la région R1 de l'étape 7.3.
    4. Dans le témoin non traité, utilisez la fonction de marqueur («marqueurs») pour marquer la zone d'analyse à partir de la mi-chemin entre le minimum et le maximum de fluorescence du pic de contrôle et se terminant à l'intensité de la fluorescence maximale. Le pourcentage de cellules dans cette zone est calculée.
    5. Récupérer des données à partir de la fenêtre des statistiques. Répétez l'opération pour les autres fichiers de données en utilisant la même zone marquée pour l'analyse.
  6. analyse de l'intensité de fluorescence (Figure 4)
    1. Ouverture d'un tracé de points dans le temps sur l'axe des x et l'intensité de fluorescence sur l'axe des y. Utilisez tous les événements.
    2. Activer "Mode cinétique» et «Overlay ligne Kinetics". Une ligne bleue apparaît dans le tracé de points représentant l'intensité moyenne de fluorescence.
    3. Quantifier l'afflux de calcium par rapport en créant des régions rectangulaires multiples. Chaque région doit avoir awidth d'environ "50", ce qui équivaut à "10 secondes". Définir jusqu'à 15 zones rectangulaires.
    4. Récupérer quantification de la fenêtre des statistiques et copiez-les dans une feuille de calcul.
    5. Utilisez les données de Y-moyen pour analyse. Calculer la moyenne des R2 à R6, qui est équivalente à 20 à 50 sec. Ceci est la valeur de référence.
    6. Choisissez un intervalle de temps approprié pour l'analyse de l'afflux de calcium (dépend de début, la durée et l'intensité).
    7. Calculer les signaux de calcium de chaque région à l'intérieur de cet intervalle de temps par rapport à la valeur moyenne de référence, qui est, le signal de fluorescence avant l'addition de composé, qui est fixé à 100%. Déterminer la moyenne et l'écart type des régions poster plus composé; ce moyen est le signal de calcium provoquée par le composé.

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Representative Results

Pour augmenter le calcium cytosolique, deux composés pharmacologiques ont été appliquées aux cellules des tubules rénaux proximaux (WKPT-0293 CL.2) chargés de colorant de liaison cellulaire calcium perméable, Fluo-3-AM. Les échantillons de contrôle non traités ont été chargées avec un colorant de liaison de calcium en présence de probénécide et ont été mélangés mais sans l'addition de tous les composés. Thapsigargine (TG) est un inhibiteur classique de la pompe de SERCA conduisant à une fuite hors de l'ER et entraînant une augmentation de calcium cytosolique. Tunicamycine (TUN) blocs de N-glycosylation des protéines conduisant à l'activation de la réponse de la protéine dépliée, mais augmente également le calcium cytosolique 18,21. Comme témoin positif, ionomycine (IONO), un ionophore du calcium fabrication de la membrane de plasma perméable au calcium extracellulaire, a été utilisé. Pour l'analyse, la population de cellules a été déclenché par la sélection d'une région dans le tracé de points SSC / FSC (R1 sur la figure 1). Une parcelle de densité de l'intensité de fluorescence en fonction du temps a été créé pour chaque fichier de données. En utilisant la fonction quadrant, le tracé de points a été séparé en quatre zones représentant Fluo-3 intensité de fluorescence avant et après l'addition du composé et au-dessus et au-dessous de la fluorescence de base. Quantification en pourcentage de la population de cellules fermée dans chaque quadrant permet de déterminer la concentration accrue de calcium cytosolique. Dans cet exemple, 3 uM TG provoque une augmentation du pourcentage de cellules dans le quadrant supérieur droit indiquant qu'un signal de calcium a été induite. Le pourcentage de cellules augmente de 42,8% à 51,3% pour le contrôle (1,20 fois) dans les cellules traitées TG. De même, 6 uM TUN augmente le pourcentage de cellules présentant une augmentation de l'intensité de fluorescence de calcium à 49,9% (1,17 fois). Application de 10 uM IONO abouti à 65,5% (1,53 fois) de cellules dans le quadrant supérieur droit (figure 2). L'analyse de l'histogramme a abouti à 1,41 fois, 1,36 fois et 2,11 fois par TG, TUN et IONO, respectivement (figure 3) (pour les statistiques, voir <sup> 18). Enfin, en utilisant le mode d'analyse de la région multiple, TG, TUN et IONO causés 1,55 fois, 1,29 fois et 4,54 fois dans l'augmentation signal de calcium plus de contrôle, respectivement (figure 4).

Le mode d'analyse le plus sensible est l'analyse de la région multiple. A la différence du quadrant et les modes d'analyse de l'histogramme, où la distribution de la population cellulaire est quantifiée, le mode d'analyse de la région multiple quantifie la variation du signal fluorescent provenant de la population cellulaire totale. La plus grande différence dans les résultats des différents modes d'analyse était pour ionomycine qui variait de 1,53 fois plus le contrôle de l'analyse quadrant à 4,54 fois à partir de l'analyse de la région multiple. Les composés testés ne présentent pas de tels écarts. Cependant, dans tous les modes d'analyse, la mesure de signal d'induit de calcium est resté le même si les valeurs absolues diffèrent, à savoir, IONO a le plus grand effet suivie TG puis TUN. Application de la TG, TUN ou IONO entraîne des changements permanents dans le calcium cytosolique. Pour déterminer si les signaux physiologiques de calcium, qui sont transitoires, peuvent être mesurés en utilisant cette méthode, l'ATP a été appliqué à des cellules CL.2 WKPT-0293. ATP évoqué un signal de calcium rapide et transitoire, qui ne pouvait pas être enregistré dans son intégralité par la cytométrie en flux méthode. Concentrations d'ATP à 20 à 100 um sont difficiles à détecter par conséquent la concentration a été réduite à "ralentir" les signaux calciques. Comme le montre la Figure 5, un changement de calcium cytosolique peut être mesurée après l'addition de 5 uM d'ATP. Cependant, le pic de changement de fluorescence n'a pas été enregistré. Utilisation de l'analyse quadrant (figure 5B) et l'analyse de l'histogramme (figure 5C) modes, aucune différence dans les signaux de calcium dans l'ATP ont pu être détectées en raison de la nature transitoire du signal du calcium. Cependant, avec certaines parties de la trace, le multiple rectangular mode d'analyse de région a enregistré une multiplication par 1,85 du signal de calcium immédiatement mesure (figure 5A) après la reprise.

Figure 1
Figure 1. SSC en fonction de FSC tracé de points. L'intégrité de la population cellulaire est évaluée en utilisant la dispersion latérale (SSC) et diffusion vers l'avant (FSC). Une région est sélectionnée (R1) pour une analyse ultérieure. Les cellules mortes et les débris cellulaires, qui ont réduit la diffusion de la lumière, sont exclus. Une parcelle de point représentatif est montré.

Figure 2
Figure 2. Analyse de Quadrant. Fluorescence de ligne de base WKPT-0293 CL.2 cellules chargées de colorant de liaison de calcium a été mesurée pendant 50 sec. La mesure a été arrêté, composé ou diluent a été ajouté, vortex pour mélanger et mesure a été repris immédiatement pour un total de 204,8 sec. La quantification a été réalisée en utilisant l'analyse quadrant. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Analyse de l'histogramme. histogramme de WKPT-0293 cellules CL.2 chargées de colorant traités avec TG, TUN ou IONO fixation du calcium. Utilisation de la fonction de marqueur, le pourcentage de cellules fermée avec liaison haute teneur en calcium intensité de fluorescence du colorant a été quantifiée en positionnant le point de repère de départ au sommet de la courbe de contrôle et se terminant à la fluorescence maximale. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une largVersion er de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. Multiple analyse de région. Fluorescence de ligne de base WKPT-0293 CL.2 cellules chargées de colorant de liaison de calcium a été mesurée pendant 50 sec. La mesure a été arrêté, a été ajouté composé ou diluant, vortex pour mélanger et mesure a été repris immédiatement pour un total de 204,8 sec. La quantification a été réalisée à l'aide de multiples analyses de région rectangulaire. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Analyse des signaux calciques induits par l'ATP. Baseline fluorescence of WKPT-0293 CL.2 cellules chargées de colorant de liaison de calcium a été mesurée pendant 50 sec. La mesure a été arrêté, 5 pM d'ATP a été ajouté, vortex pour mélanger et mesure a été repris immédiatement pour un total de 204,8 sec. Les données ont été quantifiée en utilisant une analyse multiple de la région rectangulaire (A), l'analyse quadrant (B) ou une analyse d'histogramme (C). Pour l'analyse de la région multiple, seul le signal transitoire de calcium a été analysée. Données ou des analyses à partir de n = 3 représentatives -. 7 sont présentés Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le calcium est un événement clé dans de nombreux processus cellulaires qui agissent comme une seconde molécule de signalisation de messager et également en tant que moyen pour la communication entre le RE et les mitochondries. La capacité de mesurer l'évolution des concentrations libres de calcium cytosolique est une technique utile qui peut appliquer à tous les domaines de la biologie cellulaire. Il existe différentes méthodes pour détecter les signaux de calcium cytosolique. Classiquement, des signaux d'un indicateur de calcium ratiométrique, comme le Fura-2, sont surveillés dans les cellules vivantes en utilisant une installation d'imagerie par fluorescence et les concentrations en calcium absolues peuvent être dérivées à partir de la détermination des intensités de fluorescence maximales et minimales. Cependant, cette technique nécessite un équipement spécialisé, comme un microscope à fluorescence, une imagerie des cellules vivantes mis en place et un logiciel d'analyse. Ici, nous décrivons une méthode simple pour la détection du calcium dans le cytosol de cellules épithéliales adhérentes à l'aide de la cytométrie en flux, qui est accessible à la plupart des laboratoires.

Les épithéliums sont en posSession d'un réseau de transporteurs responsables du transport des métabolites, des xénobiotiques et des médicaments. Une importance particulière est la superfamille des SLC22A, à laquelle cation organique et anions organiques transporteurs appartiennent 22, et la cassette (ATP) superfamille, ATP-binding qui compte le multirésistance ABCB1 et la multirésistance des protéines de la glycoprotéine P (MRP) parmi ses membres 23 . Les premières expériences utilisant le rein de rat lignée de cellules du tubule proximal WKPT-0293 CL.2 ont été réalisées comme décrit dans l'article de Gergely et al., 16. Les cellules ont été mises en suspension et chargées avec Fluo-trois heures. Cependant, seul un changement modeste a été observée avec 10 uM d'ionomycine (38,14% contre 50,95% en contrôle par analyse de quadrant ou 1,78 fois par une analyse de région multiple). Nous émettons l'hypothèse que les transporteurs épithéliales étaient responsables de la mauvaise chargement des cellules avec du Fluo-trois heures. Pour contourner ce problème, le probénécide et PSC833, les inhibiteurs d'un organiqueles transporteurs de Nion et la multirésistance aux médicaments P-glycoprotéine, respectivement, ont été appliqués en même temps que le colorant de liaison au calcium des monocouches de cellules. Le probénécide améliorer la fixation du calcium charge de colorant, comme il est indiqué par une augmentation de l'intensité de fluorescence de base, tandis que PSC833 n'a eu aucun effet, ce qui est en contraste avec un rapport précédent dans des cellules d'ovaire de hamster chinois 24. Cette différence est probablement dans les niveaux de ABCB1 dans les différentes lignées cellulaires; la lignée cellulaire CL.2 WKPT-0293 abrite un faible niveau endogène de ABCB1, qui peut être induit par des substances toxiques, comme les métaux toxiques 25,26. L'utilisation de probénécide pour améliorer calcium charge de colorant peut être étendue à d'autres types de cellules qui présentent les systèmes de transport probénécide sensibles, telles que des cellules du système nerveux, barrière sang-cerveau et le foie, où la signalisation du calcium peut jouer un rôle dans la signalisation intracellulaire voies.

La détection facile de la fixation du calcium sur Fluo 3-mensonges dans son requiRement d'une seule longueur d'onde d'excitation (506 nm) et une longueur d'onde d'émission (525 nm). Toutefois, les données produites avec des colorants de liaison de longueur d'onde unique de calcium, en tant que colorant non-ratiométrique, ne peuvent être utilisés pour quantifier l'augmentation par rapport au calcium cytosolique par rapport aux témoins non traités. Pour déterminer les concentrations de calcium absolus, un colorant quotientométrique est nécessaire, car un décalage spectral se produit après la fixation du calcium qui permet de corriger une charge inégale de teinture et de blanchiment. Le colorant ratiométrique Indo-1 a été utilisé dans la détection de la mobilisation du calcium dans les cellules immunitaires par cytométrie de flux 27,28, mais jusqu'à présent, cela n'a pas été effectué dans des cellules épithéliales. En utilisant les spectres d'émission de deux excitable par les UV indo-1 (400 nm lorsque le calcium lié et 475 nm lorsque le calcium libre), la concentration de calcium cytosolique absolue peut être déterminée comme décrit par Grynkiewicz et al., 11.

Les données de l'exemple employer des composés pharmacologiques qui induisent apchangement ermanent en calcium cytosolique. Signaux calciques physiologiques sont de faible intensité, présentent une cinétique rapide et sont transitoires, donc la question est de savoir si la cytométrie en flux méthode est suffisamment sensible pour détecter des signaux physiologiques de calcium. Les expériences ont été réalisées avec l'ATP avec la lignée cellulaire CL.2 WKPT-0293, qui abrite les récepteurs purinergiques comme démontré par une augmentation de signal de calcium lors de l'application de l'ATP (mesuré par imagerie des cellules vivantes). En utilisant le cytomètre en flux, l'augmentation de calcium cytosolique a pu être observé avec 1 à 100 uM d'ATP, mais la nature rapide du signal combiné avec le retard de la reprise de la mesure après l'addition du composé signifie que seule une partie du signal peut être enregistré. Ainsi, un inconvénient majeur de la méthode de cytométrie en flux est sa faible capacité à enregistrer rapide (<10 s) et les signaux transitoires de calcium; au lieu de la méthode est plus appropriée pour des stimuli qui donnent lieu à des signaux transitoires lents (> 10 s) ou calc élevée persistantesignaux ium. Ces limitations peuvent être contournées en réduisant la concentration de stimulateur ou par application d'inhibiteurs de la recapture de mécanismes de calcium pour conserver le calcium libéré dans le cytosol, mais il faut être prudent pour sélectionner une concentration d'inhibiteur à ne pas augmenter le calcium cytosolique en soi.

L'information acquise par imagerie des cellules vivantes et cytométrie de flux sont très différents. Grâce à l'imagerie des cellules vivantes, la haute résolution signifie que les modifications spatiales calcium peuvent être mesurés en sélectionnant les régions intracellulaires de cellules uniques pour l'imagerie. En outre, les signaux de fluorescence sont acquises chaque escale 1 - 2 sec donc signaux calciques rapides peuvent être enregistrées. En revanche, la cytométrie de flux est plus adapté pour des signaux plus lents et de longue durée de calcium et de mesure des signaux calciques à partir d'une population de cellules entières. Seuls les changements relatifs dans les signaux calciques peuvent être quantifiés avec la cytométrie de flux méthode. Mais, le procédé de cytométrie en flux a un certain nombre d'avantages plus de l'imagerie des cellules vivantes classique: 1) criblage à haut débit de composés (stimulateurs et inhibiteurs de la signalisation de calcium) peuvent être effectuées; 2) l'expertise de l'imagerie spécifique est pas nécessaire; 3) techniciens de recherche peuvent effectuer les mesures; 4) les laboratoires cliniques et non cliniques qui ne possèdent pas les moyens de réaliser une imagerie de haute résolution et des mesures de calcium ratiométriques peut enquêter sur la signalisation calcique. Dans l'ensemble, la cytométrie en flux méthode est utile si l'enquêteur souhaite d'abord d'établir un rôle pour le calcium et pourrait facilement appliquer les inhibiteurs de déterminer les voies de signalisation en amont et en aval, tandis que l'imagerie des cellules vivantes serait nécessaire pour caractériser le signal de calcium (par ex., La cinétique , l'intensité, les changements spatiaux) plus en détail.

En résumé, nous décrivons une méthode rapide, simple et sensible pour la détection de variations relatives en temps réel en calcium cytosolique dans des conditions difficiles à charge rénale épithéliale adhérentcellules, qui ont été mises en suspension. Pour les expérimentateurs sans accès à une cytométrie de flux, ce procédé peut être facilement appliqué sur un spectrofluorimètre avec la suspension de cellules dans une cuvette.

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Acknowledgments

La recherche dans les laboratoires est financé par la Fondation Fritz-Bender, Munich, Allemagne (TD) et l'Université de Witten / Herdecke subvention de recherche interne (W.-KL). Nous tenons à remercier le Professeur Dr. Dr. Frank Thévenod (Institut de Physiologie, Physiopathologie et toxicologie, Université de Witten / Herdecke) pour des suggestions utiles.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-3, AM Invitrogen F-1241  Cell permeable
Probenecid Sigma-Aldrich P-8761 Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-062
Ionomycin Sigma-Aldrich I9657
Thapsigargin Tocris Bioscience 1138
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) Joe Trotter, The Scripps Institute Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)

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Mesures de calcium cytosolique dans les cellules épithéliales rénales par cytométrie en flux
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Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic… More

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (92), e51857, doi:10.3791/51857 (2014).

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