Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

Published: October 28, 2014 doi: 10.3791/51857
Automatic Translation
1, 2
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

Summary

סידן הוא מעורב במסלולי איתות פיסיולוגיים וpathophysiological רבות. הדמיה תא חי דורשת ציוד מיוחד ויכולה להיות זמן רב. שיטה מהירה, פשוטה באמצעות cytometer זרימה לקבוע שינויים יחסי בסידן cytosolic בתאי האפיתל חסיד הביאו להשעיה הייתה מותאמת.

Introduction

סידן הוא שליח שני חשוב אחראי להעברת פיזיולוגית סלולריים ואותות pathophysiological 1. ריכוז יוני הסידן Cytosolic נשמרים נמוך באמצעות הפעילות של משאבות סידן ומחליפי סידן. ATPase סידן הרשתית / endoplasmic sarcoplasmic (SERCA) ממלא reticulum endoplasmic (ER) חנות סידן כחלק ממערכת "דליפת משאבה", ואילו ATPase סידן קרום פלזמה (PMCA) extrudes סידן לתא תאי, הן בנימוסים תלוי ATP 2. שליחים פיסיולוגיים, כמו הורמונים או נוירוטרנסמיטרים, לשדר אותותיהם באמצעות קולטנים G- חלבון בשילוב, הפעלה של C פוספוליפאז, שhydrolyses phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) בקרום הפלזמה לייצר אדנוזין diacylglycerol ואינוסיטול (IP3) 3. בעוד diacylglycerol נשאר בקרום הפלזמה, IP3 מתמוסס לתוך cytosol ונקשר לקולטן ה- IP3s (IP3Rs), אשר יגנד מופעלות ערוצי סידן, שנמצאה בקרום ER וסידן משתחררת מחנות luminal ER הגיעה לשיאה בעלייה בריכוז יוני הסידן cytosolic 4. תוואי חלופי לסידן כדי להגיע לcytosol הוא בערוצי סידן ומחליפים קיימים בקרום הפלזמה. Crosstalk בין שני תאים אלו תוארו: שחרור סידן נגרם סידן (CICR) שבו סידן תאי גורם לשחרור סידן מחנויות ER 5, וחנות המופעלים על כניסת סידן (SOCE) שבו מתרוקן מחנויות ER נקלטת על ידי STIM וגורם לפתיחה של Orai ערוצי סידן בקרום הפלזמה לקדם מילוי חוזר של חנויות ER 6.

בתנאי pathophysiological, תגובת סידן התאית היא עליות סידן וחוסר פיקוח ממשלתיות וcytosolic בהעדר הגירוי פיסיולוגי 1. תגובת סידן עלולה להיות מושפעת במספר הדרכים: ממושך בסידןאות, התעכב פינוי סידן מcytosol, דלדול של חנויות סידן או שינויים מקומיים בסידן. יתר על כן, המיטוכונדריה לקחת על עצמו תפקיד מרכזי בחציצה ושחרור סידן 7. מתמשך ו / או עליית סידן cytosolic supramaximal מובילה למוות של תאים. למעשה, סידן הוא לעתים קרובות יותר מאשר לא מעורב בתגובת pathophysiological הסלולרית והוא אירוע מרכזי במגוון רחב של מחלות, כגון מחלת ניוון עצבי, מחלות לב, סרטן, מחלות עצם ומחלת כליות, אשר קשור בעיקר עם מוות של תאים ואובדן או שינוי של איבר או רקמת הפונקציה 8-10. יתר על כן, ההפרעות של אותות סידן נקשרה להסתגלות ושינויים בפונקציות ותגובות תאיות סלולריים.

באופן מסורתי, אותות סידן נמדדים עם מחוון סידן ניאון טעון שלילי שהוא נטען לתוך תאים בצורת acetoxymethyl החדיר תא (AM) אסתר. ביקע פעם אחת על ידי esteras הסלולריes, אינדיקטורים הניאון להישאר בתוך התא תאיים ועלייה בעוצמת הקרינה כאשר סידן הוא מחויב. מחוון סידן הידוע ביותר ומשמש הוא הפורע-2 ratiometric שפותח על ידי רוג'ר Tsien ועמיתים 11. מדדי סידן עם זיקות שונות מן לסידן לאפשר בריכות סידן שונות כדי להיות במעקב. שיטות זיהוי כוללות הדמיה תא חי, קורא microplate הקרינה וcytometry זרימה. קינטיקה מהירה יחסית של אותות סידן (בדרך כלל תוך מספר שניות עד דקות), הופכת את התא חי הדמיה השיטה הטובה ביותר להשגת רוב המידע על מאפיינים של אות סידן. מלבד קינטיקה מהירה של אותות סידן (באלפיות שני), הדמיה תא חי היא שיטה טובה יותר ללימודי מידור סלולארי של איתות סידן בתוך תא בודד 12. ניתן לחשב ריכוז יוני הסידן המוחלט על ידי קביעת הקרינה המינימלית ומקסימלי של ind סידןicator על ידי הוספת chelator סידן וpermeabilizing התאים, בהתאמה, כפי שתואר על ידי et al Grynkiewicz. 11.

השימוש בזרימת cytometry למדוד אותות סידן פותחה לראשונה בשנת 1980 בתאים חיסוניים שבו את ההזדמנות כדי למדוד פרמטרים מרובים, כגון שלמות קרום והפרדה של אוכלוסיית תאים, ואת הדרישה של תאים בתרחיף בשילוב עם הפיתוח של אורך גל יחיד מדדי סידן עשויות cytometry זרימת שיטה אידיאלית וconvenientdetection 13-15. בתאים חסיד, הדמיה תא חי מספקת את רוב המידע על איתות סידן, הכי חשוב קינטיקה, אבל דורשת התקנה מסובכת הכוללת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מערכת זלוף, תחזוקה של הסביבה התאית, כגון טמפרטורה, ותוכנת מיקרוסקופ מיוחדת לרכישה וניתוח נתונים. שיטות חלופיות כגון קורא microplate הקרינה או Pharmacolאמצעי ogical באמצעות שימוש בchelators סידן הוא שאין במונחים של מידע שנצבר. Cytometry זרימה הופכת שימוש נרחב יותר כדי לפקח על סידן cytosolic בתאים חסיד אם כי, ברוב המכריע של מחקרים, נקודת סיום מדידות מתבצעות רק. תוך שימוש בשיטה פותחה בתחילה על ידי אל גרגלי ואח. בתאי B של מערכת חיסון 16, שינויים בריכוז סידן חופשי cytosolic ידי cytometry זרימה עם קינטיקה בזמן אמת וניטור עוצמת הקרינה בתאים בודדים מאוכלוסיית מדגם נמדדו בהצלחה בתאי האפיתל סרטן ותא גזע סרטני כלאי 17. שיטה זו הותאמה נוספת לשימוש בתאי אפיתל חסיד, שקשה לטעון עם אינדיקטורים סידן 18.

כאן, באמצעות שורת תאי אפיתל הונצחה חסיד נגזרת ממגזר S1 של אבובית הפרוקסימלי כליות חולדה (WKPT-0293 Cl.2) 19, אנו מתארים מותאם מ 'פשוטיםethod למדידת שינויים בריכוז סידן cytosolic ידי cytometry זרימה. מאחר ורבים מתאים אפיתל בעלי מספר המובילים האורגניים לתרכובות אניוני, טעינה של תאים עם מחוון סידן יכולה להוכיח להיות אתגר. כדי למנוע הזרימה של אינדיקטורים סידן, probenecid, המעכב הטיפוסי של מובילי אניון אורגניים ופותח במקור כדי להקטין את הפרשת כליות של פניצילין 20, מיושם בו זמנית במדיום הדגירה. התאים נשמרים בmonolayers לטעינת מחוון סידן, הביאו לאותות השעיה וסידן יכולים להתגלות מייד לאחר בנוסף מתחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים ופתרונות

  1. הכן הפתרון של האנק שונה המאוזן מלח (HBSS) (מ"מ: 136.9 NaCl, KCl 5.37, 0.34 Na 2 4 HPO, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17 NaHCO 3, pH 7.2, לא פנול אדום). חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הפוך 1.5 M CaCl 2 ו 2 M 4 חומצה (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7.2) פתרונות מניות באמצעות מים מזוקקים.
  3. הכן פתרון 250 מניות מ"מ של probenecid. לצורת החומצה החופשית (המכונה לעתים קרובות במים מסיסים), לפזר אבקת probenecid ב 1 N NaOH, למלא עד שלושה רבעים מהנפח הסופי עם מים מזוקקים ולכייל לאט pH 7.4 עם 1 N HCl. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. לפזר צבע קרום ניאון סידן חדיר מחייב בsulfoxide דימתיל נטול מים (DMSO) לריכוז מניות של 1 מ"מ. חנות ב -20 ° C בחושך.
  5. לפני כל ניסוי, טרי להכין H המכיל probenecidBSS שטף חיץ (PHF) על ידי שילוב של שינוי HBSS עם (בריכוזים סופיים) 1.5 מ"מ CaCl 2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.2, 5% בסרום שור עוברי, 2 probenecid מ"מ, ו5.55 גלוקוז מ"מ. חם 37 מעלות צלזיוס.

תרבות 2. תא

  1. תאי צלחת 2.5 x 10 5 כליות הפרוקסימלי אבובית (WKPT-0293 Cl.2) לכל טוב של צלחת 6 צלחת גם או 35 מ"מ במדיום התרבות הסטנדרטי ולגדול במשך 2 ימים להגיע confluency של כ -70%.

טעינת צבע 3. סיד

  1. לכל מנה טובה או, לערבב מדיום תרבות מיליליטר 1 המכיל 5% בסרום שור עוברי, צבע סיד חדיר 4 תאי מיקרומטר מחייב ו -2 probenecid מ"מ.
  2. החלף את התרבות בינונית עם תערובת צבע טעינת 1 מיליליטר בכל טוב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחממה humidified עם 5% CO 2. מכסה את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של מחוון הניאון.

4. הכנת CeLLS לcytometry הזרימה

  1. פתרון חומצת טריפסין-ethylenediaminetetraacetic 0.05% חמים (EDTA) עד 37 מעלות צלזיוס.
  2. פתרון טעינת צבע סידן לשאוב מכל טוב ולהוסיף טריפסין 1 מיליליטר לאורך הקיר גם.
  3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד שכל התאים מנותקים.
  4. העברת תאי צינור 1.5 מיליליטר וכדור על ידי צנטריפוגה בmicrocentrifuge ב 10,000 גרם במשך דקות 1.
  5. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה.
  6. שטוף תאים על ידי הוספת חיץ PHF 1 מ"ל וגלול על ידי pipetting למעלה ולמטה.
  7. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 10,000 גרם במשך דקות 1.
  8. חזור על שלבים 4.6. ו4.7. עוד שתי פעמים.
  9. Resuspend תאים בנפח סופי של 500 חיץ PHF μl ולהשתמש בתאים לניסויים בשעה 1.
  10. אופציונליים: תאי ספירה כדי לקבוע את ריכוז התא ולהשתמש 5 x 04-01 אוקטובר x 10 5 תאים לכל מדידה.

5. הזרימה CYTהתקנת ometer

  1. התחל cytometer הזרימה, לפתוח את מגירת fluidics ולוחץ על מתג דו-מצבי שסתום האוורור כדי להגדיל את לחץ האוויר של מיכל נדן הנוזל.
  2. "ראש" המכשיר כדי להסיר בועות אוויר המתגורר פוטנציאליות מתוך הצינורות הפנימיים ותא הזרימה.
  3. בתוכנת cytometry זרימה, שני חלונות עלילת נקודה פתוחים.
    1. עלילת הנקודה הראשונה דורשת קדימה אור מפוזר (FSC) עבור פרמטר X ואור בצד מפוזר (SSC) לפרמטר Y כדי לשלוט על האיכות של התאים בתוך המדגם באמצעות גודלם והגרעיניות שלהם, בהתאמה.
    2. עלילת הנקודה השנייה מודדת את עוצמת הקרינה של הצבע-קשור סידן. בחר את ערוץ גילוי הקרינה המתאים לפרמטר Y באמצעות סולם וזמן לוגריתמים בשניות עבור פרמטר X בקנה מידה ליניארי.
  4. הגדר את קצב הזרימה ל" גבוה ".

6. cytometry הזרימה Measurement

  1. לבצע את המדידות בRT. בcytometry זרימת צינור דגימה (11.5 x 75 מ"מ), להוסיף למאגר PHF 480 μl.
  2. הוסף השעיה תא 20 μl בקצרה מערבולת לערבב.
  3. הזז את זרוע תמיכת צינור בצד ולמקם את צינור הדגימה מעל צינור הזרקת מדגם עד חותם חזק נוצר. החזר את זרוע תמיכת צינור לעמדה המקורית שלו במרכז.
  4. לייעל מדידה על ידי התאמת ערוץ הקרינה כזו שעוצמת הקרינה הממוצעת של המדגם היא בכ -10 2 על ציר y. לשמור ולהשתמש בניסויים הבאים.
  5. כדי להתחיל ניסוי, חזור על שלבים 6.1-6.3.
  6. הקרינה בסיס שיא 50 שניות.
  7. השהה מדידה, להסיר את צינור המדגם, להוסיף מתחם של עניין, בקצרה מערבולת ולחזור לצינור הזרקת מדגם. צעד זה לא אמור לקחת יותר מ -15 שניות.
  8. קורות חיים מדידה ולהמשיך לסך כולל של 204.8 שניות.
  9. השתמש i סידןonophore, כגון ionomycin (10 מיקרומטר), וchelator סידן, כגון חומצת tetraacetic אתילן גליקול (EGTA), MnCl 2 או CoCl 2 (2 מ"מ), לבקרות חיוביות ושליליות, בהתאמה.

ניתוח 7. נתונים

  1. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת cytometry הזרימה ייעודית לניתוח לא מקוון, כגון WinMDI (ממשק המסמך מרובה של Windows עבור cytometry הזרימה), חבילת תוכנה חופשית שפותחה על ידי ג 'טרוטר בסקריפס המכון, מתקן cytometry הזרימה Core.
  2. פתח עלילת נקודה עם פרמטרים SSC וFSC.
  3. בחר את האזור של תאים לניתוח שימוש באפשרות "האזורים" (לחץ לחיצה ימנית על התמונה) שלא לכלול תאים מתים או פסולת תא שנמצאה בפינה השמאלית התחתונה מניתוח נתונים (איור 1).
  4. ניתוח Quadrant (איור 2)
    1. פתח עלילת צפיפות עם זמן על ציר X ועוצמת הקרינה על ציר y. להשתמש בכל האירועים.
    2. שלנודואר באותו האזור gating כמו ב7.3.
    3. לכמת את הנתונים על-ידי שימוש באפשרות "Quadrant".
    4. התאם את המפרידים הרבע כך הקו האנכי ממוקם בזמן בנוסף מתחם והקו האופקי ממוקם במרכזה של הקרינה הבסיסית בבקרה. ודא שהמיקום של מפרידי רבע שווה בכל הדגימות.
    5. אחוז התאים בכל רבע מוצג בכל פינה (איור 2). להשוות ברבע הימני העליון (UR) בין דגימות.
  5. ניתוח היסטוגרמה (איור 3)
    1. פתח את נתוני בקרה בחלון היסטוגרמה עם עוצמת הקרינה על ציר ה- x ואירועים על ציר y. להשתמש בכל האירועים.
    2. לסקירה ציורית, להוסיף את נתוני הבדיקה להשוואה לעלילת השליטה כחלקות כיסוי (ללכת קובץ → פתח קובץ → כיסוי → בחר קובץ).
    3. ניתוח כמותי, היסטוגרמה אחת לנצחיש להשתמש Dows. שער אוכלוסיית התא באמצעות אזור R1 מצעד 7.3.
    4. בשליטה שאינו מטופלים, להשתמש בפונקציית הסמן ("מרקרים") כדי לסמן את האזור לניתוח מתחיל מנקודת האמצע בין המינימום והקרינה המרבית של שיא השליטה ומסתיים בעוצמת הקרינה המרבית. אחוז התאים באזור זה מחושב.
    5. אחזור נתונים מחלון הסטטיסטיקה. חזור לנותר קבצי נתונים תוך שימוש באותו האזור המסומן לניתוח.
  6. ניתוח עוצמת הקרינה (איור 4)
    1. פתח עלילת נקודה עם זמן על ציר X ועוצמת הקרינה על ציר y. להשתמש בכל האירועים.
    2. אפשר "קינטיקס Mode" ו- "Overlay קינטיקס קו". קו כחול יופיע בעלילת הנקודה המייצגת את עוצמת הקרינה הממוצעת.
    3. לכמת את זרימת סידן היחסית על ידי יצירת אזורים מלבניים מרובים. כל אזור צריך להיות awidth של כ "50", שהוא שווה ערך ל "10 שניות". להגדיר עד 15 אזורים מלבניים.
    4. אחזר כימות מחלון הסטטיסטיקה ולהעתיק לגיליון אלקטרוני.
    5. השתמש בנתוני y-ממוצע לניתוח. לחשב את הממוצע של R2 לR6, שהוא שווה ערך ל20-50 שניות. זהו הערך הבסיסי.
    6. בחר מרווח זמן מתאים לניתוח זרימת סידן (תלוי בהופעה, משך ועוצמה).
    7. לחשב את אותות סידן מכל אזור בתוך מרווח זמן יחסי זה לערך הבסיס הממוצע, כלומר, אות הקרינה לפני בנוסף מתחם, אשר נקבע על 100%. לקבוע את התוחלת וסטיית תקן של האזורים לפרסם בנוסף מתחם; זה אות סידן הממוצעת שמעוררת את המתחם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להגדיל סידן cytosolic, שתי תרכובות תרופתיות יושמו תאי כליות הפרוקסימלי אבובית (WKPT-0293 Cl.2) עמוסים צבע סיד חדיר תא מחייב, Fluo-3-AM. דגימות בקרת Nontreated הועמסו עם צבע מחייב סידן בנוכחות probenecid והיו מעורבות אך ללא תוספת של כל תרכובות. Thapsigargin (TG) הוא מעכב קלאסי של משאבת SERCA המובילה לזליגה החוצה של חדר המיון, וכתוצאה מכך סידן cytosolic מוגבר. בלוקים Tunicamycin (TUN) N-glycosylation של חלבונים מובילים להפעלה של תגובת החלבון המקופלת אלא גם מגביר סידן cytosolic 18,21. כביקורת חיובית, ionomycin (IONO), ionophore סידן מה שהופך את הממברנה חדירה לסידן תאי, היה בשימוש. לניתוח, אוכלוסיית התאים הייתה מגודרת על ידי בחירת אזור בעלילת נקודת SSC / FSC (R1 באיור 1). עלילת צפיפות לעוצמת הקרינה לעומת הזמן נוצרה עבור כל קובץ נתונים. על ידי שימוש בפונקציה רבע, עלילת הנקודה הופרדה לארבעה אזורים המייצגים Fluo-3 עוצמת הקרינה לפני ואחרי בנוסף מתחם ומעל ומתחת לקרינה בנקודת ההתחלה. כימות כאחוז מאוכלוסיית תא מגודרת בכל רבע מאפשרת קביעת ריכוז סידן cytosolic המוגבר. בדוגמא זו, 3 מיקרומטר TG גורם לעלייה באחוז התאים ברבע הימני העליון מצביע על כך שאות סידן הוצמחה. אחוז התאים מגביר מ42.8% בשליטה ל51.3% (1.20 לקפל) בתאי TG טופל. באופן דומה, 6 TUN מיקרומטר מרחיב את אחוז התאים עם עוצמת הקרינה סידן מוגברת ל49.9% (1.17 לקפל). יישום של 10 מיקרומטר IONO הביא 65.5% (1.53 לקפל) של תאים ברבע הימני העליון (איור 2). ניתוח ההיסטוגרמה הביא 1.41 פי, 1.36 לקפל ו2.11 לקפל על ידי TG, TUN וIONO, בהתאמה (איור 3) (לסטטיסטיקה, ראה <sup> 18). לבסוף, שימוש במצב ניתוח האזור מרובה, TG, TUN וIONO גרמו 1.55 פי, 1.29 לקפל ו4.54 עליות של פי אות סידן על שליטה, בהתאמה (איור 4).

מצב הניתוח רגיש ביותר היה הניתוח באזור מרובה. בניגוד לרבע ומצבי ניתוח ההיסטוגרמה, שבו חלוקת אוכלוסיית התאים היא לכמת, מצב ניתוח האזור מרובה מכמת את השינוי באות ניאון מכלל אוכלוסיית התאים. הפער הגדול ביותר בתוצאות ממצבי ניתוח שונים היה לionomycin שנע בין עלייה של פי 1.53 על שליטה מהניתוח ברבע ל4.54 פי מניתוח האזור מרובה. התרכובות שנבדקו ואינן מראות הבדלים הללו. עם זאת, בכל מצבי הניתוח, המידה של אות סידן עוררה נשארה אותו הדבר אם כי הערכים מוחלטים שונות, כלומר, היה לו ההשפעה הגדולה ביותר IONO אחרי TG ולאחר מכן TUN. יישום של TG, TUN או IONO תוצאות בשינויים קבועים בסידן cytosolic. כדי לקבוע אם אותות פיסיולוגיים סידן, שהן חולפות, ניתן למדוד באמצעות שיטה זו, ATP היה מוחל על תאי Cl.2 WKPT-0293. ATP עורר אות סידן מהירה וחולפת, שלא ניתן היה נרשמה בשלמותו על ידי הזרימה cytometry שיטה. ריכוזי ATP ב20-100 מיקרומטר היו קשה לזהות ולכן הריכוז הופחת ל "להאט" אותות סידן. כפי שניתן לראות בתרשים 5, שינוי בסידן cytosolic ניתן היה למדוד לאחר תוספת של 5 ATP מיקרומטר. ובכל זאת, השיא של שינוי הקרינה לא נרשם. שימוש בניתוח ברבע (איור 5) וניתוח ההיסטוגרמה מצבים (איור 5 ג), אין הבדל באותות סידן בATP ניתן היה לזהות בשל האופי הארעי של אות סידן. עם זאת, עם חלקים נבחרים של העקבות, rectangula מרובהמצב ניתוח אזור r נרשם גידול של פי 1.85 באות סידן מייד לאחר חזר מדידה (איור 5 א).

איור 1
איור 1. SSC לעומת עלילת נקודת FSC. היושרה של אוכלוסיית התאים נבחנת באמצעות פיזור בצד (SSC) ופיזור קדימה (FSC). אזור נבחר (R1) לניתוח נוסף. תאים מתים ופסולת תא, שצמצמו פיזור אור, אינם נכללים. עלילת נקודת נציג מוצגת.

איור 2
ניתוח Quadrant איור 2.. הקרינה Baseline של סידן מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע נמדדה במשך 50 שניות. מדידה הופסקה, מתחם או דיluent נוספה, vortexed לערבב ומדידה התחדשה מייד לסך כולל של 204.8 שניות. כימות בוצע באמצעות ניתוח ברבע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
ניתוח היסטוגרמה איור 3.. עלילת היסטוגרמה של סידן מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע שטופלו בTG, TUN או IONO. שימוש בפונקציית הסמן, אחוז התאים מגודר עם עוצמת הקרינה צבע גבוה של סידן מחייבת היה לכמת ידי מיקום הנקודה של סמן ההתחלה בשיא של עקומת השליטה ומסתיים בקרינה המרבית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בlargגרסה אה של נתון זה.

איור 4
איור 4. ניתוח אזור מרובה. הקרינה Baseline של סידן מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע נמדדה במשך 50 שניות. מדידה הופסקה, מתחם או מדללים נוספו, vortexed לערבב ומדידה התחדשה מייד לסך כולל של 204.8 שניות. כימות בוצע באמצעות ניתוח אזור מלבני מרובה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור ניתוח 5. של אותות סידן מושרה ATP. o הקרינה Baselineסידן ו מחייב WKPT-0293 תאי Cl.2 טעון צבע נמדד במשך 50 שניות. מדידה הופסקה, 5 ATP מיקרומטר נוספה, vortexed לערבב ומדידה התחדשה מייד לסך כולל של 204.8 שניות. הנתונים היה לכמת באמצעות ניתוח מרובה מלבני אזור (), ניתוח ברבע (ב) או ניתוח היסטוגרמה (C). לניתוח האזור מרובה, רק אות סידן החולפת נותחה. נתונים או ניתוח מn נציג = 3 -. 7 מוצגים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

סידן הוא אירוע מרכזי בתהליכים תאיים רבים מתנהגים כמו מולקולת איתות השליח שנייה וגם כאמצעי לתקשורת בין ER ומיטוכונדריה. היכולת למדוד שינויים בריכוזי סידן cytosolic חופשיים היא טכניקה שימושית שיכול לחול על כל תחומי ביולוגיה של תא. ישנן שיטות שונות לזיהוי אותות סידן cytosolic. קלסי, אותות ממחוון סידן ratiometric, כגון פורע-2, נמצאים במעקב בתאים חיים באמצעות התקנת הדמיה הקרינה וריכוזי סידן מוחלטים יכול לנבוע מקביעת עוצמות הקרינה מינימליות ומקסימלי. עם זאת, טכניקה זו דורשת ציוד מיוחד, כגון מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הדמיה תא חי להגדיר ותוכנת ניתוח. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה לזיהוי סידן בcytosol של תאי האפיתל חסיד באמצעות cytometry זרימה, שהוא נגיש לרוב המעבדות.

Epithelia נמצא בת.ד.ssession של מערך של מובילים אחראים על ההעברה של מטבוליטים, xenobiotics ותרופות. חשיבות מיוחדת הוא superfamily SLC22A, שאליו מובילי קטיון האורגני ואניון האורגני שייכים 22, ואת קלטת ATP מחייבת superfamily (ATP), אשר מונתה התנגדות multidrug חלבוני ABCB1 והתנגדות multidrug גליקופרוטאין-P (MRPs) בין חבריה 23 . ניסויים ראשוניים באמצעות כליות חולדה שורת תאי אבובית הפרוקסימלי WKPT-0293 Cl.2 בוצעו כמתואר בעיתון על ידי אל גרגלי ואח. 16. התאים הוכנסו להשעיה ועמוסה Fluo-3 בבוקר. עם זאת, רק שינוי צנוע נצפה עם ionomycin 10 מיקרומטר (38.14% לעומת 50.95% בשליטה על ידי ניתוח ברבע או 1.78 לקפל על ידי ניתוח אזור מרובה). חוקרים שערנו כי מובילי אפיתל היו אחראים לעניי הטעינה של התאים עם Fluo-3 בבוקר. כדי לעקוף את הבעיה, probenecid זה וPSC833, מעכבי אורגנייםמובילי Nion וP-גליקופרוטאין ההתנגדות מרובה-בהתאמה, יושמו בו זמנית עם סידן מחייב צבע לmonolayers תא. Probenecid השתפר סידן מחייב טעינת צבע, כפי שצוין על ידי עלייה בעוצמת הקרינה בנקודת ההתחלה, ואילו PSC833 אין השפעה, שעומדת בניגוד לדוח קודם בתאים שחלה של אוגר הסיני 24. הבדל זה כנראה טמון ברמות של ABCB1 בשורות תאים השונים; שורת תאי Cl.2 WKPT-0293 נמלי רמה נמוכה אנדוגני של ABCB1, שיכול להיגרם על ידי חומרים רעילים, כגון מתכות רעילות 25,26. השימוש בprobenecid לשפר טעינת צבע סידן יכול להתארך עד סוגי תאים אחרים שמציגים מערכות תחבורת probenecid רגיש, כגון תאים של מערכת העצבים, מחסום דם-מוח ואת הכבד, שבו איתות סידן עשויה לשחק תפקיד באיתות תאית מסלולים.

זיהוי קל של סידן מחייב לFluo-3 שקרים בrequirement אחד בלבד גל עירור (506 ננומטר) ואורך גל אחד פליטה (525 ננומטר). עם זאת, נתונים שנוצרו עם סידן אורך גל יחיד מחייב צבעים, כמו צבע שאינה ratiometric, ניתן להשתמש רק לכמת עליות יחסי בסידן cytosolic על בקרות שאינן מטופלים. כדי לקבוע ריכוזי סידן מוחלטים, צבע ratiometric נחוץ משום שינוי רפאים מתרחש לאחר סידן מחייב שמאפשר לתיקון של טעינת צבע לא שוויונית והלבנה. צבע ratiometric הודו-1 כבר נעשה שימוש בזיהוי של גיוס סידן בתאים של מערכת חיסון על ידי cytometry זרימת 27,28 אך עד כה, זה לא בוצע בתאי האפיתל. שימוש בספקטרום הפליטה של שתי הודו-1 UV להתרגש (ננומטר 400 כאשר סידן קשור ו475 ננומטר כאשר סידן חופשי) ניתן לקבוע, שריכוז יוני הסידן cytosolic המוחלט כפי שתואר על ידי et al Grynkiewicz. 11.

נתוני הדוגמא שלנו מועסקים תרכובות תרופתיות שגורמות apשינוי ermanent בסידן cytosolic. אותות סידן פיסיולוגיים הם בעוצמה נמוכה, להציג קינטיקה מהירה וחולפים, וכך נשאלים השאלה, אם cytometry זרימת השיטה היא רגישה מספיק כדי לזהות אותות סידן פיסיולוגיים. ניסויים עם ATP בוצעו עם קו WKPT-0293 Cl.2 התא, אוצרת בחובה קולטנים purinergic כפי שהודגם על ידי אות מוגברת בסידן על יישום של ה- ATP (שנמדדה על ידי הדמיה תא חי). באמצעות cytometer הזרימה, סידן cytosolic מוגבר יכול להיבחן עם 1-100 ATP מיקרומטר, אך טבעה המהיר של האות בשילוב עם העיכוב בחידוש מדידה לאחר תוספת תרכובת המשמעות היא שרק חלק של האות יכול להיות מוקלטת. כך חסרון עיקרי של הזרימה cytometry השיטה היא יכולתה המוגבלת להקליט מהירות (<10 שניות) ואותות סידן חולפים; ולא בשיטה מתאימה יותר לגירויים שיוצרים אותות איטיים חולפים (> 10 שניות) או calc הגבוה מתמידאותות ium. מגבלות אלו עשויות לעקוף על ידי הפחתת ריכוז ממריץ או על ידי יישום מעכבי ספיגה חוזרת של סידן למנגנונים כדי לשמור על סידן שוחרר בcytosol אבל זהירות יש לנקוט כדי לבחור ריכוז מעכב שלא להגדיל סידן כשלעצמה cytosolic.

המידע שנרכש על ידי הדמיה תא חי וcytometry זרימה היא שונות לגמרי. עם הדמיה תא חי, ברזולוציה הגבוהה משמעות הדבר היא ששינויים המרחביים בסידן ניתן למדוד על ידי בחירת אזורים תאיים של תאים בודדים להדמיה. יתר על כן, אותות הקרינה נרכשים ללא הפסקה בכל 1 - שניות 2 ולכן ניתן להקליט אותות סידן מהירים. בניגוד לכך, cytometry זרימה מתאים יותר לאותות סידן לאורך זמן איטיים יותר וארוכים ומודד אותות סידן מאוכלוסיית תא כולו. רק שינויים יחסי באותות סידן ניתן לכמת עם cytometry זרימת השיטה. אבל, יש לו את הזרימה cytometry שיטת מספר advanTages על הדמיה תא חי קונבנציונלית: 1) הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות (גירוי ומעכבים של איתות סידן) יכול להתבצע; 2) מומחיות הדמיה ספציפית אינה נדרשת; 3) טכנאי מחקר יכולים לבצע מדידות; 4) מעבדות קליניות ולא-קליניות שאין לי האמצעים לבצע הדמיה ברזולוציה גבוהה ומדידות סידן ratiometric יכולה לחקור איתות סידן. יחדיו, cytometry זרימת השיטה שימושית אם החוקר בתחילה חפץ להקים תפקיד לסידן ויכול בקלות ליישם מעכבים לקבוע מסלולי איתות במורד זרם, ואילו הייתה נדרשת הדמיה תא חי כדי לאפיין את אות סידן (לדוגמא., קינטיקה , עוצמה, שינויים המרחביים) בפירוט נוסף.

לסיכום, אנו מתארים שיטה מהירה, פשוטה ורגישה לזיהוי של שינויים יחסי בזמן אמת בסידן cytosolic בקשה לעומס בכליות אפיתל חסידתאים, שהובאו להשעיה. לנסיינים ללא גישה לcytometry זרימה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות לspectrofluorimeter עם ההשעיה תא קובט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

מחקר במעבדות ממומן על ידי קרן פריץ-בנדר, מינכן, גרמניה (לTD) ואוניברסיטה וויטן / מענק מחקר הפנימי Herdecke (לW.-KL). ברצוננו להודות לפרופ 'ד"ר ד"ר פרנק Thévenod (מכון לפיסיולוגיה, פתופיזיולוגיה וטוקסיקולוגיה, האוניברסיטה וויטן / Herdecke) להצעות מועילות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluo-3, AM Invitrogen F-1241  Cell permeable
Probenecid Sigma-Aldrich P-8761 Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH
0.05% Trypsin-EDTA (1X) Invitrogen 25300-062
Ionomycin Sigma-Aldrich I9657
Thapsigargin Tocris Bioscience 1138
Tunicamycin Sigma-Aldrich T7765
FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software Becton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) Joe Trotter, The Scripps Institute Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.
WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
  2. Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
  4. Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
  5. Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
  6. Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
  7. Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. Mitochondrial calcium uptake. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).
  8. Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
  9. Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
  10. Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
  11. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
  12. Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
  13. Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
  14. June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
  15. Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
  16. Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
  17. Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
  18. Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
  19. Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
  20. Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
  21. Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
  22. Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
  23. Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
  24. Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
  25. Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
  26. Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
  27. Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
  28. Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).

Tags

ביולוגיה של תא גיליון 92 כליות FACS שליח שני אבובית הפרוקסימלי מדדי סידן probenecid reticulum endoplasmic ionomycin
מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic… More

Lee, W. K., Dittmar, T. Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (92), e51857, doi:10.3791/51857 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter