Summary
O cálcio está envolvido em inúmeras vias de sinalização fisiológicos e fisiopatológicos. Imagem de células vivas requer equipamento especializado e pode ser demorado. Um método rápido, simples usando um citômetro de fluxo para determinar mudanças relativas de cálcio citosólico em células epiteliais aderentes trazidos para suspensão foi otimizado.
Introduction
O cálcio é um importante segundo mensageiro responsáveis pela transmissão de sinais fisiológicos e patofisiológicos celular 1. Concentrações citosólicas de cálcio são mantidos baixos por meio da atividade de bombas de cálcio e trocadores de cálcio. A / ATPase de cálcio do retículo endoplasmático sarcoplasmático (SERCA) preenche o retículo endoplasmático (ER) loja de cálcio como parte de um sistema de "vazamento de bomba", enquanto o cálcio ATPase da membrana plasmática (PMCA) expulsa o cálcio para o compartimento extracelular, tanto em maneiras dependentes de ATP 2. Mensageiros fisiológicas, tais como hormonas ou neurotransmissores, transmitem os seus sinais através de receptores acoplados à proteína G, a activação de fosfolipase C, que provoca a hidrólise de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) na membrana de plasma para gerar diacilglicerol e trifosfato de inositol (IP3) 3. Enquanto diacilglicerol permanece na membrana plasmática, IP3 difunde-se para o citosol e liga-se ao receptor de IP3s (IP3Rs), que são activadas ligando os canais de cálcio, encontrados na membrana do RE e do cálcio é libertado a partir da loja ER luminal culminando com um aumento nas concentrações de cálcio citosólicos 4. Uma via alternativa para o cálcio para atingir o citossol é através de canais de cálcio e permutadores presentes na membrana plasmática. Crosstalk entre esses dois compartimentos foram descritos: liberação de cálcio de cálcio induzida (CICV), onde o cálcio extracelular induz liberação de cálcio das lojas ER 5 e loja operada entrada de cálcio (SOCE), onde o esvaziamento das lojas ER é detectada por STIM e provoca a abertura de Orai canais de cálcio na membrana plasmática para promover o reenchimento das lojas de 6 ER.
Sob condições fisiopatológicas, a resposta celular de cálcio é desregulados e citosólicas de cálcio aumenta na ausência de estimuladores fisiológicos 1. A resposta de cálcio pode ser afectada de várias maneiras: cálcio prolongadasinal, a remoção retardada de cálcio a partir do citosol, depleção das reservas de cálcio ou mudanças localizadas em cálcio. Além disso, as mitocôndrias assumir um papel central na memória intermédia de libertação de cálcio e 7. Prolongado e / ou aumento de cálcio citosólico supramáxima leva à morte celular. Na verdade, o cálcio é mais frequentemente do que não envolvido na resposta fisiopatológica celular e é um evento chave em uma ampla gama de doenças, tais como doenças neurodegenerativas, doenças cardíacas, câncer, doenças ósseas e doenças renais, que estão principalmente associados com a morte celular e perda ou alteração de órgão ou tecido função 8-10. Além disso, a perturbação de sinais de cálcio tem sido associada a adaptação celular e alterações em funções celulares e as respostas.
Tradicionalmente, os sinais de cálcio são medidos com um indicador de cálcio fluorescente carregada negativamente que é carregado em células em uma forma de éster de acetoximetilo permeável célula (AM). Uma vez clivada por Esteras celulareses, os indicadores fluorescentes permanecer dentro do compartimento intracelular e aumentam em intensidade de fluorescência quando o cálcio é ligado. O indicador de cálcio mais conhecidos e utilizados é o raciométrica Fura-2 desenvolvido por Roger Tsien e colegas 11. Indicadores de cálcio com afinidades diferentes para permitir diferentes pools de cálcio de cálcio a ser monitorizado. Métodos de detecção incluem imagens de células vivas, leitor de microplacas de fluorescência e citometria de fluxo. A cinética relativamente rápida de sinais de cálcio (geralmente dentro de alguns segundos a minutos) faz de células vivas imaginando o melhor método para a obtenção de mais informações sobre as características do sinal de cálcio. Além dos cinética rápida de sinais de cálcio (em milissegundos), imagens de células vivas é um método melhor para estudar compartimentalização celular da sinalização de cálcio dentro de uma única célula 12. As concentrações de cálcio absolutos pode ser calculada através da determinação da fluorescência mínima e máxima da ind cálcioicator pela adição de um quelante de cálcio e de permeabilização das células, respectivamente, como descrito por Grynkiewicz et ai. 11.
A utilização de citometria de fluxo para medir sinais de cálcio foi desenvolvido pela primeira vez na década de 1980 em células imunológicas onde a oportunidade para medir vários parâmetros, tais como a integridade da membrana e separação de população de células, e o requisito de células em suspensão combinada com o desenvolvimento de um único comprimento de onda indicadores de cálcio feita de citometria de fluxo de um método ideal e convenientdetection 13-15. Em células aderentes, imagens de células vivas fornece a maior parte da informação sobre a sinalização de cálcio, mais importante, a cinética, mas requer uma instalação complicada, compreendendo um microscópio de fluorescência, um sistema de perfusão, a manutenção do ambiente celular, tais como a temperatura, e microscópio software especializado para adquirir e análise de dados. Métodos alternativos, tais como um leitor de microplacas de fluorescência ou farmacolmeios ogical através do uso de quelantes de cálcio são incomparáveis em termos de informação adquirida. Citometria de fluxo é cada vez mais amplamente utilizado para monitorizar o cálcio citosólico em células aderentes, embora, na maioria dos estudos, apenas ponto de terminar as medições sejam efectuadas. Utilizando o método desenvolvido inicialmente por Gergely et al., Em células imunológicas B 16, alterações na concentração de cálcio livre citosólico por citometria de fluxo com uma cinética em tempo real e o controlo da intensidade de fluorescência em células individuais a partir de uma população de amostra foram medidos com sucesso em células epiteliais de cancro e de células-tronco do câncer híbridos 17. Este método foi adicionalmente adaptado para utilização em células epiteliais aderentes, que são difíceis de carregar com os indicadores de cálcio 18.
Aqui, utilizando uma linha de células epiteliais aderentes imortalizada derivada do segmento S1 do túbulo proximal do rim de rato (WKPT-CL.2 0293) 19, descrevemos um m simplificada optimizadoétodo para a medição de alterações na concentração de cálcio citosólico, por citometria de fluxo. Uma vez que muitas células epiteliais possuem um número de transportadores orgânicos para compostos aniónicos, a carga de células com um indicador de cálcio podem provar ser um desafio. Para evitar o efluxo de indicadores de cálcio, probenecida, o inibidor prototípico de transportadores de aniões orgânicos e originalmente desenvolvido para diminuir a excreção renal de penicilina 20, é aplicado simultaneamente no meio de incubação. As células são mantidas em monocamadas de carga indicador de cálcio, apresentado em sinais de suspensão e de cálcio podem ser detectadas imediatamente após a adição do composto.
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Protocol
1. Preparação dos Reagentes e Soluções
- Prepare uma solução de Hank equilibrada modificado sal (HBSS) (em mM: 136.9 NaCl, 5.37 KCl, 0,34 de Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, pH 7,2, sem vermelho de fenol). Armazenar a 4 ° C.
- Adicione 1,5 M de CaCl2 e 2 M de 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) (pH 7,2) soluções de reserva, utilizando água destilada.
- Prepara-se uma solução de estoque de 250 mM de probenecida. Para a forma de ácido livre (muitas vezes referida como insolúveis em água), dissolver em pó probenecida em NaOH 1 N, encher a três quartos do volume final com água destilada e, lentamente, titula-se a pH 7,4 com 1 N de HCl. Armazenar a 4 ° C.
- Dissolver membrana permeável ao cálcio fluorescente corante obrigatório em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) a uma concentração de reserva de 1 mM. Armazenar a -20 ° C no escuro.
- Antes de cada experiência, acabado de preparar-H contendo probenecidBSS de fluxo (PHF) tampão modificado pela combinação com HBSS (em concentrações finais) 1,5 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES, pH 7,2, 5% de soro fetal bovino, 2 mM de probenecida, glicose e 5,55 mM. Aquece-se até 37 ° C.
2. Cultura celular
- Placa de 2,5 x 10 5 células de rim do túbulo proximal (WKPT CL.2-0293) por poço de uma placa de 6 ou 35 milímetros bem prato em meio de cultura padrão e crescer durante 2 dias, atingindo uma confluência de aproximadamente 70%.
3. Corante de cálcio Carregando
- Para cada prato ou bem, misturar 1 ml de meio de cultura contendo 5% de soro fetal bovino, corante de cálcio permeáveis 4 uM de ligação celular e 2 mM de probenecida.
- Substituir o meio de cultura com 1 ml de mistura de corante de carga em cada poço e incubar a 37 ° C durante 30 min numa incubadora humidificada com 5% de CO 2. Cobrir a placa com uma folha de alumínio para evitar a descoloração do indicador fluorescente.
4. Preparação de Cells para Citometria de Fluxo
- Solução de tripsina a 0,05% de ácido etilenodiaminotetracético-quente (EDTA) a 37 ° C.
- Aspirar cálcio solução de corante de carga de cada poço e adicionar 1 ml de tripsina ao longo da parede do poço.
- Incubar a 37 ° C até que todas as células são separadas.
- Transferência de células para um tubo de 1,5 ml e sedimento por centrifugação numa microcentrífuga a 10000 g durante 1 min.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Lave as células adicionando tampão PHF 1 ml e ressuspender por pipetagem cima e para baixo.
- Sedimentar as células por centrifugação a 10.000 g durante 1 min.
- Repita os passos 4.6. e 4.7. mais duas vezes.
- Ressuspender as células num volume final de 500 ul de tampão de PHF e usar as células para a experimentação dentro de 1 h.
- Opcional: contagem de células para determinar a concentração de células e usar 5 x outubro 4-1 x 10 5 células por medição.
5. Fluxo CitSetup ometer
- Comece o citômetro de fluxo, abra a gaveta fluídica e virar a chave seletora de válvula de ventilação para aumentar a pressão de ar do tanque de fluido do invólucro.
- "Prime" do instrumento para remover eventuais bolhas de ar residente de dentro das câmaras de ar e câmara de fluxo.
- No software de citometria de fluxo, abrir duas janelas do gráfico de pontos.
- O primeiro gráfico de pontos requer a frente de luz difusa (FSC) para o parâmetro X e do lado da luz difusa (SSC) para o parâmetro Y para controlar para a qualidade das células no interior da amostra através do seu tamanho e da sua granularidade, respectivamente.
- O segundo gráfico de pontos mede a intensidade de fluorescência do corante ligado de cálcio. Escolha do canal de detecção de fluorescência apropriado para o parâmetro Y utilizando uma escala logarítmica e tempo em segundos para o parâmetro X em uma escala linear.
- Definir a taxa de fluxo para "alto".
6. Citometria de Fluxo MEDIÇÃO
- Execute as medições em RT. Num tubo de ensaio de citometria de fluxo (11,5 x 75 mm), adicionar 480 ul de tampão de PHF.
- Adicionar suspensão de células de 20 mL e brevemente vortex para misturar.
- Mover o braço de suporte do tubo para o lado e posicionar o tubo de amostra sobre o tubo de injecção da amostra até uma vedação hermética é formada. Retorne o braço de suporte do tubo para sua posição original centrado.
- Optimizar a medição, ajustando o canal de fluorescência de tal modo que a intensidade de fluorescência média da amostra é de aproximadamente 10 2 no eixo-y. Salvar e usar para os experimentos posteriores.
- Para iniciar um experimento, repita os passos 6.1 a 6.3.
- Fluorescência basal recorde para 50 seg.
- Pause medida, retirar o tubo de amostra, adicionar o composto de interesse, vortex brevemente e retornar ao tubo de injecção de amostra. Este passo não deve demorar mais do que 15 segundos.
- Retomar a medição e continuar para um total de 204,8 seg.
- Use um i cálcioonophore, tais como ionomicina (10 uM), e um quelante de cálcio, tal como o etileno-glicol do ácido tetra-acético (EGTA), MnCl2 ou CoCl2 (2 mM), para os controlos positivos e negativos, respectivamente.
Análise 7. Os dados
- Analisar dados usando o software de citometria de fluxo dedicado para análise off-line, como WinMDI (Windows Multiple Document Interface para Citometria de Fluxo), um pacote de software livre desenvolvido por Joe Trotter no Instituto Scripps, Citometria de Fluxo Núcleo Facility.
- Abra um gráfico de pontos com os parâmetros SSC e FSC.
- Selecione a região de células para análise utilizando a ferramenta "Regiões" (clique com o botão direito sobre a imagem) para excluir as células mortas ou restos de células encontradas no canto inferior esquerdo da análise dos dados (Figura 1).
- Análise quadrante (Figura 2)
- Abra uma densidade de trama com o tempo no eixo dos x e intensidade de fluorescência no eixo-y. Use todos os eventos.
- NosE é a mesma região gating como em 7.3.
- Quantificar os dados usando a ferramenta "Quadrante".
- Ajustar os separadores de quadrante, de modo que a linha vertical é colocado no momento da adição do composto e a linha horizontal que está colocado no centro da linha de base de fluorescência nos controlos. Certifique-se de que o posicionamento dos separadores de quadrante é igual em todas as amostras.
- A percentagem de células em cada quadrante é apresentado em cada canto (Figura 2). Compare o quadrante superior direito (UR) entre as amostras.
- Análise de histograma (Figura 3)
- Abra os dados de controlo de uma janela do histograma de intensidade de fluorescência no eixo dos x e eventos no eixo-y. Use todos os eventos.
- Para uma visão pictórica, adicione os dados de teste para ser comparado com a testemunha como parcelas de sobreposição (vá em File → Open File → Selecione o arquivo → Overlay).
- Para a análise quantitativa, único histograma ganhardows deve ser usado. Portão da população celular utilizando a região R1 do passo 7.3.
- No controlo não-tratadas, usar a função de marcador ("marcadores") para marcar a área de análise a partir do ponto médio entre o mínimo e máximo de fluorescência do pico de controlo e terminando na intensidade de fluorescência máxima. A percentagem de células nessa área é calculada.
- Recuperar os dados da janela de estatísticas. Repita o procedimento para os restantes ficheiros de dados usando a mesma área marcada para análise.
- Análise da intensidade de fluorescência (Figura 4)
- Abrir um gráfico de pontos com o tempo no eixo dos x e intensidade de fluorescência no eixo-y. Use todos os eventos.
- Ative o "Modo Kinetics" e "Overlay Kinetics Line". Uma linha azul aparecerá na trama ponto que representa a intensidade média de fluorescência.
- Quantificar o fluxo relativo de cálcio através da criação de várias regiões retangulares. Cada região deve ter awidth de cerca de "50", o que é equivalente a "10 seg". Defina até 15 regiões retangulares.
- Recuperar quantificação da janela de estatísticas e copiar em uma planilha.
- Usar os dados-y significativo para análise. Calcule a média de R2 a R6, que é equivalente a 20 a 50 seg. Este é o valor da linha de base.
- Escolha um intervalo de tempo adequado para a análise do influxo de cálcio (depende de início, duração e intensidade).
- Calcular os sinais de cálcio a partir de cada região, dentro deste intervalo de tempo em relação ao valor da linha de base média, isto é, o sinal de fluorescência antes da adição de composto, a qual é definida como 100%. Determinar a média eo desvio padrão das regiões postar além composto; este é o sinal significativo de cálcio evocado pelo composto.
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Representative Results
Para aumentar o cálcio citosólico, dois compostos farmacológicos foram aplicados a células renais do túbulo proximal (WKPT-0293 CL.2) carregadas com o corante de ligação celular permeável ao cálcio, Fluo-3-AM. Amostras de controlo não tratados foram carregadas com corante de ligação do cálcio na presença de probenecida e foram misturados, mas sem a adição de quaisquer compostos. Tapsigargina (TG) é um inibidor da bomba clássica SERCA que conduz a fugas para fora do ER e resultando em aumento de cálcio citosólico. Tunicamicina (TUN) blocos de N-glicosilação de proteínas que conduzem à activação da resposta proteína desdobrada, mas também aumenta o cálcio citosólico 18,21. Como um controlo positivo, ionomicina (IONO), fazendo um ionóforo de cálcio na membrana plasmática permeável para o cálcio extracelular, foi usado. Para a análise, a população de células foi fechado através da selecção de uma região no gráfico de pontos de SSC / FSC (R1 na Figura 1). Um gráfico de densidade para a intensidade de fluorescência em função do tempo foi criado para cada arquivo de dados. Ao utilizar a função de quadrante, o gráfico de pontos foi separada em quatro áreas representativas de Fluo-3 intensidade de fluorescência antes e depois da adição de compostos e acima e abaixo da linha de base de fluorescência. Quantificação como percentagem da população de células em cada quadrante fechado permite a determinação do aumento na concentração de cálcio citosólico. Neste exemplo, 3 uM TG provoca um aumento na percentagem de células no quadrante superior direito, indicando que um sinal de cálcio foi induzida. A percentagem de células aumenta de 42,8% no controle para 51,3% (1,20 vezes) em células TG tratados. De modo semelhante, 6 uM TUN aumenta a percentagem de células com o aumento da intensidade de fluorescência de cálcio a 49,9% (1,17 vezes). A aplicação de 10 mM IONO resultou em 65,5% (1,53 vezes) de células no quadrante superior direito (Figura 2). A análise do histograma resultou em 1,41 vezes, 1,36 vezes e 2,11 vezes por TG, TUN e IONO, respectivamente (Figura 3) (para as estatísticas, consulte <sup> 18). Finalmente, usando o modo de análise região múltipla, TG, e TUN IONO causada 1,55 vezes, 1,29 vezes e 4,54 vezes em aumentos de sinal de cálcio mais de controlo, respectivamente (Figura 4).
O modo de análise mais sensível foi a análise região múltipla. Em contraste com o quadrante e modos de análise de histograma, em que a distribuição da população de células é quantificado, o modo de análise múltipla região quantifica a mudança no sinal fluorescente a partir da população total de células. A maior discrepância nos resultados de diferentes modos de análise foi de ionomicina que variaram de 1,53 vezes maior sobre o controle da análise quadrante a 4,54 vezes a partir da análise região múltipla. Os compostos testados não apresentaram tal variação. No entanto, ao longo de todos os modos de análise, o sinal de medida de cálcio evocado permaneceu o mesmo, embora os valores absolutos diferiram, ou seja, IONO teve o maior efeito seguido por TG e, em seguida, TUN. Aplicação da TG, TUN ou IONO resulta em mudanças permanentes em cálcio citosólico. Para determinar se os sinais de cálcio fisiológicas, que são transiente, pode ser medida utilizando este método, o ATP foi aplicada às células CL.2 WKPT-0293. ATP evocado um sinal rápida e transiente de cálcio, o que não podia ser gravado na sua totalidade pelo método de citometria de fluxo. As concentrações de ATP em 20-100 uM eram difíceis de detectar, por conseguinte, a concentração foi reduzida para "retardar" os sinais de cálcio. Como mostrado na Figura 5, uma mudança em cálcio citosólico poderia ser medido após a adição de 5 uM de ATP. Ainda assim, o pico de mudança de fluorescência não foi gravado. Usando a análise de quadrante (Figura 5B) e análise de histograma (Figura 5C) modos, não houve diferença na sinais de cálcio no ATP podem ser detectadas devido à natureza transiente do sinal de cálcio. No entanto, com partes selecionadas do traçado, o caix múltiplaModo de análise região r registou um aumento de 1,85 vezes em sinal de cálcio logo após a retomada medição (Figura 5A).
Figura 1. SSC contra FSC gráfico de pontos. A integridade da população celular é avaliada através de dispersão lateral (SSC) e de dispersão frontal (FSC). Uma região é seleccionado (R1) para posterior análise. As células mortas e restos celulares, que reduziram a dispersão de luz, são excluídos. A trama representante ponto é mostrado.
Figura 2. Análise de quadrante. Fluorescência basal de WKPT-0293 células CL.2 carregado com corante ligante de cálcio foi medido por 50 sec. A medição foi interrompida, o composto ou diluent foi adicionado, vortex para misturar e medição foi retomado imediatamente para um total de 204,8 seg. A quantificação foi realizada através da análise de quadrante. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de Histograma. Histograma lote de WKPT-0293 células CL.2 carregado com corante tratados com TG, TUN ou IONO ligante de cálcio. Usando a função de marcador, a porcentagem de células fechadas com ligação de alta cálcio intensidade corante de fluorescência foi quantificada através do posicionamento do ponto de partida o marcador no pico da curva de controle e terminando na fluorescência máxima. Por favor clique aqui para ver uma largversão er desta figura.
Figura 4. Análise de múltipla região. Fluorescência basal de WKPT-0293 células CL.2 carregado com corante ligante de cálcio foi medido por 50 sec. A medição foi interrompida, foi adicionado o composto ou diluente, vortex para misturar e medição foi retomado imediatamente para um total de 204,8 seg. A quantificação foi realizada utilizando análise múltipla região retangular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Análise de sinais de cálcio induzidos por ATP. Basal de fluorescência of WKPT-0293 células CL.2 carregado com corante ligante de cálcio foi medido por 50 sec. A medição foi interrompida, 5 uM de ATP foi adicionado, vortex para misturar e medição foi retomado imediatamente para um total de 204,8 seg. Os dados foram quantificados utilizando a análise múltipla rectangular região (A), a análise de quadrante (B) ou a análise de histograma (C). Para a análise região múltipla, apenas o sinal transiente de cálcio foi analisado. Dados ou análise de n = representativos. 3 - 7 são mostrados por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O cálcio é um evento chave na múltiplos processos celulares que actuam como um segundo mensageiro molécula de sinalização e também como um meio para comunicar entre o ER e mitocôndrias. A capacidade de medir alterações nas concentrações de cálcio citosólico livre é uma técnica útil que pode ser aplicada a todas as áreas de biologia celular. Existem vários métodos para a detecção de sinais de cálcio citosólicos. Classicamente, os sinais de um indicador de cálcio raciométrica, tais como Fura-2, são monitorizados em células vivas, utilizando uma configuração de imagens de fluorescência e as concentrações absolutas de cálcio pode ser obtido a partir de determinar a intensidade mínimo e máximo de fluorescência. No entanto, esta técnica requer equipamento especializado, tal como um microscópio de fluorescência, uma imagem de células vivas e configurar o software de análise. Aqui, nós descrevemos um método simples para a detecção do cálcio no citosol de células epiteliais aderentes utilizando citometria de fluxo, que é acessível para a maioria dos laboratórios.
Os epitélios são em possession de uma variedade de transportadores responsáveis pelo transporte de metabolitos, drogas e xenobióticos. De particular importância é a superfamília SLC22A, ao qual catiões orgânicos e transportadores de aniões orgânicos pertencem 22, e a cassete (ATP) superfamília, de ligação a ATP que conta a resistência a múltiplos fármacos e proteínas ABCB1 de resistência a múltiplos fármacos de P-glicoproteína (PRM) entre os seus membros 23 . As experiências iniciais utilizando a linha de células de rim de rato túbulo proximal WKPT CL.2-0293 foram realizadas como descrito no artigo de Gergely et al., 16. As células foram postas em suspensão e carregado com Fluo-03:00. No entanto, somente uma alteração modesta foi observada com 10 pM de ionomicina (38,14% vs 50,95% no controlo por análise de quadrante ou 1,78 vezes por análise região múltipla). Nossa hipótese é que os transportadores epiteliais foram responsáveis pela má carregamento das células com Fluo-3 AM. Para contornar este problema, e PSC833 probenecida, inibidores de uma orgânicaNion transportadores e da resistência a múltiplos fármacos de P-glicoproteína, respectivamente, foram aplicados simultaneamente com a ligação do cálcio ao corante de monocamadas de células. Probenecid melhorado de cálcio de ligação de corante de carga, como indicado por um aumento na intensidade de fluorescência de linha de base, ao passo que não tinha efeito PSC833, que está em contraste com um relatório anterior, em células de ovário de hamster chinês 24. Esta diferença reside provavelmente nos níveis de ABCB1 nas diferentes linhas celulares; a linha celular CL.2 WKPT-0293 abriga um nível endógeno de baixo ABCB1, que pode ser induzido por substâncias tóxicas, tais como metais tóxicos 25,26. O uso de probenecida para melhorar cálcio corante de carga pode ser alargado a outros tipos de células que apresentam os sistemas de transporte sensíveis à probenecida, tais como células do sistema nervoso, a barreira sangue-cérebro e o fígado, onde a sinalização de cálcio pode desempenhar um papel na sinalização intracelular percursos.
A detecção fácil de cálcio de ligação para Fluo-3 reside na sua requidição de apenas um comprimento de onda de excitação (506 nm) e um comprimento de onda de emissão (525 nm). No entanto, os dados gerados com corantes de ligação único comprimento de onda de cálcio, como um corante não-raciométrica, só pode ser usado para quantificar os aumentos relativos na cálcio citosólico mais de controlos não tratados. Para determinar as concentrações absolutas de cálcio, um corante ratiometric é necessário porque uma mudança espectral ocorre depois de cálcio ligação que permite a correção de carregamento tintura desigual e branqueamento. O corante raciométrica Indo-1 tem sido usada para a detecção de mobilização de cálcio em células imunológicas por citometria de fluxo 27,28 mas, até agora, isto não tem sido realizada em células epiteliais. Usando os espectros de emissão de dois UV-excitável Indo-1 (400 nm quando cálcio ligado e 475 nm, quando livre de cálcio), as concentrações de cálcio citosólicos absolutos pode ser determinada como descrito por Grynkiewicz et ai. 11.
Nossos dados de exemplo empregues compostos farmacológicos que induzem apmudança ermanente em cálcio citosólico. Sinais fisiológicos de cálcio são de baixa intensidade, exibir cinética rápida e são transitórios, assim, fica a pergunta sobre se a citometria de fluxo método é sensível o suficiente para detectar sinais fisiológicos do cálcio. Experiências com ATP foram realizadas com a linha celular WKPT CL.2-0293, o qual contém receptores purinérgicos como demonstrado pelo sinal de cálcio aumentou aquando da aplicação de ATP (medida por imagem de células vivas). Utilizando a citometria de fluxo, aumento do cálcio citosólico podia ser observada por 1 - ATP 100 uM, mas a natureza rápida do sinal combinado com o atraso no reatamento da medição após adição composto significa que apenas uma porção do sinal pode ser gravado. Assim, uma grande desvantagem do método de citometria de fluxo é a sua capacidade limitada para gravar rápido (<10 s) e sinais transientes de cálcio; em vez do método é mais adequado para os estímulos que dão origem a mais lentos os sinais transitórios (> 10 seg) ou cale elevada persistentesinais ium. Essas limitações podem ser contornadas por reduzir a concentração estimulador ou pela aplicação de inibidores seletivos de recaptação de cálcio para os mecanismos para reter o cálcio liberado no citosol, mas o cuidado deve ser tomado para selecionar uma concentração de inibidor que não aumenta o cálcio citosólico per se.
As informações obtidas por imagens de células vivas e citometria de fluxo são bastante diferentes. Com imagem de células vivas, a alta resolução espacial significa que as alterações no cálcio pode ser medido por selecção de regiões intracelulares das células individuais para imagiologia. Além disso, os sinais de fluorescência são adquiridas sem parar a cada 1-2 segundos, portanto, sinais rápidos de cálcio pode ser gravada. Em contraste, a citometria de fluxo é mais adequado para sinais de cálcio mais lento e de longa duração e mede sinais de cálcio a partir de uma população de células inteiras. Apenas mudanças relativas de sinais de cálcio pode ser quantificada com o método de citometria de fluxo. Mas, o método de citometria de fluxo tem um número de advantagens mais de imagem de células vivas convencional: 1) rastreio de alto rendimento de compostos (estimuladores e inibidores da sinalização de cálcio) pode ser realizada; 2) Não é necessária experiência de imagem específica; 3) técnicos de investigação pode executar as medições; 4) laboratórios clínicos e não-clínicos que não têm os meios para realizar imagem de alta resolução e medições de cálcio raciométrica pode investigar a sinalização de cálcio. Tomados em conjunto, a citometria de fluxo método é útil se inicialmente o investigador pretende estabelecer um papel para o cálcio e poderia ser facilmente aplicado inibidores para determinar as vias de sinalização a montante ea jusante, enquanto que imagens de células vivas seriam necessários para caracterizar o sinal de cálcio (por ex., A cinética , a intensidade, mudanças espaciais) em mais detalhes.
Em resumo, descrevemos um método rápido, simples e sensível para a detecção em tempo real de mudanças relativas de cálcio citosólico em difícil-para-carga de rim epitelial aderentecélulas, que foram trazidos para a suspensão. Para experimentadores sem acesso a uma citometria de fluxo, este método pode ser facilmente aplicado a um espectrofluorímetro com a suspensão de células numa cuvete.
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Acknowledgments
Pesquisas nos laboratórios é financiado pela Fundação Fritz-Bender, Munique, Alemanha (para TD) e da Universidade de Witten / Herdecke bolsa de investigação interna (para W.-KL). Gostaríamos de agradecer a Prof Dr. Dr. Frank Thévenod (Instituto de Fisiologia, Fisiopatologia e Toxicologia da Universidade de Witten / Herdecke) para sugestões.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
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