Summary
Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.
Introduction
Kalsiyum hücre fizyolojik ve patofizyolojik sinyallerinin 1 aktarılmasından sorumlu önemli bir ikincil habercidir. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum pompaları ve kalsiyum değiştirgeçlerinin aktivite yoluyla düşük tutulur. Sarkoplazmik / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz'ın (SERCA) ATP'ye bağımlı şekillerde hem de plazma membran kalsiyum ATPaz'ın (PMCA) Hücre dışı bölüme kalsiyum ekstrüde ise "pompa kaçak" sisteminin bir parçası olarak endoplazmik retikulum (ER), kalsiyum deposunu doldurabilir 2. Gibi hormonlar veya sinir taşıyıcıları gibi fizyolojik haberciler, G-proteini ile bağlanmış reseptörler, diasilgliserol ve inositol trifosfat (IP3) 3 oluşturmak için, plazma membranında, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) hidrolize eden, fosfolipaz C aktivasyonu yoluyla iletir. Diaçilgliserol plazma membranında kalırken, IP3 sitozol içine girer ve IP3 reseptörüne bağlananER membran ve kalsiyum bulunan bağ kalsiyum kanallarını aktive S (IP3Rs), sitozolik kalsiyum konsantrasyonları 4 bir artışa sonuçlanan ER lümen deposundan salınır. Sitoplazmada ulaşmak için kalsiyum için alternatif bir yol, plazma membranında bulunan kalsiyum kanallarda ve değiştiricilerde geçer. Bu iki bölme arasındaki çapraz karışma tarif edilmiştir: kalsiyum kaynaklı kalsiyum dışı kalsiyum ER depolar 5 kalsiyum serbest kalmasına sebep olur salım (YÜÇAM) ve depolamak stimülasyonu tarafından algılanan ER mağaza boşaltılmasından kalsiyum girişini (Soce) çalıştırılabilir ve Orai açılmasına neden olur plazma membranında kalsiyum kanalları ER mağaza 6 yeniden dolmasını teşvik etmek.
Patofizyolojik koşullar altında, hücresel kalsiyum tepki de fizyolojik uyarıyıcıya 1 yokluğunda serbest ve sitosolik kalsiyum artar. Kalsiyum yanıtı çeşitli yollarla etkilenebilir: kalsiyum uzun sürelisinyali, sitosolden kalsiyum çıkarılmasını, kalsiyum mağazalarda veya kalsiyum lokalize değişikliklerin tükenmesi erteledi. Ayrıca, mitokondri tamponlama merkezi bir rol almak ve kalsiyum 7 serbest. Uzun süreli ve / veya supramaksimal sitosolik kalsiyum artışı hücre ölümüne sebep olur. Aslında, kalsiyum daha çok hücresel patofizyolojik yanıtta ve bu tür daha çok hücre ölümü ile ilişkili nörodejeneratif hastalık, kalp hastalığı, kanser, kemik hastalığı ve böbrek hastalığı gibi hastalıklar, geniş bir dizi önemli bir olay değildir daha kayıp veya organ veya doku işlevinin 8-10 değiştirilmesi ve. Üstelik, kalsiyum sinyallerinin pertürbasyon hücre uyarlanması ve hücresel işlevleri ve yanıtları değişikliklere bağlanmıştır.
Geleneksel olarak, kalsiyum sinyalleri hücre geçirgen asetoksimetil (AM) bir ester formunda hücrelere yüklenen bir negatif yüklü bir fluoresan kalsiyum göstergesi ile ölçülür. Bir kez hücre esteras parçalanabilenES floresan göstergeler hücre bölmesi içinde kalır ve kalsiyum bağlı olduğunda, flüoresans yoğunluğunda artış. En iyi bilinen ve kullanılan kalsiyum göstergesi rasyometrik Fura-2 Roger Tsien ve arkadaşları 11 tarafından geliştirilen. Kalsiyum için farklı afinitelerle kalsiyum göstergeleri farklı kalsiyum havuzları izlenmesine olanak tanır. Tespit yöntemleri, canlı hücre görüntüleme, floresan mikroplaka okuyucu içerir ve akış sitometresi. (Genellikle birkaç dakika için birkaç saniye içinde) kalsiyum sinyallerinin görece hızlı kinetik kalsiyum sinyalinin özellikleri hakkında en çok bilgi kazanmak için en iyi yöntem görüntüleme canlı hücre yapar. Kenara (milisaniye içinde) kalsiyum sinyallerin hızlı kinetik, canlı hücre görüntüleme tek bir hücrenin 12 içinde kalsiyum sinyal hücresel compartmentalization çalışmak için iyi bir yöntemdir. Mutlak kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum ind minimum ve maksimum floresans belirlenmesi ile hesaplanabilirGrynkievvicz et al. 11 tarafından tarif edildiği gibi, sırasıyla, bir kalsiyum tutucusunun eklenmesi ve hücrelerin geçirimli ile icator.
Kalsiyum sinyallerinin ölçülmesi için akış sitometrisi kullanımı, ilk olarak bir fırsat zar bütünlüğü ve hücre grubunun ayrılması ve tek bir dalga boyu gelişimi ile birlikte süspansiyon içinde hücrelerin gereği olarak, birden çok parametre ölçmek için burada immünolojik hücrelerde 1980'li yıllarda geliştirilen kalsiyum göstergeler bir ideal ve convenientdetection yöntemle 13-15 flow sitometri yaptı. Yapışık hücrelere, canlı hücre görüntüleme kalsiyum sinyalizasyonu, en önemlisi kinetiği hakkında en çok bilgi sağlar, ancak elde etmek için bir sıcaklık gibi bir floresan mikroskop, bir perfüzyon sistemi, hücresel çevre bakımı, oluşan karmaşık kurulum ve özel mikroskop yazılım gerektirir ve verileri analiz. Bu tür bir floresan mikroplaka okuyucu ya da Pharmacol gibi seçenek yöntemlerKalsiyum kenetleme maddelerinin kullanımı yoluyla ogical araçları elde edilen bilgilerin açısından eşsiz. Akış sitometrisi, daha yaygın olarak, çalışmaların çoğunda olsa da, ölçümler yapılmıştır sadece son-nokta yapışık hücreler sitosolik kalsiyum izlemek için kullanılabilir hale gelmektedir. Başlangıçta Gergely ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntem kullanılarak. Imünolojik B hücreleri 16, gerçek zamanlı kinetiği olan akış sitometrisi ve bir numune bir gruptan hücrelerinde floresan yoğunluğunun izlenmesi ile sitosolik serbest kalsiyum konsantrasyonunda değişiklikler başarıyla kanser epitelyal hücrelerinde ölçülmüştür ve kanser kök hücresi 17 melezler. Bu yöntem, bundan başka, kalsiyum göstergeleri 18, yükleme zordur yapışık epitel hücrelerinde, kullanım için adapte edilmiştir.
Burada, sıçan böbrek proksimal tübül (WKPT-0293 CL.2) 19 S1 kısmında elde edilen ölümsüzleştirilmiş yapışkan epitel hücre soyunu kullanarak, biz, optimize edilmiş bir basitleştirilmiş m açıklamakAkış sitometrisi ile sitosolik kalsiyum konsantrasyonundaki ^ değişikliklerin ölçülmesi için METOT. Birçok epitel hücreleri anyonik bileşikler için organik taşıyıcıların bir dizi sahip olduğu için, bir kalsiyum göstergesi ile hücrelerin yük bir meydan okuma olarak kanıtlamak olabilir. Kalsiyum göstergeleri, probenesid, penisilin 20 ekskresyonun düşürmek için geliştirilmiş başlangıçta prototipik organik anyon nakil inhibitörü ve akışını önlemek için, kuluçkalama ortamı içinde eş zamanlı olarak uygulanır. Hücreler, kalsiyum indikatör yükleme için tek tabaka halinde tutulan bir bileşik ilave edildikten sonra hemen tespit edilebilir süspansiyon ve kalsiyum sinyalleri haline getirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Reaktifler ve Çözümleri 1. Hazırlık
- Değiştirilmiş bir Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlanması (mM olarak: 136,9 NaCl, 5.37 KCI, 0.34 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17 NaHCO 3, pH 7.2, fenol kırmızı). 4 ° C'de muhafaza.
- 1.5 M CaCI2 ve 2 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) (pH 7.2) damıtılmış su kullanılarak stok çözeltileri olun.
- Probenesid, bir 250 mM stok çözelti hazırlayın. , 1 N NaOH içinde probenesid tozu çözmek damıtılmış su ile son hacminin dörtte üçüne kadar doldurun ve yavaşça 1 N HCI ile pH 7.4'e titre edilir, serbest asit şekli için (suda çözünür olarak atfedilen). 4 ° C'de muhafaza.
- 1 mM'lik bir stok konsantrasyona susuz dimetil sülfoksit (DMSO) içinde flüoresan membran geçirgen kalsiyum bağlama boya çözülür. Karanlıkta -20 ° C'de saklayın.
- Her deneyden önce taze hazırlanması probenesid içeren HTarafından BSS akı (PHF) tamponu (nihai konsantrasyonda), 1.5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7.2,% 5 fetal sığır serumu, 2 mM probenesid ve 5.55 mM glükoz ile HBSS modifiye birleştirilmesi. 37 ° C de ısıtılır.
2. Hücre Kültürü
- Standart kültür ortamı içinde bir 6 yuvalı plaka, 35 mm tabak başına iyi Levha, 2.5 x 10 5 böbrek proksimal tübül hücreleri (WKPT-0293 CL.2) ile yaklaşık% 70 arasında bir akışkanlığa eriştikten 2 gün süre ile büyür.
3. Kalsiyum Boya Yükleme
- Her bir göze ya da çanak için,% 5 fetal sığır serumu, 4 uM hücreden geçebilen kalsiyum bağlama boya ve 2 mM probenesit içeren 1 ml kültür ortamı karıştırın.
- Her bir 1 ml dolum boya karışımı ile, kültür ortamı yerine ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Flüoresan göstergesi ağartma engellenmesi için alüminyum folyo ile plaka örtün.
Ce 4. hazırlanmasıAkış Sitometrinin için lls
- 37 ° C'ye ısınmaya% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi.
- Aspire kalsiyum yükleme boyası, her kuyudan çözeltisi ve kuyunun duvarı boyunca 1 mi tripsin ekleyin.
- Tüm hücreler müstakil kadar 37 ° C'de inkübe edilir.
- 1 dakika için 10,000 g'da bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile 1.5 ml tüp ve pelet hücreleri aktarın.
- Dikkatle pelet bozmadan süpernatant aspire.
- Yukarı ve aşağı pipetleme 1 ml PHF'ye tampon ve tekrar süspansiyon ekleyerek hücreleri yıkayın.
- 1 dakika için 10,000 g'da santrifüj ile pelet hücreleri.
- Tekrarlayın 4.6 adımları. ve 4.7. Bir başka iki kere verilir.
- 500 ul PHF tamponu nihai hacim içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 saat içinde deney için hücreleri kullanır.
- İsteğe bağlı: sayımı hücreleri hücre konsantrasyonunu belirlemek ve 5 x 10 4 kullanımı - ölçüm başına 1 x 10 5 hücre.
5. Akış Cytometer Kur
- , Sitometresinin akışını başlatmak fluidik çekmeceyi açın ve kılıf sıvısı tankının hava basıncı artırmak için havalandırma valfi geçiş anahtarı çevirmek.
- "Prime" iç boru ve akış yönlendirme odacığı içinde potansiyel oturduğu hava kabarcıklarını çıkarmak için cihaz.
- Akış sitometri yazılımında, açık iki nokta arsa pencereler.
- Birinci nokta örgüsü, sırasıyla, büyüklüğüne ve boyu yoluyla numune içindeki hücrelerin kalitesi kontrol etmek için Y parametresi için X parametresi ve yan saçılan ışığa (SSC) için saçılan ışık (FSC) gerektirir.
- İkinci nokta arsa kalsiyum bağlanmış boya floresans yoğunluğunu ölçer. Doğrusal bir ölçek üzerinde X parametresi için saniyede bir logaritmik ölçek ve zaman kullanarak Y parametresi için uygun floresan algılama kanalı seçin.
- 'Yüksek' olarak akış hızını ayarlayın.
6. Akım Sitometri Measurement
- RT'de ölçümleri yapın. Örnek tüpü (11.5 x 75 mm) sitometri akışı olarak, 480 ul, PHF tampon ekleyin.
- Karıştırmak için 20 ul hücre süspansiyonu ve kısaca vorteks ekleyin.
- Tarafına, boru destek kolunu hareket ve bir sıkı conta oluşana dek örnek enjeksiyon borusu üzerindeki numune tüpü yerleştirin. Orijinal merkezli konumuna boru destek kolunu dönün.
- Numunenin ortalama florasan yoğunluğu yaklaşık 10 2 y-ekseni üzerinde olacak şekilde floresan kanalı ayarlayarak ölçümü optimize. Kaydedin ve daha sonraki deneyler için kullanılacak.
- Bir denemeyi başlatmak için, tekrar 6,1-6,3 adımları.
- 50 sn için rekor taban floresans.
- Kısaca eklemek, ilgi, girdap bileşik örnek tüpü çıkarın ve örnek enjeksiyon tüp dönmek, ölçüm Pause. Bu adım fazla 15 saniye sürmez.
- Ölçüm Devam ve 204,8 saniyelik bir toplam devam etmektedir.
- Bir kalsiyum i kullanınonophore gibi iyonomisin (10 uM), ve etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) gibi bir kalsiyum kenetleme maddesi, MnCl2 ve CoCl2 (2 nM), sırasıyla pozitif ve negatif kontroller için.
7. Veri analizi
- Böyle WınMDI (Akış Sitometrinin Windows Çoklu Belge Arabirimi), Scripps Enstitüsü'nden, Sitometrisi Çekirdek Tesisi'nde Joe Trotter tarafından geliştirilen ücretsiz bir yazılım paketi olarak çevrimdışı analiz için özel bir akış sitometri yazılımı kullanarak veri, analiz edin.
- SSC ve FSC parametreleri ile bir nokta arsa açın.
- "Bölgeler" aracını kullanarak analiz için hücrelerin bölgeyi seçin ölü hücreleri ya da veri analizi sol alt köşesinde bulunan hücre artıkları (Şekil 1) dışlamak için (resmin üzerine sağ tıklayın).
- Quadrant analizi (Şekil 2)
- Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve floresan yoğunluğu ile zaman bir yoğunluk arsa açın. Tüm olayları kullanın.
- Bize7.3 olarak aynı yolluk bölgeyi e.
- "Quadrant" aracını kullanarak, verileri niceliğini.
- Dikey çizgi bileşiği, ilave bir zamanda ve yatay çizgi kontrollerde taban floresans ortasına yerleştirilir, böylece kadran ayırıcılar ayarlayın. Kadranda ayırıcılar konumlandırma tüm örneklerde eşit olduğundan emin olun.
- Ayrıca herbir çeyrek içindeki hücrelerin yüzdesi her bir köşesinde (Şekil 2) olarak gösterilir. Örnekler arasındaki sağ üst kadranda (UR) karşılaştırın.
- Histogram analizi (Şekil 3)
- Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve olaylar floresan yoğunluğu olan bir histogram pencerede kontrol verilerini açın. Tüm olayları kullanın.
- Resimsel bir bakış için, bindirme araziler olarak kontrol parseline (Dosya seç → Kaplama → Open File → Dosya gidin) karşılaştırılmak üzere test verileri ekleyin.
- Kantitatif analiz için, tek histogram kazanmakCamlar kullanılmalıdır. Gate adım 7.3 bölgesi R1 kullanarak hücre popülasyonu.
- Muamele edilmemiş kontrolde, azami floresan yoğunluğu olarak ve minimum kontrol pik maksimum floresans ve bitiş kısmı arasındaki orta nokta başlayarak analiz alanı işaretlemek için ("marker") işareti işlevini kullanın. Bu bölgede hücrelerin yüzdesi hesaplanır.
- Istatistik penceresinden veri almak. Analiz için aynı işaretli alana kullanarak veri dosyalarını geri kalan için tekrarlayın.
- Flüoresan yoğunluğu analizi (Şekil 4)
- Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve floresan yoğunluğu ile zaman, bir nokta arsa açın. Tüm olayları kullanın.
- "Kinetik Modu" ve "Kaplama Kinetik Çizgi" etkinleştirin. Mavi çizgi ortalama floresan yoğunluğu temsil nokta arsa görünecektir.
- Birden fazla dikdörtgen bölgeler oluşturarak bağıl kalsiyum girişini niceliğini. Her bölge aw olmalıdır"10 saniye" eşdeğer "50", yaklaşık bir likli. 15 dikdörtgen bölgelere kadar tanımlayın.
- Istatistik penceresinden ölçümlerini almak ve bir tablo içine kopyalayın.
- Analizi için y-ortalama veri kullanılır. 20 saniye 50 eşdeğerdir R6, R2 ila ortalamasını hesaplayın. Bu, temel değerdir.
- Kalsiyum akını analizi (başlangıçlı, süresi ve yoğunluğuna bağlıdır) için uygun bir zaman aralığı seçin.
- , Ortalama bazal değer, bu zaman aralığı, göreli içinde% 100 olarak ayarlanmış bileşik ilavesinden önce yani flüoresans sinyali, her bir bölgeden kalsiyum sinyallerini hesaplar. Bileşik ek sonrası ortalama ve bölgelerin standart sapmasını belirlemek; Bu bileşik ile uyarılmış ortalama kalsiyum sinyalidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sitozolik kalsiyum artırmak için, iki farmakolojik bileşikler hücre geçirgen kalsiyum bağlama boyası, Flu-3-AM ile yüklendi, renal proksimal tübüllerde (WKPT-0293 CL.2) uygulanmıştır. İşlem görmemiş kontrol numuneleri probenesid mevcudiyetinde kalsiyum bağlama boya ile yüklenir ve karıştırılır, ancak herhangi bir bileşik ilavesi olmaksızın edildi. Thapsigargin (TG) ER dışarı sızıntı yol açan ve artan sitosolik kalsiyumun elde SERCA pompanın klasik bir inhibitörüdür. Tunikamisin (TUN) blokları katlanmamış protein karşılığının aktifleşmesini sağlayan proteinlerin N-glikosilasyon değil, aynı zamanda, sitosolik kalsiyum 18,21 artırır. Bir pozitif kontrol, ionomisin (IONO olarak), hücre dışı kalsiyum için plazma zarının geçirgen hale getirmek bir kalsiyum iyonofor kullanılmıştır. Analizi için, hücre popülasyonu (Şekil 1 R1) SSC / FSC nokta arsa, bir bölgeyi seçerek Geçitli. Zamana karşı floresan yoğunluğu için bir yoğunluk arsa her veri dosyası oluşturuldu. Kadran fonksiyonunu kullanarak, nokta arsa taban floresans önce ve bileşik ilave edildikten sonra, yukarıda ve aşağıdaki Flu-3 floresans yoğunluğunu temsil eden, dört bölüme ayrıldı. Her kadranda kapılı hücre nüfus yüzdesi olarak Niceliklendirilmesi artmış sitozolik kalsiyum konsantrasyonunun belirlenmesini sağlar. Bu örnekte, 3 uM TG kalsiyum sinyal neden olduğunu gösteren üst sağ çeyrekte bulunan hücrelerin yüzdesinde bir artışa neden olmaktadır. Hücrelerin yüzdesi TG tedavi edilmiş hücrelerde% 51,3 (1.20 kat) kontrol% 42.8 artar. Benzer şekilde, 6 uM TUN% 49.9 (1.17 kat) artan kalsiyum floresan ile hücrelerin yüzdesini artırır. 10 uM Iono uygulanması üst sağ çeyrekte bulunan hücreler (Şekil 2),% 65.5 (1.53 kat) ile sonuçlanmıştır. Histogram analizi 1.41 kat, 1.36 kat ve TG, TUN ve Iono, sırasıyla (Şekil 3) ile 2.11 kat sonuçlandı (istatistikler için bkz <sup> 18). Son olarak, birden fazla bölge analizi modunu kullanarak, TG, TUN ve IONO 1.55 kat, 1.29 kat ve kontrol, sırasıyla (Şekil 4) üzerinden kalsiyum sinyalde 4.54 kat artışa neden olmuştur.
En hassas analiz modu birden çok bölge analizi oldu. Hücre popülasyonunun dağılımı ölçülür kadran ve histogram analizi modları, aksine, çok sayıda bölge analizi şekli, toplam hücre popülasyonundan gelen floresan sinyaldeki değişikliği ifade etmektedir. Farklı analiz modlar arasından sonuçlarında büyük tutarsızlık birden bölge analizi 4.54 kat kadranda analizinden kontrolü üzerinde 1.53 kat artış arasında değişmekteydi ionomisin oldu. Test edilen bileşikler, varyans arzetmemiştir. Mutlak değerler farklılık olsa Ancak, tüm analiz modu boyunca, kalsiyum sinyalinin ölçüde, yani aynı kaldı uyarılmış, IONO TUN TG tarafından ve daha sonra takip büyük etkisi vardı. TG fıçı veya Iono uygulanması sitosolik kalsiyum kalıcı değişiklikler ile sonuçlanır. Geçici fizyolojik kalsiyum sinyalleri, bu yöntem kullanılarak ölçülebilir olup olmadığını belirlemek için, ATP WKPT-0293 CL.2 hücrelere uygulandı. ATP metodu sitometri akışı ile bütünüyle tespit edilememiştir hızlı ve geçici kalsiyum sinyali, uyarılmış. 20 ATP konsantrasyonları - 100 mcM konsantrasyonu kalsiyum sinyalleri "yavaşlatmak" düşürüldü bu nedenle algılamak zor. Şekil 5'te gösterildiği gibi, sitosolik kalsiyumun bir değişiklik 5 uM ATP ilave edildikten sonra ölçülebilir. Yine de, floresan değişimi tepe kaydedilmemiştir. Kadran analizi (Şekil 5B) ve histogram analizi kullanılarak (Şekil 5C) modları, ATP kalsiyum sinyallerinin herhangi bir farklılık, kalsiyum sinyalinin geçici bir doğada tespit edilebilir. Bununla birlikte iz, seçilmiş kısım, çok rectangular bölge analizi modunun hemen sonra ölçüm (Şekil 5A) devam kalsiyum sinyalinin 1.85 kat artış kaydedildi.
Şekil 1. SSC FSC nokta grafiği. Hücre popülasyonunun bütünlüğü yan dağılım (SSC) ve forward scatter (FSC) kullanılarak değerlendirildi. Bir bölge daha fazla analiz için (R1) seçilir. Işık saçılması azaltılmış, ölü hücreler ve hücre döküntüsü, hariçtir. Bir temsilci nokta arsa gösterilmiştir.
Şekil 2. Quadrant analizi. Boyar madde ile yüklenmiş WKPT-0293 CL.2 hücrelerinin kalsiyum bağlayıcı taban floresans 50 saniye boyunca ölçülmüştür. Ölçme durdu, bileşik veya diprosesini müteakiben ilave edildi karıştırmak için vortekslendi ve ölçüm 204.8 saniyelik bir toplam hemen devam edildi. Kantifikasyon kadran analizi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Histogram analizi. TG, TUN veya Iono ile tedavi boya yüklü WKPT-0293 CL.2 hücrelerini kalsiyum bağlayıcı Histogram arsa. Işaretleyici işlevi, kontrol eğrisinin zirvesinde marker başlangıç noktasını konumlandırma ve maksimum floresan biten tarafından ölçüldü yüksek kalsiyum bağlayıcı boya floresan ile Geçitli hücrelerin yüzdesini kullanarak. Bir Larg görmek için buraya tıklayınızBu rakamın er sürümü.
4. Çoklu bölge analizi Şekil. Boyar madde ile yüklenmiş WKPT-0293 CL.2 hücrelerinin kalsiyum bağlayıcı taban floresans 50 saniye boyunca ölçülmüştür. Ölçüm, bir bileşik ya da seyreltici ilave edildi durduruldu karıştırmak için vortekslendi ve ölçüm 204.8 saniyelik bir toplam hemen devam edilmiştir. Kantifikasyon birden dikdörtgen bölge analizi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ATP-bağlı kalsiyum sinyallerinin Şekil 5. analizi. Taban floresans Oboyar madde ile yüklenmiş WKPT-0293 CL.2 hücrelerinin bağlanması, f, kalsiyum 50 saniye boyunca ölçülmüştür. Ölçüm, 5 uM ATP ilave edildi durduruldu karıştırmak için vortekslendi ve ölçüm 204.8 saniyelik bir toplam hemen devam edilmiştir. Veri çok dikdörtgen bölüm analizi (A) kadran analizi (B) veya histogram analizi (C) kullanarak nicelendirildi. Birden fazla bölge analizi için, sadece geçici kalsiyum sinyal analiz edildi. Temsilcisi veri veya n den analizi = 3 -. 7 gösterilmiştir , bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kalsiyum ikinci mesajcı sinyal molekülü olarak ve aynı zamanda, ER ve mitokondri arasında iletişim kurmak için bir araç olarak hareket eden bir çok hücresel süreçlerde önemli bir olaydır. Ücretsiz Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları değişiklikleri ölçmek için yeteneği hücre biyolojisi tüm alanlarında uygulayabileceğiniz yararlı bir tekniktir. Sitozolik kalsiyum sinyalleri algılamak için çeşitli yöntemler vardır. Klasik olarak, bu tür Fura-2 gibi, bir oran ölçer kalsiyum göstergesi, gelen sinyaller, bir flüoresan görüntüleme setup ve mutlak kalsiyum konsantrasyonu kullanılarak canlı hücreler izlenir minimum ve maksimum floresan yoğunluklarının belirlenmesi elde edilebilir. Ancak, bu teknik, bir floresan mikroskop, kurmak, bir canlı hücre görüntüleme ve analiz yazılımı olarak, özel ekipman gerektirir. Burada, çoğu laboratuvarlar tarafından erişilebilen akış sitometrisi kullanılarak yapışık epitel hücrelerinin sitozolüne, kalsiyum tespiti için basit bir yöntem tarif eder.
Epithelia po vardırmetabolitler, ksenobiyotiklerin ve ilaç taşınmasından sorumlu taşıyıcılarının bir dizi ssession. Özel önem taşıyanlar organik katyon ve organik anyon taşıyıcıları 22 aittir ve SLC22A süper ailesinin üyeleri olan 23 arasında birden fazla ilaca karşı direnç gösteren P-glikoprotein ABCB1 ve çoklu ilaç direnci proteinleri (MRPs) sayar ATP-bağlayıcı kaset (ATP) süper ailesi, . Gergely ve arkadaşları tarafından kağıt tarif edildiği gibi sıçan böbrek proksimal tübül hücre çizgisi WKPT-0293 CL.2 kullanılarak gerçekleştirilen başlangıç deneyleri yapıldı. 16. Hücreler, süspansiyon haline getirildi ve Fluo-03:00 ile yüklendi. Bununla birlikte, yalnızca küçük bir değişiklik, 10 uM ionomisin (çeyrek analizi ile kontrol 50,95% veya daha fazla bölge analizi ile 1.78 kat karşı 38,14%) gözlenmiştir. Epitel nakil Flu-03:00 ile hücrelerin zayıf yüklenmesi için sorumlu olduğunu varsaydık. Bu sorun, probenesit ve PSC833, organik a inhibitörleri aşmak içinNION taşıyıcıları ve birden fazla ilaca karşı direnç gösteren P-glikoprotein, sırasıyla, kalsiyum hücre mono tabakaları için boya bağlayıcı ile eş zamanlı olarak uygulanmıştır. PSC833 Çin hamster yumurtalık hücrelerinde 24 bir önceki rapora aksine hiçbir etkiye sahip değildir, oysa, bazal, flüoresans yoğunluğunda bir artış ile gösteriler Probenesid, boya yükleme bağlanma kalsiyum geliştirilmiştir. Bu fark muhtemelen farklı hücre hatlarında ABCB1 seviyelerinde yer alır; WKPT-0293 CL.2 hücre çizgisi bu zehirli metaller 25,26 gibi toksik maddeler tarafından indüklenebilir ABCB1 düşük bir endojen seviyesine, barındırır. Kalsiyum boya yükleme arttırmak için probenesid kullanımı, örneğin kalsiyum sinyal hücre içi sinyal sistemindeki bir rol oynayabilir, sinir sistemi, kan-beyin engeli ve karaciğer hücreleri gibi probenesid duyarlı taşıma sistemleri sergileyen diğer hücre türleri, uzatılabilir yollar.
Kalsiyum kolay algılama kendi requi Flu-3 yalanlara bağlamatek bir uyarma dalga boyunda (506 nm) ve bir emisyon dalga boyunda (525 nm) rement. Bununla birlikte, tek dalga boyu kalsiyum olmayan bir oran ölçer olarak boya, boya bağlama ile üretilen veriler, sadece muamele edilmemiş kontrollere göre sitosolik kalsiyumun nispi artış ölçmek için kullanılabilir. Bir tayf kayması eşit olmayan boya yükleme ve ağartma düzeltmesine izin verir kalsiyum bağlayıcı sonra ortaya çıkar, çünkü saf kalsiyum konsantrasyonunu belirlemek üzere, bir oran ölçer boya gereklidir. Rasyometrik boya Indo-1 27,28 flow sitometri ile immünolojik hücrelerinde kalsiyum mobilizasyonu saptanmasında kullanılan, fakat şimdiye kadar, bu epitel hücrelerinde yapılmamıştır. (Kalsiyum bağlandığı zaman ve 475 mil kalsiyumsuz zaman 400 nm), Grynkievvicz et al. 11 tarafından tarif edildiği gibi, mutlak sitosolik kalsiyum konsantrasyonları belirlenebilir UV uyarımlı Hint-1'in iki emisyon spektrumunu kullanılması.
Bizim örnek veri ap neden farmakolojik ajanlar kullanılırSitosolik kalsiyum bakımından ermanent değişim. Fizyolojik kalsiyum sinyalleri, düşük yoğunlukta olan hızlı kinetik görüntülemek ve geçicidir, bu nedenle soru yöntemin sitometri akış fizyolojik kalsiyum sinyalleri algılamak için yeterince duyarlı olup olmadığı kalır. ATP ile yapılan deneyler (canlı hücre görüntüleme ile ölçülen) ATP uygulanması üzerine artan kalsiyum sinyaliyle gösterildiği gibi purinerjik reseptörlerini barındıran WKPT-0293 CL.2 hücre hattı ile yapıldı. 100 uM ATP, ancak Bileşik toplama sinyalinin sadece bir kısmı kaydedilecektir anlamına geliyordu sonrasında elde edilen sürdürme gecikme ile birlikte sinyalinin hızla doğası - sitometre artan sitosolik kalsiyum 1 gözlenebilir akışı kullanılması. Böylece yöntemin sitometri akışının büyük dezavantaj, hızlı (<10 sn) kaydetmek için sınırlı kapasitesi ve geçici kalsiyum sinyalleri; daha çok yöntem daha yavaş geçici sinyal (> 10 saniye) veya kalıcı, yüksek Hesaplanan doğuran uyarıcılar için daha uygunduryum sinyaller. Bu sınırlamalar uyarıcısı konsantrasyonunu azaltmak suretiyle veya sitosolde serbest kalsiyum tutmak için, kalsiyum yeniden alım mekanizmaları için inhibitörlerinin uygulanmasının hem dikkatli sitosolik kalsiyum başına artmadığı bir inhibitör seçmek için alınması gereken engellenebilecektir olabilir.
Bilgi canlı hücre görüntüleme ile edinilen ve akış sitometri oldukça farklıdır. Canlı hücre görüntüleme ile yüksek çözünürlüklü kalsiyum uzamsal değişiklikler görüntüleme için tek bir hücre içi bölgeleri seçilerek ölçülebilir anlamına gelir. Bu yüzden hızlı kalsiyum sinyalleri kaydedilebilir 2 sn - Ayrıca, floresan sinyalleri kesintisiz her 1 elde edilir. Bunun aksine, sitometrisi daha yavaş ve daha uzun süren bir kalsiyum sinyalleri için daha uygundur ve bir bütün hücre popülasyonundan kalsiyum sinyallerini ölçer akar. Kalsiyum sinyallerinin Sadece rölatif değişimler yöntemi sitometri akışı ile ölçülebilir. Ama, yöntem sitometri akış avantajı bir numarası vardırGeleneksel canlı hücre görüntüleme fazla Tages: bileşikler (stimülatörler ve kalsiyum sinyallemesinin inhibitörlerinin 1), yüksek kapasiteli tarama) gerçekleştirilebilir; 2) Belirli bir görüntüleme uzmanlık gerekli değildir; 3) araştırma teknisyenleri ölçümleri yapabilir; 4) araçlara sahip değilsiniz klinik ve non-klinik laboratuvarlar kalsiyum sinyalizasyonu araştırmak, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve rasyometrik kalsiyum ölçümleri gerçekleştirmek için. Birlikte ele alındığında, yöntem sitometri akışı, kinetik araştırmacı ilk olarak kalsiyum için bir rol kurmak istiyor ve kolay bir şekilde yukan ve aşağı doğru sinyal yollarını belirlemek için inhibitörlerin uygulanabilirse de, canlı hücre görüntüleme (kalsiyum sinyali karakterize etmek için gerekli olacaktır, oysa yararlıdır örn. daha detaylı, yoğunluğu, mekansal değişiklikler).
Özetle, sitosolik kalsiyum gerçek zamanlı nispi değişikliklerin saptanması için hızlı, basit ve duyarlı bir yöntem tarif zor yük yapışık epitel böbreksüspansiyon haline getirilmiş hücreler. Akış sitometrisi, bir akış erişim olmadan deneyi, bu yöntem kolayca küvet içinde hücre süspansiyonu ile olan bir spektrofluorimetre uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Laboratuvarlarda araştırma Fritz-Bender Vakfı, Münih, Almanya (TD) ve (W.-KL) Witten / Herdecke iç araştırma bursu bir üniversite tarafından finanse edilmektedir. Biz yararlı önerileri için (Fizyoloji, Patofizyoloji ve Toksikoloji, Witten Üniversitesi / Herdecke için Institute) Prof Dr. Frank Thévenod teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluo-3, AM | Invitrogen | F-1241 | Cell permeable |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P-8761 | Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1X) | Invitrogen | 25300-062 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| Thapsigargin | Tocris Bioscience | 1138 | |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software | Becton Dickinson | ||
| Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI) | Joe Trotter, The Scripps Institute | Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data. | |
| WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line | Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University, Cleveland, OH) |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).
- Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature. 361, 315-325 (1993).
- Putney, J. W. Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate. Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).
- Putney, J. W., Ribeiro, C. M. Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores. Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).
- Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. STIM proteins: dynamic calcium signal transducers. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).
- Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J.
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).
- Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences. J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).
- Roderick, H. L., et al. Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid. Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. , (2013).
- Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry. Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).
- June, C. H., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration. Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).
- Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization. Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).
- Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).
- Seidel, J., et al. The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells. Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).
- Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP. Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).
- Woost, P. G., et al. Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats. Kidney Int. 50, 125-134 (1996).
- Beyer, K. H., et al. Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination. Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).
- Buckley, B. J., Whorton, A. R. Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells. Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).
- Koepsell, H. The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions. Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).
- Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).
- Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes. Cytometry. 17, 343-348 (1994).
- Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis. J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).
- Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells. Mol Cancer. 9, 102 (2010).
- Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood. 74, 2674-2680 (1989).
- Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM. Cytometry. 10, 165-173 (1989).
