Introduction
ويتكون صمام ناضجة من ثلاث طبقات طبقية من المصفوفة خارج الخلية المتخصصة (ECM) تتخللها خلايا الخلالية صمام (فيكس) ومغلفة بطبقة واحدة من الخلايا البطانية صمام القلب (VECs) 1. دور ECM هو توفير جميع خصائص النشاط الحيوي اللازمة لتحمل التغيرات المستمرة في قوة الدورة الدموية أثناء دورة القلب. وينظم دوران ECM صمام في صمام الكبار بإحكام بواسطة فيكس التي هي هادئة إلى حد كبير ومثل الخلايا الليفية، في غياب المرض. بالإضافة إلى السكان VIC، والخلايا البطانية صمام القلب (VECs) تشكل البطانة دون انقطاع على سطح الشرفات صمام 2. في حين وصفت أهمية ECM وفيكس للهيكل صمام وظيفة من قبلنا وغيرها، ودور VECs أقل شهرة. ومع ذلك، هذه الفئة من السكان خلية صغيرة نسبيا هو أمر حاسم لتشكيل صمام في الجنين، ويتم وصفها بأنها مختلة في صمامالمرض.
تشكيل صمام القلب في الجنين يبدأ عند مجموعة فرعية من الخلايا البطانية داخل المناطق القناة وتدفق القناة الأذينية البطينية تخضع البطانية إلى التحول الوسيطة (EMT) وشكل تورمات المعروفة باسم سائد شغافية 1،3. خلايا اللحمة المتوسطة تحولت حديثا ضمن هذه الهياكل تفرق في وقت لاحق إلى فيكس وتشكل صمامات ناضجة. مرة واحدة اكتمال EMT، والخلايا البطانية التي تحيط الوسائد، ويطلق VECs، تشكل طبقة الخلايا البطانية دون انقطاع يحمي صمام ناضجة ضد الاصابة. بالإضافة إلى ذلك، VECs بمعنى البيئة والدورة الدموية وقد ثبت أن جزيئيا التواصل مع فيكس الأساسي لتنظيم ECM التوازن 1،3. في الصمامات المريضة، تعطل أحادي الطبقة مركزنا بالتعاون مع تغيرات غير طبيعية في المؤسسة ECM والميكانيكا الحيوية غيرت 4،5. بالإضافة إلى ذلك، تشير الدراسات في نماذج الماوس التي خلل مركزنا هو السبب الكامن وراء صمام دisease 1،6-9. كما VECs تلعب دورا هاما في تطوير صمام، والصيانة، والمرض، فمن المهم أن نحدد تماما من الظواهر الزمنية من أجل المضي قدما الميدان وفهم آليات المرض.
العمل السابق عدة مختبرات قد عزل بنجاح VECs من الخنازير والأغنام نماذج 10-12. نظرا لحجم كبير من هذه الصمامات، والعزلة من خلال ينظف و / أو الهضم الأنزيمي، تليها عدد من الأساليب المختلفة بما في ذلك العزلة المغناطيسي فصل خلية حبة وحيدة الخلية التوسع النسيلي كانت فعالة لتوليد السكان النقي 11-13. ومع ذلك، يمكن لهذه النماذج أن يكون مقيدا بسبب الشرح غير مكتمل من الخنازير والأغنام الجينوم الحد من توافر الأدوات الجزيئية بالإضافة إلى ارتفاع التكاليف. لذا التجريب من الخنازير والأغنام VECs بعد العزلة يمكن أن يكون تقييدا. نماذج الماوس هي المفضلة بسبب عدة احتمالات للmanipula الوراثيةنشوئها والأدوات الجزيئية في الجنين والكبار، ولكن حتى الآن، لم ترد تقارير عن العزلة مركزنا في النماذج الحيوانية الصغيرة. هذا هو الأرجح بسبب صعوبة العمل مع عينات الأنسجة الصغيرة التي تضم أقلية السكان الخلية التي تفتقر حاليا هوية فريدة من علامات مركزنا محددة، وبالتالي منع أساليب العزلة القائمة على الأجسام المضادة.
في هذه المقالة، ونحن التقرير طريقة جديدة لعزل مباشرة من VECs الفئران في المراحل الجنينية والكبار. هذا البروتوكول يستفيد من الفئران Tie2-GFP، التي تعبر عن GFP في جميع أنواع الخلايا البطانية والتي استخدمت على نطاق واسع لدراسة السكان الخلية البطانية 14. ومع ذلك، فإن حداثة هذه الدراسة الحالية هي أن هذه الفئران، للمرة الأولى استخدمت لعزل الخلايا البطانية من الصمامات. عن طريق تشريح دقيق للأنسجة صمام وسلسلة من تسعة الهضم الأنزيمية تليها FACS الفرز، VECs يمكن عزلها واستخدامها لأساليب فنية تجريبية مختلفة فيبغرض اختتامها استخراج الحمض النووي الريبي والثقافة، مباشرة بعد الفرز.
Protocol
1. إعداد المعدات وحلول
- تعقيم أدوات تشريح - مقص النسيج غرامة لاستخراج قلوب الكبار و2 ملقط غرامة لتشريح المنطقة صمامي - بواسطة التعقيم في علبة أداة مغطاة. أدوات رش مع 70٪ من الإيثانول (ETOH) قبل تشريح.
- إعداد جميع الحلول فورا قبل التجربة وتعقيم الحلول من خلال تمريرها من خلال العقيمة 0.2 ميكرون التصفية. إبقاء الحلول على الجليد حتى الاستخدام.
- معقم التفكك العازلة (15 مل الإجمالية / عينة). الجمع بين 1.2 مل كولاجيناز الرابع، 300 ميكرولتر 2.5٪ التربسين و 150 ميكرولتر مصل الفرخ. جعل حجم ما يصل الى 15 مل مع محلول الملح هانك المتوازن (HBSS).
- معقمة الفرز العازلة (12 مل المجموع). تجمع 25 ميكرولتر 0.5 M حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) و 12 ميكرولتر الدناز الأول (خالية من ريبونوكلياز). جعل حجم ما يصل الى 12 مل مع HBSS.
- مركزنا الثقافة وسائل الإعلام. ميكس غرو البطانيةوث وسائل الإعلام وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر جدول المواد) وذلك بإضافة مكونات aliquoted من عدة إلى 500 مل من EBM2 سائل الإعلام.
- GFP سلبي الثقافة وسائل الإعلام (وسائل الإعلام الخلايا غير البطانية). خلط 445 مل من متوسط 199 1X مع 5 مل من البنسلين / الستربتومايسين (القلم / بكتيريا) (1٪ تركيز النهائي) و 50 مل FBS (10٪ تركيز النهائي).
2. تشريح المنطقة الصمامية من الفئران الكبار والأجنة E14.5
- تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية وتنفيذ وفقا للمبادئ التوجيهية معهد بحوث مستشفى IACUC وعلى الصعيد الوطني للطفولة.
- تم شراء الفئران Tie2-GFP من جاكسون معامل (عدد الأسهم 003658) 14 و تمت المحافظة كما المورثات متماثلة اللواقح على خلفية FVB / N، وبالتالي ضمان أن جميع GFP خارج الربيع صريح في الخلايا البطانية Tie2 إيجابية.
- لFACS الفرز، وإعداد سن يقابل واحد عصيدة السلبيةلو أن لا يحتوي GFP مثل C57 / BL6 لتعيين المعلمات بوابة GFP لFACS الفرز. ملاحظة: هذا البروتوكول والنتائج تمثيلية تعتمد على استخدام ثلاثة، الفئران البالغة من العمر أربعة أشهر أو لتر واحد في اليوم الجنينية (E) 14.5.
- الفئران الكبار: التضحية التالية مباشرة بواسطة CO 2 نقص الأكسجين، واستخدام مقص تشريح لفتح بلطف تجويف الصدر وكشف القلب والرئتين. تعرض مرة واحدة، وقبضة القلب مع ملقط على الشرايين الكبيرة وسحب بعيدا عن الجسم. إزالة أنسجة الرئة إذا سليمة، وقلوب مكان في HBSS البارد لشطف. إزالة البطين والأذين الانسحاب بعيدا تاركا القناة الأذينية البطينية 'عصابة' والمناطق الأورطي سليمة. جعل شق واحد أسفل الجانب من القناة الأذينية البطينية لفتح 'عصابة' وفضح الهياكل صمامي. إزالة عضلة القلب والشريان الأبهر المناطق القريبة من إغاظة بلطف بعيدا بالملقط. التعرف على منشورات صمام والبيضاء، والأنسجة الكثيفة على عضلة القلب الوردي. ديتا بلطفCH يقع tendinae الحبل من الصمامات الأذينية البطينية وإزالة أكبر قدر من عضلة القلب المتبقية ممكن. توخي الحذر لعدم سحب أو كشط منشورات صمام أثناء هذه العملية منذ VECs يمكن فكها. وضع المناطق صمامي قلصت في أنبوب 1.5 مل إيبندورف تحتوي على 1 مل HBSS والحفاظ على الجليد. ملاحظة: تشريح دقيق أمر بالغ الأهمية للقضاء على الخلايا البطانية غير صمامي التي يمكن أن تلوث العينة.
- الأجنة: النحر إناث الفئران بعد 14.0 يوما لوحظ الجماع المكونات (صباح الجماع المكونات = 0.5 أيام).
- بعد التضحية الفور، تشريح الرحم (التي تحتوي على أجنة) ويغسل في HBSS الباردة. تشريح الأجنة الفردية من الرحم وإزالة الكيس المحي الجنينية المحيطة بكل الجنين. إزالة قلوب من كل من الأجنة واتبع الخطوة 2.1. (ملاحظة: الضغط بلطف الجنين بالملقط فقط دون الزوائد العليا ينبغي أن تساعد في فضح القلب وجعل إزالة أسهل.)
- نصائح باستخدام ماصة معقمة، إزالة HBSS من الأنبوب إيبندورف تحتوي على مناطق صمامي.
- استبدال مع 1 مل تفارق العازلة و4 ميكرولتر الدناز I.
- تدوير الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
- ماصة صعودا وهبوطا 3 مرات ومن ثم السماح للعينة تستقر لمدة 15 ثانية. جمع طاف (التي تحتوي على الخلايا فصلها) في أنبوب مخروطي 15 مل.
- لوقف رد فعل كولاجيناز، إضافة 125 ميكرولتر من مصل الحصان إلى أنبوب جمع. إبقاء أنبوب جمع على الجليد.
- كرر الخطوات التفكك (3،2-3،5) تسع مرات لجمع تسعة أجزاء من طاف.
- تمرير مجموعة منشقة من خلال مرشح النايلون 70 ميكرومتر في أنبوب المجموعة الجديدة لضمان تعليق خلية واحدة عن طريق إزالة أي حطام وكتل.
- تدور تعليق في 400 غ لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه.
- resuspend الكرية خلية في 1 مل العازلة الفرز والحفاظ على الجليد حتى FACS.
4. FACS فرز GFP VECs إيجابي
- وضع بوابات لالأمام والجانب مبعثر لاستبعاد الحطام والتقاط الخلايا واحدة؛ استبعاد الحلل باستخدام التمييز صدرة النابضة. تسجيل عينة السيطرة السلبية وتحديد إعدادات بوابة من أجل مقارنة وبدقة تحديد السكان الخلية GFP إيجابية في العينة Tie2-GFP.
- تحليل الخلايا إيجابية GFP عبر نظام مراقبة الأصول الميدانية وصقل إعدادات البوابة.
- نوع العينة Tie2-GFP وجمع كل من الخلايا GFP إيجابية وGFP سلبية. إذا كان سيتم استخدام خلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، نوع مباشرة في مخزن الفرز. إلى خلايا الثقافة بعد نظام مراقبة الأصول الميدانية، وجمع خلايا إيجابية GFP في أنبوب معقم يحتوي على 1 مل سائل الإعلام مركزنا مع 1 مل FBS، وجمع الخلايا GFP السلبية في 1 مل من وسائل الإعلام غير البطانية مع 1 مل FBS. استخدام هذا 50٪ مزيج سائل الإعلام / 50٪ مصل لتحسين بقاء الخلية. الحفاظ على الجليد حتى التحليل FACS آخر.
5. مشاركة FACS s تحليلق
- استخراج الحمض النووي الريبي:
- فور FACS، الخلايا الإيجابية والسلبية GFP الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 8 دقائق.
- ماصة بعناية طاف (عازلة فرز) وتجاهل.
- resuspend الكرية الخلية (بيليه ليس لأحجام العينات الموصى بها هنا المرئي) في 200 ميكرولتر Trizol.
- تجميد في -80 درجة مئوية أو تبدأ استخراج القياسية الفينول كلوروفورم لعزل إجمالي مرنا كما هو موضح سابقا لدينا مختبر 15.
- استخدام 50-200 نانوغرام من الحمض النووي الريبي لتخليق [كدنا] باستخدام Mastermix فقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تخضع [كدنا] إلى التضخيم PCR الكمي باستخدام تحقيقات IDT أوقات الذروة QPCR ضد علامات خلية الماوس البطانية (CD31، عامل فون ويلبراند (VWF))، وعلامات صمام خلية الخلالي (الأكتين العضلات السلس α (α-SMA)، Periostin (Postn))، العضلية علامات (Mhc6، Mhc7) وGAPDH.
- زراعة الفئران مركزنا:
- بعد FACS الفرز وجمع خلية (الخطوة 4.3)، وخلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- ماصة بعناية قبالة طاف (فرز عازلة + وسائل الاعلام) وتجاهل.
- resuspend الكرية خلية GFP إيجابية في 1 مل من وسائل الإعلام مركزنا وبيليه GFP سلبية في 1 مل سائل الإعلام غير البطانية.
- لوحة كل عينة في بئر واحدة من غرفة الشريحة البلاستيكية وتنمو حتى متموجة. الثقافة لحوالي 1 أسبوع لخلايا GFP السلبية لتصبح متكدسة وأكثر من 2 أسابيع للخلايا إيجابية GFP لتصبح متموجة (من عينة من 3 والفئران البالغين). تغيير وسائل الاعلام كل يومين.
- تلطيخ مناعي:
- إزالة وسائل الاعلام من الخلايا وإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لمدة 30 دقيقة في RT. غسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل حل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- إزالة الآبار غرفة من الشرائح وكتلة في 5٪ مصل بقري الزلال / 1X PBS لمدة 1 ساعة على RT.
- احتضانالشرائح O / N في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية (CD31، 1: 1،000 الأكتين أو العضلات السلس α (α-SMA)، 1: 100). غسل 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
- تمييع الضد الثانوية (اليكسا فلور 568 الماعز لمكافحة فأر) 1: 400 في برنامج تلفزيوني، إضافة إلى الشرائح، واحتضان 1 ساعة على RT. الشرائح شطف 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
- في جبل Vectashield التي تحتوي على دابي واحتضان 1 ساعة عند 4 درجات مئوية قبل عرض.
Representative Results
خلايا Tie2-GFP توطين شارك مع علامات الخلايا البطانية في صمامات القلب الجنينية والكبار.
من أجل تأكيد خصوصية Tie2-GFP التعبير في VECs من الفئران الجنينية والكبار، وقد أجريت المناعي لتحديد شارك في التعريب مع علامة الخلية البطانية، CD31 في أقسام الأنسجة المحضرة من E14.5 والكبار 3 أشهر من العمر Tie2-GFP الفئران باستخدام أساليب نشرت من قبل لدينا مختبر 16. كما هو مبين في الشكل 1، VECs شارك في التعبير عن GFP (الشكل 1 A، B، E، F) وCD31 (الشكل 1 C، D، E، F) في البالغين (الشكل 1 B، D، F) والجنينية ( الشكل 1 A، C، E) مراحل، وبالتالي التحقق من صحة نموذجنا للعزلة مركزنا اللاحقة.
حدد تحليل FACS متميزة السكان الخلية GFP إيجابي وسلبي GFP في صمامات القلب الجنينية والبالغة المعزولة من الفئران Tie2-GFP.
ر البريتم استخدام الفئران يب] C57 / BL6 لتعيين المعلمات GFP وحوالي 2٪ من الخلايا واحد بوابات من الفئران Tie2-GFP تظهر تخصيب كبير في الخلايا GFP إيجابية عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية في كل من عينات الجنينية والكبار (الشكل 2). استنادا إلى دراسات شارك في التعريب هو مبين في الشكل 1، وتعتبر هذه الخلايا VECs وتسفر بمتوسط 61800 مجموع الخلايا (تتراوح عينات من خلايا 39،000-77،000 / عينة) في عينات الكبار (ن = 3)، و8،928 الخلايا (8،015- 11،000 خلية / لتر) من القمامة واحدة من الأجنة E14.5.
يؤكد تحليل PCR من علامات تخصيب الخلية البطانية في الخلايا GFP إيجابية وصمام علامات الخلايا الخلالي في خلايا GFP السلبي معزولة عن الفئران Tie2-GFP.
تحليل الجينات التعبير عن GFP السكان الخلية الإيجابية والسلبية التي QPCR FACS التالية تظهر ملامح الجزيئية متميزة. مقارنة GFP السكان الخلية السلبية المعزولة من أجنة Tie2-GFP وأدولTS، وإثراء خلايا GFP إيجابية للتعبير عن البطانية علامات خلية CD31 وVWF، (الشكل 3). علاوة على ذلك، التعبير عن علامات العضلية (Myh6، Myh7) في هؤلاء السكان الخلية منخفض جدا، مما يدل على تلوث الأدنى من الخلايا غير البطانية. في المقابل، يتم إثراء خلايا GFP السلبية المعزولة من الكبار الفئران Tie2-GFP والأجنة E14.5 للصمام خلية الخلالي (VIC) علامات، وخلايا إيجابية α-SMA وPeriostin (POSTN) نسبة إلى GFP. إثراء هذه علامات أعلى في خلايا GFP السلبية المعزولة من عينات E14.5 مقارنة مع البالغين بسبب النمط الظاهري هادئة من فيكس الكبار والتعبير وبالتالي انخفاض علامات تفعيلها.
GFP إيجابية الخلايا المعزولة من الفئران الكبار Tie2-GFP يمكن تربيتها في المختبر.
تم فحص القدرة على ثقافة GFP خلايا الإيجابية والسلبية GFP المعزولة من عينات الكبار قاعدةد على مورفولوجيا الخلايا وتلطيخ المناعى. باستخدام بروتوكولات الموصوفة سابقا من قبلنا 17 نظهر في الشكل 4 أن الخلايا GFP إيجابية تظهر جولة في مورفولوجيا (الشكل 4A) وشارك في التعبير عن GFP مع علامة الخلية البطانية CD31 بعد أسبوعين في الثقافة (الشكل 4C). في المقابل، الخلايا غير البطانية سلبية لGFP، عرض مثل الوسيطة مورفولوجيا (الشكل 4B) والتعبير عن VIC علامة α-SMA بعد تسعة أيام (الشكل 4D).
الرقم 1. خلايا Tie2-GFP إيجابية شارك تعريب مع CD31 في صمامات القلب الجنينية والكبار. المناعي لإظهار رابطة (Tie2-) GFP التعبير (A، B) مع علامة الخلية البطانية، CD31 (C، D) في قمنشورات eptal من الصمام التاجي في E14.5 (A، C، E) والكبار (B، D، F) مراحل. وسلط الضوء على المنطقة في صمام A، C، E. (E، F) الصور المدمجة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويمكن تحديد الشكل 2. VECs Tie2-GFP إيجابية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. بالمقارنة مع الضوابط C57 / BL6 العمر المتطابقة (A، C)، وصمامات عزل من أجنة Tie2-GFP (B) والكبار (D) تحتوي على GFP- متميزة السكان الخلية إيجابي، كما هو مبين باللون الأخضر. تم جمع الأحداث GFP سلبية، كما هو موضح باللون الأحمر كمجموعة تحكم. الأرقام في (B) و (D) تشير إلى متوسط٪ من GFP فخلايا ositive من إجمالي عدد الأحداث مرتبة حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية (ن = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
يتم إثراء الشكل 3. خلايا GFP إيجابية للعلامات الخلايا البطانية في حين أن الخلايا GFP سلبية تعبر عن الجينات المرتبطة مع الخلايا الخلالي صمام. الممثل QPCR من علامات الخلايا البطانية (CD31، عامل فون ويلبراند (VWF)) والكبار (Myh6) والجنين ( Myh7) علامات العضلية في خلايا GFP إيجابية معزولة عن المناطق صمامي من E14.5 (A) والكبار (B) الفئران Tie2-GFP. ملاحظة إثراء علامات الخلية البطانية ومستويات منخفضة جدا من الجينات المرتبطة العضلية. (C، D) أضعاف تشاnges في التعبير عن صمام علامات الخلايا الخلالي α-SMA وPostn في خلايا GFP السلبي معزولة من E14.5 (C) والكبار (D) الفئران Tie2-GFP. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. خلايا Tie2-GFP إيجابية تحافظ التعبير عن علامات الخلايا البطانية في المختبر. بعد FACS، GFP إيجابي (A، C) والسلبية (B، D) سكان الخلية من الفئران الكبار والمثقفين حتى متموجة ويخضع للتخلص التصوير النقيض (A، B) والمناعية الفلورية (C، D). خلايا GFP إيجابية تعبر عن CD31 (أحمر) (C) بعد10 يوما للثقافة. في المقابل، لم يتم الكشف عن GFP التعبير في السكان الخلية السلبي الذي ملطخة إيجابية لα-SMA، علامة على تنشيط فيكس (D).
Discussion
نحن هنا وصف لأول مرة، وهي طريقة جديدة لعزل VECs الفئران الجنينية والكبار من الفئران Tie2-GFP. في حين أن هذا الخط الماوس استخدمت على نطاق واسع لعزل السكان الخلية البطانية، وهذا هو التقرير الأول يبين العزلة انتقائية من VECs. بسبب هشاشة من السكان مركزنا، وقد وضعنا بروتوكول صرامة التي تسمح لعزل خلية واحدة من GFP إيجابي (وGFP السلبية) صمامات القلب من خلايا الفئران الجنينية والكبار. مقارنة المنشور الأصلي باستخدام الأجنة أو الأعضاء كاملة من الفئران GFP Tie2-14، قمنا الأمثل كولاجيناز وتشريح الخطوات على أساس وفرة منخفضة من هذه الفئة من السكان الخلايا البطانية الهش لعزل السكان حدد من الخلايا.
سبق فقط تم الإبلاغ عن العزلة مركزنا في نماذج حيوانية كبيرة مع الأدوات الوراثية والجزيئية البيولوجية محدودة. يتم وضع هذه الأدوات جيدا في الفئران وبالتالي فإن أبيعنه lity لعزل VECs الفئران يسمح لمجموعة موسعة من التصاميم التجريبية لاستخدامها في البحوث صمام القلب. ولذلك، ميزة كبيرة لهذا النهج هو أن VECs يمكن عزل زمنيا من نوع الفئران البرية، ونماذج من الأمراض والإصابات صمام. والميزة الثانية هي أن VECs يمكن عزل وتحليلها على الفور تقريبا بعد تشريح، والحفاظ على أنماط التعبير التي تعكس الوضع في الجسم الحي بشكل أكثر دقة. علاوة على ذلك، هذا البروتوكول العزلة كافية للقضاء على زراعة الخلايا للتوسع عدد والتغيرات المظهرية بالتالي المحتملة الناجمة عن البيئة في المختبر يتم منعها.
على الرغم من المستجدات والفوائد التجريبية من هذا البروتوكول، ونحن ندرك أن القيود لا تزال موجودة. أولا، وحجم السكان مركزنا ضمن صمامات الفئران صغيرة جدا، وبالتالي، هناك حاجة إلى عدة الفضلات الجنينية في الوقت المناسب من أجل توليد RNA كافية لتحليل التعبير الجيني. بينما ثيق يمكن التغلب عليها باستخدام مربي متعددة، يمكن أن يكون لها تأثير على تطبيق بعض أدوات التحليل بعد العزلة. وكان هذا القيد تحديا بشكل خاص لتكوين الثقافات متموجة من VECs GFP إيجابية من أجل إجراء المزيد من التحليلات وافية من الظواهر مركزنا بما في ذلك التشكيلات الجزيئية والمقايسات الفنية. ولنعترف أن ليس كل الصعوبات التي تم التغلب على نهجنا ولكن هذا هو مجال اهتمام أننا نسعى إلى التغلب عليها.
هذا النهج من عزل VECs من مناطق صمامي يقدم إمكانية حدوث تلوث من التعادل GFP خلايا -positive، غير صمامي البطانية من البطانة، أو هياكل الأوعية الدموية داخل عضلة القلب البطيني. حتى الآن، لم يتم التعرف التمييز الجزيئي للVECs من غيرهم من السكان الخلايا البطانية القلب. لكن منطقة محسن من الجين Nfatc1 تم التعرف وأظهرت لتسمية تحديدا VECs التي لاالخضوع EMT، وليس السكان الخلية البطانية الآخرين داخل القلب 18. كنموذج لجنة المساواة العرقية (Nfatc1 enCre) هو متاح، يمكن أن الدراسات المستقبلية الاستفادة من خصوصية هذا الخط لتقليل مخاطر التلوث. بالإضافة إلى خلايا إيجابية Tie2-GFP- غير صمامي، هناك دائما إمكانية حدوث تلوث من myocytes عند النقطة التي نعلق منشورات صمام إلى المنطقة الحلقي من الحاجز والجدران عضلة القلب الجدارية. في البيانات لا تظهر هنا، بدأنا في البداية دراسات لعزل VECs من مناطق صمامي تشريح باستخدام الخرز الأجسام المضادة مترافق مع المغلفة مكافحة GFP ومكافحة CD31. بينما كان هذا النهج الناجح لعزل الخلايا البطانية، عانينا من تكتل كبير من الخلايا المجاورة أنواع الخلايا، غير البطانية وبالتالي فيكس وخلايا عضلة القلب ملوثة العينة التجريبية لدينا. تم تجنب ذلك باستخدام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية حيث تم تعيين المعلمات لعزل الوحيد تعليق خلية واحدةق وتحليل PCR للكشف تمت السيطرة التعبير عن الجينات العضلية محددة لهذا القيد (الشكل 3). بينما تلوث دينا يمكن اعتبار الحد الأدنى و، يبقى التعقيد التجريبي المحتملة التي يمكن تجنبها في المستقبل مع اختيار مزدوجة من GFP وعلامات سطح الخلية البطانية محددة.
باستخدام هذا البروتوكول، لدينا VECs معزولة بنجاح من الفئران الجنينية والكبار وقدمت أمثلة للكيفية التي يمكن أن تستخدم هذا الأسلوب لعزل الحمض النووي الريبي والثقافة خلية GFP السكان الخلية الإيجابية والسلبية GFP. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يقتصر على هذه التطبيقات، ويمكن استخدامها لمجموعة كبيرة من الأساليب الجزيئية، الخلوية والوظيفية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون ولدت الخلفية Tie2-GFP مع نماذج الماوس الوراثية من شأنها أن تسمح للدراسات المقارنة للسكان VEC في الصحة والمرض. فإن تطوير هذه المنهجية الجديدة، لأول مرة، والسماح للدراسات مركزةدراسة مساهمة VECs في تطوير صمام وصيانة، ويمكن أن تكشف عن آليات تأخذ حقها من التقييم سابقا من مرض صمام تعتمد على البطانية.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر مرفق جامعة ولاية أوهايو مركز السرطان الشامل تحليلية الخلوي الأساسية، وتحديدا كاترينا مور، للمساعدة التقنية مع تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. وبالإضافة إلى ذلك فإننا ندرك الدكتور ويليام بو وجماعته للرؤى العلمية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL091878 (JL) ومركز القلب في مستشفى الأطفال على الصعيد الوطني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5 M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning cellgro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11 cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T.
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
