Introduction
Den modne ventil er sammensat af tre lagdelte lag af specialiserede ekstracellulære matrix (ECM) afbrudt med ventil interstitielle celler (vics) og indkapslet af et enkelt lag af hjerteklap endotelceller (VECs) 1. Rolle ECM er at tilvejebringe alle de nødvendige biomekaniske egenskaber til at modstå konstante ændringer i hæmodynamiske kraft i hjertets cyklus. Omsætningen af ventilen ECM i den voksne ventilen er stramt reguleret af Vics, der stort set hvilende og fibroblast-lignende i fravær af sygdom. Ud over VIC befolkning, hjerteklap endotelceller (VECs) udgør en uafbrudt endotel over overfladen af ventil spidserne 2. Mens betydningen af ECM og Vics til ventil struktur og funktion er blevet beskrevet af os og andre, er den rolle, VECs mindre kendt. Men dette forholdsvis lille cellepopulation er kritisk for ventil dannelse i embryoet og beskrives som dysfunktionel ventilsygdom.
Hjerteklap dannelse i fosteret begynder, når en delmængde af endotelceller inden for de atrioventrikulære kanalen og udstrømning tarmkanalen regioner gennemgå endotel til mesenkymale omdannelse (EMT) og danner hævelser kendt som endokardiale puder 1,3. De nyligt transformerede mesenchymal-celler i disse strukturer senere differentiere til vics og danne modne ventiler. Når EMT er færdig, endotelceller omgiver puder, betegnet VECs danner en uafbrudt endotelcelle lag, der beskytter det modne ventil mod skade. Desuden fornemmer VECs hæmodynamiske miljø og har vist sig at molekylært kommunikere med underliggende vics at regulere ECM homeostase 1,3. I syge ventiler er VEC monolag forstyrret i forbindelse med unormale ændringer i ECM organisation og ændret biomekanik 4,5. Hertil kommer, at studier i musemodeller tyder på, at VEC dysfunktion er den underliggende årsag til ventil disease 1,6-9. Som VECs spiller en vigtig rolle i ventil udvikling, vedligeholdelse og sygdom, er det vigtigt, at vi definerer deres timelige fænotyper fuldt ud for at fremme feltet og forstå mekanismerne i sygdommen.
Tidligere arbejde af flere laboratorier har med held isoleret VECs fra svin og får modeller 10-12. På grund af den store størrelse af disse ventiler, isolationer gennem podning og / eller enzymatisk spaltning efterfulgt af en række forskellige isoleringsmetoder herunder magnetisk perle celleseparation og enkelt celle klonal ekspansion har været effektiv til at frembringe rene populationer 11-13. Dog kan disse modeller være begrænsende på grund af ufuldstændige Angivelse af svin og får genomer begrænser tilgængeligheden af molekylære værktøjer i tillæg til de høje omkostninger. Derfor forsøg med svin og får VECs efter isolering kan være restriktiv. Musemodeller er at foretrække på grund af de mange muligheder for genetisk manipulation og molekylære værktøjer i embryo og voksne, men til dato er der ingen VEC isolationer i små dyremodeller er blevet rapporteret. Dette er sandsynligvis på grund af vanskeligheden ved at arbejde med små vævsprøver, der omfatter et mindretal cellepopulation, der på nuværende tidspunkt mangler unikke identitet VEC-specifikke markører, for derved at forhindre antistofbaserede isoleringsmetoder.
I denne artikel rapporterer vi en ny metode til direkte isolering af murine VECs på embryonale og voksne stadier. Denne protokol udnytter Tie2-GFP-mus, der udtrykker GFP i alle endotelceller celletyper og er blevet grundigt anvendes til at studere endotel cellepopulationer 14. Nyhed af denne aktuelle undersøgelse er imidlertid, at disse mus, for første gang er blevet anvendt til at isolere endothelceller fra ventilerne. Ved omhyggelig dissektion af ventilen væv og en serie på ni enzymatiske spaltninger efterfulgt af FACS-sortering kan VECs isoleres og anvendes til forskellige eksperimentelle teknikker icluding RNA-ekstraktion og kultur, direkte efter sortering.
Protocol
1. Fremstilling af udstyr og løsninger
- Sterilisere dissektion værktøjer - fine væv saks til at udtrække voksne hjerter og 2 fine tænger til dissektion af valvulær region - ved autoklavering i en overdækket instrument bakke. Spray værktøjer med 70% ethanol (EtOH) før dissektion.
- Forbered alle opløsninger umiddelbart forud for forsøget, og der steriliseres løsninger ved at lede dem gennem et sterilt 0,2 um filter. Hold løsninger på is indtil brug.
- Steril Dissociation Buffer (15 ml alt / prøve). Kombiner 1,2 ml collagenase IV, 300 pi 2,5% trypsin og 150 pi chick serum. Bring volumen op til 15 ml med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Steril Sortering Buffer (12 ml i alt). Kombiner 25 pi 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 12 ul DNase I (RNase-frit). Bring volumen op til 12 ml med HBSS.
- VEC Kultur Medier. Mix endotel GroGJ medier i overensstemmelse med producentens instruktioner (se materiale regneark) efter tilsætning af alikvoter komponenter fra sættet til 500 ml EBM2 medier.
- GFP Negativ Dyrkningsmedier (ikke-endotelcelle medier). Bland 445 ml Medium 199 1x med 5 ml penicillin / streptomycin (pen / strep) (1% slutkoncentration) og 50 ml FBS (10% slutkoncentration).
2. dissektion af Valvular regionen fra voksne mus og E14.5 embryoer
- Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med The Nationwide Børnehospital Research Institute IACUC retningslinjer.
- Tie2-GFP-mus blev indkøbt fra Jackson Laboratories (varenr 003658) 14 og blev opretholdt som homozygote genotyper på en FVB / N baggrund, og dermed sikre, at alle off-forår Express GFP i Tie2-positive endotelceller.
- For FACS sortering, forberede en alder matchede negativ Sample, der ikke indeholder GFP såsom C57 / BL6 at indstille GFP gate parametre for FACS-sortering. BEMÆRK: Denne protokol og repræsentative resultater er baseret på anvendelse af tre, fire måneder gamle voksne mus eller et kuld på embryonal dag (E) 14.5.
- Voksne mus: Umiddelbart efter aflivning af CO 2 iltmangel, bruge dissektion saks til forsigtigt at åbne brysthulen og udsætte hjertet og lungerne. Når udsatte, greb hjertet med en pincet på de store arterier og trække sig væk fra kroppen. Fjern lungevæv hvis intakt og placere hjerter i kold HBSS at skylle. Fjern ventriklen og trække væk forkamre forlader atrioventrikulær kanalen 'ringen' og aorta regioner intakt. Lav en snit ned langs siden af atrioventrikulær kanalen til at åbne op for "ringen" og blotlægge valvulær strukturer. Fjern myokardiet og proksimale aorta regioner ved forsigtigt at drille væk med en pincet. Identificer ventilblade som hvid, tæt væv over lyserød myokardiet. Deta forsigtigtch chordae tendinae fra atrieventrikelklapperne og fjerne så meget af det resterende myokardium som muligt. Vær forsigtig ikke at trække eller skrabe ventil foldere i løbet af denne proces, da VECs kan forrykke sig. Placer trimmede valvulær regioner i et 1,5 ml Eppendorf-rør indeholdende 1 ml HBSS og holde på is. BEMÆRK: Forsigtig dissektion er afgørende for at fjerne nonvalvulær endotelceller, der kunne forurene prøven.
- Embryoner: Sacrifice hunmus 14,0 dage efter samleje stikket er observeret (morgen samleje stik = 0,5 dage).
- Umiddelbart efter aflivningen dissekere livmoderen (indeholdende embryoner) og vaskes i koldt HBSS. Dissekere individuelle embryoner fra livmoderen og fjern embryonale blommesæk omgiver hvert foster. Fjern hjerter fra hver af embryonerne og følg trin 2.1. (BEMÆRK: forsigtigt at klemme embryonet med pincet lige under den øverste vedhæng bør medvirke til at afsløre hjerte og gøre fjernelse nemmere.)
- Brug sterile pipettespidser, fjerne HBSS fra eppendorfrør indeholder valvulær regioner.
- Udskift med 1 ml dissociation buffer og 4 pi DNase I.
- Drej rørene ved 37 ° C i 7 min.
- Pipette op og ned 3 gange og så lade prøven nøjes med 15 sek. Opsaml supernatanten (indeholdende de dissocierede celler) i en 15 ml konisk rør.
- For at stoppe collagenasen reaktionen, tilsættes 125 ul hesteserum til samlingen røret. Hold samling rør på is.
- Gentag dissociation trin (3,2 til 3,5) ni gange at indsamle ni fraktioner af supernatanten.
- Passere fraktioneret indsamling gennem et 70 um nylon filter over i en ny kollektion røret for at sikre en enkelt celle suspension ved at fjerne eventuelle rester og klumper.
- Spin suspensionen ved 400 g i 5 minutter for at pelletere cellerne.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml Sortering Buffer ogholde på is, indtil FACS.
4. FACS-sortering GFP positive VECs
- Sæt porte for forlæns og sidespredning at udelukke snavs og fange enkelte celler; udelukke dubletter ved hjælp af gating dublet diskrimination. Optag den negative kontrolprøve og definere gate indstillinger for at sammenligne og præcist definere GFP-positive celle befolkning i Tie2-GFP prøve.
- Analyser GFP-positive celler via FACS og forfine gate indstillinger.
- Sortere Tie2-GFP prøve og indsamle både GFP-positive og GFP-negative celler. Hvis celler vil blive anvendt til RNA-ekstraktion, sortere direkte i Sortering bufferen. Til dyrkning af celler efter FACS indsamle GFP-positive celler i et sterilt rør indeholdende 1 ml VEC medier med 1 ml FBS, og indsamle GFP-negative celler i 1 ml ikke-endotel medier med 1 ml FBS. Brug denne 50% media / 50% serum kombination for at forbedre cellelevedygtighed. Hold på is indtil post-FACS-analyse.
5. Indlæg FACS analysis
- RNA-ekstraktion:
- Umiddelbart efter FACS, centrifuge GFP positive og negative celler ved 1.500 xg i 8 min.
- Pipette forsigtigt supernatanten (sortering buffer) og kassér.
- Resuspender cellepelleten (pellet er ikke synlige for stikprøvestørrelser anbefales her) i 200 pi Trizol.
- Fryse ved -80 ° C eller begynde standard phenol-chloroform ekstraktion til isolering af totalt mRNA som tidligere beskrevet af vores laboratorium 15.
- Brug 50-200 ng af RNA til cDNA-syntese ved hjælp af Mastermix i henhold til producentens anvisninger.
- Om cDNA til kvantitativ PCR amplifikation ved anvendelse af IDT Primetime qPCR prober mod muse endotel cellemarkører (CD31, von Willebrand Factor (vWF)), ventil interstitiel cellemarkører (α-glat muskulatur actin (α-SMA), Periostin (Postn)), myocyt markører (Mhc6, Mhc7) og GAPDH.
- Dyrkning Murin VEC:
- Efter FACS sortering og celleudtagningsmetoden (trin 4.3), centrifuge-celler ved 300 xg i 5 min.
- Pipette forsigtigt supernatanten (sortering buffer + medier) og kassér.
- Resuspender GFP-positive cellepelleten i 1 ml VEC medier og GFP-negative pellet i 1 ml ikke-endotel medier.
- Plate hver prøve i en brønd i en plastik kammer dias og vokse, indtil sammenflydende. Kultur for omkring 1 uge for GFP-negative celler til at blive sammenflydende, og mere end 2 uger for GFP-positive celler til at blive sammenflydende (fra en prøve af 3 voksne mus). Skift medier hver to dage.
- Immunfluorescensfarvning:
- Fjern medier fra cellerne og løse i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter ved stuetemperatur. Vask fikserede celler tre gange i 5 min hver i phosphatpufret saltopløsning (PBS).
- Fjern kammer brønde fra dias og blokeret 5% bovint serumalbumin / 1x PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuberdias O / N-ved 4 ° C med primære antistoffer (CD31, 1: 1.000 eller α-glat muskulatur actin (α-SMA), 1: 100). Vask 3 x 5 min i PBS.
- Fortynd det sekundære antistof (Alexa-Fluor 568 gede anti-rotte) 1: 400 i PBS tilsættes til objektglas og inkuberes 1 time ved stuetemperatur. Skyl objektglassene 3x i 5 min i PBS.
- Montering i Vectashield-holdige DAPI og inkuber i 1 time ved 4 ° C forud for visning.
Representative Results
Tie2-GFP-celler co-lokalisere med endothelceller cellemarkører i embryonale og voksne hjerteklapper.
For at bekræfte specificiteten af Tie2-GFP-ekspression i VECs fra embryoniske og voksne mus blev immunofluorescens udført for at bestemme co-lokalisering med endotelcelle markering, CD31 i vævssnit fremstillet ud fra E14.5 og 3 måned gammel voksen Tie2-GFP mus under anvendelse af metoder, der tidligere er offentliggjort af vores laboratorium 16. Som vist i figur 1, VECs co-express GFP (Figur 1 A, B, E, F) og CD31 (figur 1 C, D, E, F) ved både voksne (figur 1 B, D, F) og embryonale ( Figur 1 A, C, E) trin, således validere vores model for efterfølgende VEC isolation.
FACS-analyse identificerede forskellige GFP-positive og GFP-negative cellepopulationer i embryonale og voksne hjerteklapper isoleret fra Tie2-GFP mus.
Vild type C57 / BL6 mus blev anvendt til at indstille GFP parametre og cirka 2% af enkelt-gatede celler fra Tie2-GFP-mus viser en betydelig berigelse i GFP-positive celler ved FACS-analyse i både embryonale og voksne prøver (figur 2). Baseret på co-lokalisering undersøgelser vist i figur 1, er disse celler betragtes VECs og giver et gennemsnit på 61.800 totale celler (prøver spænder fra 39,000-77,000 celler / prøve) hos voksne prøver (n = 3), og 8,928 celler (8,015- 11.000 celler / kuld) fra et kuld af E14.5 embryoer.
PCR-analyse bekræfter berigelse af endotelcellespecifikke markører i GFP-positive celler og ventil interstitielle celle markører i GFP-negative celler isoleret fra Tie2-GFP mus.
Genekspression analyse af GFP-positive og negative cellepopulationer efter qPCR følgende FACS viser distinkte molekylære profiler. Sammenlignet med GFP negativ cellepopulationer isoleret fra Tie2-GFP-embryoner og Adults, er GFP positive celler beriget til ekspression af endotel cellemarkører CD31 og vWF (Figur 3). Endvidere ekspression af myocyt markører (Myh6, Myh7) i disse cellepopulationer er meget lav, hvilket viser minimal forurening af ikke-endotelceller. I modsætning hertil er GFP negative celler isoleret fra voksne Tie2-GFP mus og E14.5 embryoer beriget for ventil interstitiel celle (VIC) markører, α-SMA og Periostin (POSTN) i forhold til GFP-positive celler. Berigelse af disse markører er højere i GFP negative celler isoleret fra E14.5 prøver sammenlignet med voksne på grund af den hvilende fænotype af voksne Vics og derfor lav ekspression af aktiverede markører.
GFP-positive celler isoleret fra Tie2-GFP voksne mus kan dyrkes in vitro.
Evnen til kultur GFP-positive og GFP-negative celler isoleret fra voksne prøver blev undersøgt basend på cellemorfologi og immunhistokemisk farvning. Brug af protokoller, der tidligere er beskrevet af os 17 viser vi i figur 4, at GFP-positive celler vises rundt i morfologi (figur 4A) og co-udtrykke GFP med endotelcelle markør CD31 efter to uger i kultur (figur 4C). I modsætning hertil ikke-endotelceller er negative for GFP, vise en mesenchymale-lignende morfologi (figur 4B) og udtrykke VIC markør α-SMA efter ni dage (figur 4D).
Figur 1. Tie2-GFP-positive celler co-lokalisere med CD31 i embryoniske og voksne hjerteklapper. Immunofluorescens at vise associering (Tie2-) GFP-ekspression (A, B) med endotelcelle markering, CD31 (C, D) i af septal foldere af mitralklappen ved E14.5 (A, C, E) og voksne (B, D, F) etaper. Ventilen region er fremhævet i A, C, E. (E, F) Flettede billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tie2-GFP-positive VECs kan identificeres ved FACS. Sammenlignet alderskategori C57 / BL6 knapperne (A, C), ventiler isoleret fra Tie2-GFP-embryoner (B) og voksne (D) indeholder en særskilt GFP- positiv cellepopulation, som anført i grøn. GFP-negative begivenheder, der er vist i rødt blev opsamlet som en kontrol. Tal i (B) og (D) viser den gennemsnitlige% af GFP-positive celler fra det samlede antal hændelser Weaver FACS (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. GFP-positive celler er beriget for endotheliale cellemarkører hvorimod GFP-negative celler udtrykker gener, der er forbundet med ventil interstitielle celler. Repræsentant qPCR af endotelceller markører (CD31, von Willebrand Factor (vWF)) og voksne (Myh6) og føtale ( Myh7) myocyt markører i GFP-positive celler isoleret fra skallerne regioner E14.5 (A) og voksen (B) Tie2-GFP-mus. Bemærk berigelse af endotelceller markører og meget lave niveauer af myocyt-associerede gener. (C, D) Fold changes i ekspression af ventil interstitielle cellemarkører α-SMA og Postn i isolerede GFP-negative celler fra E14.5 (C) og voksen (D) Tie2-GFP-mus. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Tie2-GFP-positive celler opretholder udtryk for endotelcellespecifikke markører in vitro. Efter FACS, GFP-positive (A, C) og negative (B, D) cellepopulationer fra voksne mus blev dyrket indtil sammenflydende og underlagt fase kontrast imaging (A, B) og fluorescerende immunfarvning (C, D). GFP-positive celler udtrykker CD31 (rød) (C) efter10 dages kultur. I modsætning hertil blev GFP-ekspression ikke påvist i negativ cellepopulation, som farves positivt for α-SMA, en markør for aktiverede vics (D).
Discussion
Her beskriver vi for første gang, en hidtil ukendt fremgangsmåde til isolering af embryoniske og voksne murine VECs fra Tie2-GFP-mus. Mens denne mus linje er blevet udstrakt anvendt til isolering af endothelceller cellepopulationer, dette er den første rapport, der viser selektiv isolering af VECs. På grund af den skrøbelige VEC befolkning, har vi udviklet et stringent protokol, der giver mulighed for enkelt celle isolering af GFP-positive (og GFP negativ) celler fra hjerteklapper af embryonale og voksne mus. Sammenlignet med den originale publikation anvendelse af hele embryoer eller organer fra Tie2-GFP-mus 14, har vi optimeret collagenase og dissektion trin baseres på den lave forekomst af denne skrøbelige endotelcelle befolkning at isolere en udvalgt population af celler.
VEC isoleringer er tidligere kun blevet rapporteret i store dyremodeller med begrænsede genetiske og biomolekylære værktøj. Disse værktøjer er veletableret i mus, og derfor ABIheden at isolere murine VECs giver mulighed for en udvidet sæt af eksperimentelle design, der skal anvendes til hjerteklap forskning. Derfor er en væsentlig fordel ved denne fremgangsmåde er, at VECs kan isoleres tidsmæssigt fra vildtypemus, og modeller af ventil sygdom og skade. En anden fordel er, at VECs kan isoleres og analyseres næsten umiddelbart efter dissektion, bevare ekspressionsmønstre, der afspejler in vivo-situationen mere nøjagtigt. Endvidere denne isolation protokol er tilstrækkelig til at fjerne cellekultur efter nummer ekspansion og derfor potentielle fænotypiske ændringer induceret af in vitro miljøet forhindres.
På trods af de nyheder og eksperimentelle fordele ved denne protokol, anerkender vi, at begrænsninger stadig eksisterer. Først størrelse VEC befolkning i murine ventiler er meget lille, og derfor er der behov for flere timede embryonale kuld for at generere tilstrækkelig RNA til genekspression analyse. Mens thir kan overvindes ved hjælp af flere opdrættere, kan det have indflydelse på anvendelsen af nogle post-isolation analyseværktøjer. Denne begrænsning har været en udfordring især for oprettelse sammenflydende kulturer af GFP-positive VECs for at udføre flere grundige analyser af VEC fænotyper herunder molekylære profiler og funktionelle assays. Anerkender derfor, vi, at ikke alle problemer er blevet overvundet af vores tilgang, men dette er et område af interesse, at vi stræber efter at overvinde.
Denne tilgang isolere VECs fra skallerne regioner indfører muligheden for forurening fra Tie-GFP-positive, ikke-valvulær endotelceller endocardium eller vaskulære strukturer i den ventrikulære myocardium. Til dato har molekylære skelnen af VECs fra andre kardiale endotelcellespecifikke populationer ikke blevet identificeret. Imidlertid en enhancer region af Nfatc1 genet er blevet identificeret og har vist at specifikt mærke VECs der ikkeunderkastes EMT, og ingen andre endotelcelle befolkning i hjertet 18. Som en CRE model (Nfatc1 Encre) er tilgængelig, kan fremtidige undersøgelser udnytte specificiteten af denne linje for at minimere risikoen for forurening. Ud over nonvalvulær Tie2-GFP- positive celler, er der altid muligheden for forurening fra myocytter ved det punkt, hvor ventilblade Sammen med det ringformede område af septal og vægmaleri myokardie vægge. I data, der ikke er vist her, vi begyndte oprindeligt undersøgelser for at isolere VECs fra dissekerede valvulær områder med antistof-konjugerede perler overtrukket med anti-GFP-og anti-CD31. Mens denne tilgang var en succes til isolering endothelcellerne, oplevede vi en betydelig celle sammenklumpning fra tilstødende, ikke-endotel celletyper og dermed Vics og myokardieceller forurenet vores eksperimentelle prøve. Dette er undgået ved hjælp af FACS-analyse som parametre er blevet indstillet til at isolere kun enkelt cellesuspensions og PCR-analyse til påvisning af ekspression af myocyt-specifikke gener er kontrolleret for denne begrænsning (figur 3). Mens vores forurening kan anses som minimal, er det stadig en potentiel eksperimentel kompleksitet, som kunne undgås i fremtiden med den dobbelte udvælgelse af GFP og endotelcellespecifikke overflademarkører.
Ved hjælp af denne protokol, har vi med succes isolerede VECs fra embryonale og voksne mus og gav eksempler på, hvordan denne metode kan anvendes til RNA-isolering og cellekultur af GFP-positive og GFP negativ cellepopulationer. Imidlertid er denne fremgangsmåde ikke er begrænset til disse anvendelser, og kan anvendes til en overflod af molekylære, cellulære og funktionelle metoder. Derudover kan Tie2-GFP baggrund blive avlet med genetiske musemodeller, der vil give mulighed for sammenlignende studier af VEC befolkninger i sundhed og sygdom. Udviklingen af denne nye metode vil for første gang mulighed for fokuserede undersøgelserundersøge bidrag VECs ventil udvikling og vedligeholdelse og kan afsløre hidtil miskendte mekanismer endotel-afhængig ventil sygdom.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ohio State University Omfattende Cancer Center Analytisk cytometri Core facilitet, specielt Katrina Moore, til teknisk bistand med FACS-analyse. Derudover anerkender vi Dr. William Pu og hans gruppe for deres videnskabelige indsigter. Dette arbejde blev støttet af NIH HL091878 (JL) og hjertecentret på Nationwide Børnehospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5 M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning cellgro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11 cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T.
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
