Introduction
परिपक्व वाल्व हृदय वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs) 1 की एक परत द्वारा विशेष कोशिकी वाल्व बीचवाला कोशिकाओं (Vics) के साथ interspersed मैट्रिक्स (ईसीएम) और समझाया की तीन स्तरीकृत परतों से बना है. ईसीएम की भूमिका हृदय चक्र के दौरान hemodynamic बल में निरंतर परिवर्तन का सामना करने के लिए सभी आवश्यक biomechanical गुण प्रदान करना है. वयस्क वाल्व में वाल्व ईसीएम का कारोबार कसकर काफी हद तक मौन और रोग की अनुपस्थिति में fibroblast की तरह कर रहे हैं कि Vics द्वारा नियंत्रित किया जाता है. विक जनसंख्या के अलावा, हृदय वाल्व endothelial कोशिकाओं (VECs) वाल्व cusps 2 की सतह पर एक निरंतर अन्तःचूचुक के रूप में. वाल्व संरचना और समारोह के लिए ईसीएम और Vics के महत्व को हमें और दूसरों के द्वारा वर्णित किया गया है, VECs की भूमिका कम अच्छी तरह से जाना जाता है. हालांकि, इस अपेक्षाकृत छोटे सेल आबादी भ्रूण में वाल्व गठन के लिए महत्वपूर्ण है और वाल्व में बेकार के रूप में वर्णित किया गया हैरोग.
Atrioventricular नहर और बहिर्वाह पथ क्षेत्रों के भीतर endothelial कोशिकाओं के एक सबसेट mesenchymal परिवर्तन (EMT) और endocardial तकिये 1,3 के रूप में जाना जाता फार्म सूजन को endothelial गुजरना जब भ्रूण में हृदय वाल्व गठन शुरू होता है. इन संरचनाओं के भीतर नव तब्दील mesenchymal कोशिकाओं बाद में VICS में अंतर और परिपक्व वाल्व के रूप में. EMT पूरा हो गया है एक बार, कुशन आसपास के endothelial कोशिकाओं, VECs करार दिया चोट के खिलाफ परिपक्व वाल्व की रक्षा करता है कि एक निरंतर endothelial सेल परत के रूप में. इसके अलावा, VECs hemodynamic पर्यावरण भावना और ईसीएम 1,3 homeostasis को विनियमित करने के लिए अंतर्निहित Vics साथ संवाद molecularly दिखाया गया है. रोगग्रस्त वाल्व में, ग्राम शिक्षा समिति के monolayer ईसीएम संगठन में असामान्य परिवर्तन और बायोमेकेनिक्स 4,5 के सहयोग से बाधित है. इसके अलावा, माउस मॉडल में पढ़ाई ग्राम शिक्षा समिति में शिथिलता वाल्व डी का मूल कारण है कि सुझाव हैisease 1,6-9. VECs वाल्व विकास, रखरखाव, और रोग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, यह हम पूरी तरह से क्षेत्र अग्रिम और रोग के तंत्र को समझने के क्रम में उनके अस्थायी phenotypes को परिभाषित है कि महत्वपूर्ण है.
कई प्रयोगशालाओं द्वारा पिछले काम को सफलतापूर्वक सुअर और ovine मॉडल 10-12 से VECs अलग है. कारण ये वाल्व के बड़े आकार के लिए, चुंबकीय मनका सेल जुदाई और एकल कक्ष क्लोनल विस्तार शुद्ध आबादी 11-13 उत्पन्न करने के लिए प्रभावी किया गया है सहित विभिन्न अलगाव तरीकों की एक संख्या के बाद, swabbing और / या enzymatic पाचन के माध्यम से isolations. हालांकि, इन मॉडलों की वजह से उच्च लागत के अलावा आणविक उपकरणों की उपलब्धता सीमित सुअर और भेड़ जीनोम का अधूरा टिप्पणी करने के लिए प्रतिबंधात्मक हो सकता है. इसलिए अलगाव के बाद सुअर और ovine VECs का प्रयोग प्रतिबंधात्मक हो सकता है. माउस मॉडल कारण आनुवंशिक manipula लिए कई संभावनाओं को बेहतर कर रहे हैंtion और भ्रूण और वयस्क में आणविक उपकरण, लेकिन आज तक, छोटे पशु मॉडल में कोई ग्राम शिक्षा समिति isolations सूचित किया गया है. इस वजह से फिलहाल जिससे एंटीबॉडी आधारित अलगाव तरीकों को रोकने, ग्राम शिक्षा समिति के विशेष मार्कर की अद्वितीय पहचान की कमी है कि एक अल्पसंख्यक सेल की आबादी शामिल है कि छोटे ऊतकों के नमूनों के साथ काम करने की कठिनाई होने की संभावना है.
इस अनुच्छेद में, हम भ्रूण और वयस्क चरणों में murine VECs के प्रत्यक्ष अलगाव के लिए एक नई विधि की रिपोर्ट. इस प्रोटोकॉल सभी endothelial प्रकार की कोशिकाओं में व्यक्त GFP और बड़े पैमाने पर endothelial सेल आबादी 14 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है जो Tie2-GFP चूहों, का लाभ लेता है. हालांकि, इस मौजूदा अध्ययन की नवीनता के लिए पहली बार इन चूहों, वाल्व से endothelial कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग किया गया है. वाल्व ऊतक और FACS छँटाई के द्वारा पीछा नौ एंजाइमी digestions की एक श्रृंखला से सावधान विच्छेदन करके, VECs अलग किया जा सकता है और में विभिन्न प्रयोगात्मक तकनीक के लिए इस्तेमाल कियासीधे छँटाई के बाद, शाही सेना निष्कर्षण और संस्कृति समेत.
Protocol
उपकरण और समाधान की 1. तैयारी
- विच्छेदन उपकरण जीवाणुरहित - autoclaving द्वारा एक कवर साधन ट्रे में - वाल्वुलर क्षेत्र के विच्छेदन के लिए वयस्क दिल और 2 ठीक संदंश निकालने के लिए ठीक ऊतक कैंची. 70% इथेनॉल (EtOH) विच्छेदन के लिए पहले से उपकरण स्प्रे.
- तुरंत प्रयोग करने से पहले सभी समाधान तैयार है और एक बाँझ 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से उन्हें पारित करके समाधान बाँझ. उपयोग करें जब तक बर्फ पर समाधान रखें.
- बाँझ हदबंदी बफर (15 मिलीलीटर कुल / नमूना). 1.2 मिलीलीटर collagenase चतुर्थ, 300 μl 2.5% trypsin और 150 μl लड़की सीरम का मिश्रण. हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ 15 मिलीलीटर मात्रा को ले आओ.
- बाँझ छंटनी बफर (12 एमएल कुल). 25 μl 0.5 एम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और 12 μl DNase जुडा मैं (RNase मुक्त). HBSS के साथ 12 मिलीलीटर मात्रा को ले आओ.
- ग्राम शिक्षा समिति के संस्कृति मीडिया. मिक्स endothelial groEBM2 मीडिया के 500 मिलीलीटर के लिए किट से aliquoted घटक जोड़कर निर्माता के निर्देशों (सामग्री स्प्रेडशीट देखें) के अनुसार मीडिया wth.
- GFP नकारात्मक संस्कृति मीडिया (गैर endothelial सेल मीडिया). पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / strep) की 5 मिलीग्राम (1% अंतिम एकाग्रता) और 50 मिलीलीटर FBS (10% अंतिम एकाग्रता) के साथ मध्यम 199 1x की 445 मिलीलीटर मिलाएं.
वयस्क चूहों और E14.5 भ्रूण से वाल्वुलर क्षेत्र के 2 विच्छेदन
- सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल अनुसंधान संस्थान IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
- Tie2-GFP चूहों जैक्सन लेबोरेटरीज (स्टॉक संख्या 003658) 14 से खरीदे गए थे और एक FVB / एन पृष्ठभूमि पर समयुग्मक जीनोटाइप के रूप में बनाए रखा गया है, और इसलिए यह सुनिश्चित करना है कि Tie2 पॉजिटिव endothelial कोशिकाओं में बंद सभी वसंत व्यक्त GFP.
- FACS छँटाई के लिए, एक उम्र मिलान नकारात्मक samp तैयारऐसे C57 / BL6 के रूप में GFP शामिल नहीं है कि Le FACS छँटाई के लिए GFP फाटक मानकों सेट करने के लिए. नोट: इस प्रोटोकॉल और प्रतिनिधि परिणाम तीन, चार महीने की उम्र में वयस्क चूहों या भ्रूण दिन (ई) 14.5 से कम एक कूड़े के प्रयोग पर आधारित होते हैं.
- वयस्क चूहों: सीओ 2 अनॉक्सिता द्वारा तुरंत बाद बलिदान, धीरे छाती गुहा को खोलने और दिल और फेफड़ों को बेनकाब करने के लिए विच्छेदन कैंची का उपयोग करें. महान धमनियों में, पकड़ संदंश के साथ दिल से अवगत कराया और शरीर से दूर खींच एक बार. बरकरार यदि फेफड़े के ऊतकों निकालें, और ठंड HBSS में जगह दिलों कुल्ला. निलय निकालें और बरकरार atrioventricular नहर 'रिंग' और महाधमनी क्षेत्रों छोड़ने अटरिया दूर करना. 'रिंग' को खोलने और वाल्वुलर संरचनाओं का पर्दाफाश करने atrioventricular नहर के किनारे नीचे एक चीरा. धीरे संदंश के साथ दूर चिढ़ा द्वारा मायोकार्डियम और समीपस्थ महाधमनी क्षेत्रों निकालें. गुलाबी मायोकार्डियम पर सफेद, घने ऊतक के रूप में वाल्व पत्रक पहचानें. धीरे detaatrioventricular वाल्व से chordae tendinae CH और संभव के रूप में शेष मायोकार्डियम की बहुत दूर. पुल या VECs उखाड़ फेंकना जा सकता है क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान वाल्व पत्रक परिमार्जन नहीं करने के लिए सावधान रहो. 1 मिलीलीटर HBSS युक्त एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में छंटनी वाल्वुलर क्षेत्रों प्लेस और बर्फ पर रहते हैं. नोट: सावधान विच्छेदन नमूना दूषित सकता है कि गैर वाल्वुलर endothelial कोशिकाओं को खत्म करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- भ्रूण: शयन प्लग मनाया जाता 14.0 दिनों के बाद मादा चूहों (शयन प्लग = 0.5 दिन की सुबह) बलिदान.
- तत्काल बलिदान के बाद, गर्भाशय (भ्रूण युक्त) काटना और ठंड HBSS में धो लो. गर्भाशय से व्यक्तिगत भ्रूण काटना और प्रत्येक भ्रूण के आसपास के भ्रूण की जर्दी थैली को हटा दें. भ्रूण में से प्रत्येक से दिल निकालें और 2.1 कदम का पालन करें. (नोट: धीरे दिल को बेनकाब और हटाने आसान बनाने के लिए मदद करनी चाहिए सिर्फ ऊपरी उपांग नीचे संदंश के साथ भ्रूण फैलाएंगे.)
- बाँझ पिपेट सुझावों का प्रयोग, वाल्वुलर क्षेत्रों युक्त Eppendorf ट्यूब से HBSS हटा दें.
- 1 मिलीलीटर हदबंदी बफर और 4 μl DNase मैं के साथ बदलें
- 7 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब घुमाएँ.
- पिपेट ऊपर और 3 बार नीचे और फिर नमूना 15 सेकंड के लिए समझौता करते हैं. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में (अलग कोशिकाओं से युक्त) सतह पर तैरनेवाला लीजिए.
- , Collagenase प्रतिक्रिया को रोकने संग्रह ट्यूब घोड़े सीरम के 125 μl जोड़ें. बर्फ पर संग्रह ट्यूब रखें.
- दोहराएँ हदबंदी कदम (3.2-3.5) नौ बार सतह पर तैरनेवाला के नौ भिन्न इकट्ठा करने के लिए.
- किसी भी मलबे और गुच्छों को निकाल कर एक एकल कक्ष निलंबन सुनिश्चित करने के लिए एक नया संग्रह ट्यूब में एक 70 माइक्रोन नायलॉन फिल्टर के माध्यम से fractioned संग्रह गुजरती हैं.
- 5 मिनट गोली कोशिकाओं के लिए 400 ग्राम पर निलंबन स्पिन.
- 1 मिलीलीटर छंटनी बफर में सेल गोली Resuspend औरFACS तक बर्फ पर रहते हैं.
GFP सकारात्मक VECs छंटनी 4 FACS
- मलबे को बाहर और एकल कक्षों पर कब्जा करने के लिए आगे और पक्ष बिखराव के लिए द्वार सेट; नक़ल भेदभाव gating का उपयोग करके दोहरी बाहर. नकारात्मक नियंत्रण नमूना रिकार्ड और Tie2-GFP नमूने में GFP पॉजिटिव सेल की आबादी की तुलना करने और सही ढंग से परिभाषित करने के क्रम में गेट सेटिंग्स को परिभाषित.
- FACS के माध्यम से GFP सकारात्मक कोशिकाओं का विश्लेषण और गेट सेटिंग्स को परिष्कृत.
- क्रमबद्ध Tie2-GFP नमूना और दोनों GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा. कोशिकाओं क्रमबद्ध सीधे छंटनी बफर में शाही सेना निकासी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. FACS के बाद संस्कृति कोशिकाओं को, 1 मिलीलीटर FBS के साथ 1 मिलीलीटर ग्राम शिक्षा समिति के मीडिया वाले एक बाँझ ट्यूब में GFP सकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा, और 1 मिलीलीटर FBS के साथ गैर endothelial मीडिया के 1 मिलीलीटर में GFP नकारात्मक कोशिकाओं को इकट्ठा. सेल व्यवहार्यता में सुधार करने के लिए यह 50% मीडिया / 50% सीरम संयोजन का उपयोग करें. पोस्ट FACS विश्लेषण जब तक बर्फ पर रखें.
5 पोस्ट FACS विश्लेषणएस
- शाही सेना निष्कर्षण:
- इसके तत्काल बाद 8 मिनट के लिए 1500 XG पर FACS, अपकेंद्रित्र GFP सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं निम्नलिखित.
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला (छँटाई बफर) पिपेट और त्यागें.
- 200 μl TRIzol में (गोली यहाँ सिफारिश नमूना आकार के लिए दिखाई नहीं देता है) सेल गोली Resuspend.
- -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर या पहले से हमारी प्रयोगशाला में 15 से वर्णित के रूप में कुल mRNA अलग करने के लिए मानक फिनोल के क्लोरोफॉर्म निकासी शुरू करते हैं.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार Mastermix का उपयोग सीडीएनए संश्लेषण के लिए आरएनए की 50-200 एनजी का प्रयोग करें.
- माउस endothelial सेल मार्कर (CD31, वॉन Willebrand फैक्टर (vWF)), वाल्व बीचवाला सेल मार्कर (α चिकनी पेशी actin (α-SMA), Periostin (Postn)) के खिलाफ IDT प्राइमटाइम qPCR जांच का उपयोग मात्रात्मक पीसीआर प्रवर्धन, myocyte के अधीन रहते हुए सीडीएनए मार्कर (Mhc6, Mhc7) और GAPDH.
- Murine ग्राम शिक्षा समिति के संवर्धन:
- FACS छंटनी और सेल संग्रह (4.3 चरण), 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के बाद.
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला (छँटाई बफर मीडिया) बंद पिपेट और त्यागें.
- ग्राम शिक्षा समिति के मीडिया के 1 मिलीलीटर में GFP पॉजिटिव सेल गोली और 1 मिलीलीटर गैर endothelial मीडिया में GFP नकारात्मक गोली Resuspend.
- एक प्लास्टिक चैम्बर स्लाइड के एक कुएं में प्रत्येक नमूने की थाली और मिला हुआ जब तक बढ़ता है. GFP नकारात्मक कोशिकाओं के बारे में 1 सप्ताह के लिए संस्कृति मिला हुआ बनने के लिए और GFP सकारात्मक कोशिकाओं के लिए अधिक से अधिक 2 सप्ताह (3 का एक नमूना, वयस्क चूहों से) मिला हुआ बनने के लिए. हर दो दिन मीडिया बदलें.
- Immunofluorescent धुंधला:
- कोशिकाओं से मीडिया निकालें और आरटी पर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) में तय कर लो. फॉस्फेट बफर नमकीन घोल में 5 मिनट प्रत्येक (पीबीएस) के लिए तय कोशिकाओं तीन बार धोएं.
- आरटी पर 1 घंटे के लिए 5% गोजातीय सीरम albumin / 1x पीबीएस में स्लाइड और ब्लॉक से चैम्बर कुओं निकालें.
- सेते(: 1,000 या α चिकनी पेशी actin (α-SMA), 1: 100 CD31, 1) प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड ओ / एन. पीबीएस में 5 मिनट के लिए 3x धो लें.
- , 400 पीबीएस में स्लाइड को जोड़ने के लिए, और आरटी पर 1 घंटा सेते: माध्यमिक एंटीबॉडी (एलेक्सा-Fluor 568 बकरी विरोधी चूहा) 1 पतला. कुल्ला स्लाइड्स पीबीएस में 5 मिनट के लिए 3x.
- Vectashield युक्त DAPI में माउंट और पूर्व देखने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे सेते हैं.
Representative Results
Tie2-GFP कोशिकाओं भ्रूण और वयस्क हृदय वाल्व में endothelial सेल मार्कर के साथ सह स्थानीय बनाना.
भ्रूण और वयस्क चूहों से VECs में Tie2-GFP अभिव्यक्ति की विशिष्टता की पुष्टि करने के क्रम में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस E14.5 और 3 महीने पुराने वयस्क Tie2-GFP से तैयार ऊतक वर्गों में endothelial सेल मार्कर के साथ सह स्थानीयकरण, CD31 निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया था तरीकों का उपयोग कर चूहों पहले हमारी प्रयोगशाला में 16 से प्रकाशित किया. चित्र 1 में दिखाया गया है, VECs सह व्यक्त GFP (चित्रा 1 ए, बी, ई, एफ) दोनों वयस्क और CD31 (सी, डी, ई, एफ चित्रा 1) (चित्रा 1 बी, डी, एफ) और भ्रूण ( इसलिए बाद में ग्राम शिक्षा समिति के अलगाव के लिए हमारे मॉडल मान्य चित्रा 1 ए, सी, ई) चरणों.
FACS विश्लेषण Tie2-GFP चूहों से अलग भ्रूण और वयस्क हृदय वाल्व में अलग GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक सेल आबादी की पहचान की.
वन्य टीype C57 / BL6 चूहों GFP मानकों सेट करने के लिए इस्तेमाल किया गया और Tie2-GFP चूहों से एकल gated कोशिकाओं का लगभग 2% (चित्रा 2) भ्रूण और वयस्क नमूने दोनों में FACS विश्लेषण द्वारा GFP पॉजिटिव कोशिकाओं में एक महत्वपूर्ण संवर्धन दिखा. चित्र 1 में दिखाया सह स्थानीयकरण के अध्ययन के आधार पर, इन कोशिकाओं VECs माना जाता है और 61800 कुल कोशिकाओं के एक औसत उपज रहे वयस्क नमूने में (एन = 3), और 8928 कोशिकाओं (8,015- (नमूने 39,000-77,000 कोशिकाओं / नमूना से लेकर) 11,000 कोशिकाओं E14.5 भ्रूण के एक कूड़े से / कूड़े).
पीसीआर विश्लेषण Tie2-GFP चूहों से अलग GFP नकारात्मक कोशिकाओं में GFP पॉजिटिव कोशिकाओं और वाल्व बीचवाला सेल मार्कर में endothelial सेल मार्कर के संवर्धन की पुष्टि करता है.
QPCR निम्नलिखित FACS द्वारा GFP सकारात्मक और नकारात्मक सेल आबादी के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण अलग आणविक प्रोफाइल को दिखाते हैं. Tie2-GFP भ्रूण और adul से अलग GFP नकारात्मक सेल आबादी की तुलनाटीएस, GFP सकारात्मक कोशिकाओं endothelial सेल मार्कर CD31 और vWF, (चित्रा 3) की अभिव्यक्ति के लिए समृद्ध है. इसके अलावा, इन सेल आबादी में myocyte मार्कर (Myh6, Myh7) की अभिव्यक्ति गैर endothelial कोशिकाओं की न्यूनतम संदूषण का प्रदर्शन बहुत कम है. इसके विपरीत, वयस्क Tie2-GFP चूहों और E14.5 भ्रूण से अलग GFP नकारात्मक कोशिकाओं वाल्व बीचवाला सेल (विक) मार्करों, GFP के लिए α-SMA और Periostin (POSTN) सापेक्ष सकारात्मक कोशिकाओं के लिए समृद्ध है. इन मार्करों के संवर्धन के कारण वयस्क Vics का मौन phenotype और सक्रिय मार्कर की इसलिए कम अभिव्यक्ति को वयस्कों की तुलना में E14.5 नमूने से अलग GFP नकारात्मक कोशिकाओं में अधिक है.
Tie2-GFP वयस्क चूहों से अलग GFP पॉजिटिव कोशिकाओं इन विट्रो में संवर्धित किया जा सकता है.
वयस्क नमूने से अलग संस्कृति GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक कोशिकाओं की क्षमता के आधार जांच की गई थीसेल आकारिकी और immunohistochemical धुंधला पर डी. पहले हम GFP सकारात्मक कोशिकाओं दो सप्ताह संस्कृति में (चित्रा 4C) के बाद endothelial सेल मार्कर CD31 के साथ आकारिकी (चित्रा -4 ए) में गोल और सह व्यक्त GFP दिखाई देते हैं चित्रा 4 में दिखाने के लिए हमें 17 से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना. इसके विपरीत, गैर endothelial कोशिकाओं नौ दिनों (चित्रा 4D) के बाद विक मार्कर α-SMA एक mesenchymal की तरह आकारिकी (चित्रा 4 बी) को प्रदर्शित करने और व्यक्त GFP के लिए नकारात्मक हैं.
चित्रा 1 Tie2-GFP पॉजिटिव कोशिकाओं भ्रूण और वयस्क हृदय वाल्व में CD31 के साथ सह स्थानीय बनाना. इम्यूनोफ्लोरेसेंस endothelial सेल मार्कर के साथ (Tie2-) GFP अभिव्यक्ति के संघ (ए, बी) दिखाने के लिए, CD31 (सी, डी) में एसE14.5 (ए, सी, ई) और वयस्क में मित्राल वाल्व की eptal पत्रक (बी, डी, एफ) के चरणों. वाल्व क्षेत्र में प्रकाश डाला है, सी, ई (ई, एफ) विलय छवियों. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2 Tie2-GFP पॉजिटिव VECs FACS द्वारा पहचाना जा सकता है. उम्र से मिलान C57 / BL6 नियंत्रण (ए, सी) की तुलना में, Tie2-GFP भ्रूण (बी) और वयस्कों (डी) से अलग वाल्व एक अलग GFP- होते हरे रंग में संकेत के रूप में सकारात्मक सेल आबादी,. लाल रंग में दिखाया गया GFP नकारात्मक घटनाओं, एक नियंत्रण के रूप में एकत्र किए गए थे. (बी) और (डी) में नंबर GFP-P की औसत% का संकेतFACS द्वारा क्रमबद्ध घटनाओं की कुल संख्या से ositive कोशिकाओं (एन = 3). इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
GFP नकारात्मक कोशिकाओं वाल्व बीचवाला कोशिकाओं के साथ जुड़े जीन व्यक्त जबकि चित्रा 3 GFP पॉजिटिव कोशिकाओं endothelial सेल मार्कर के लिए समृद्ध है. Endothelial सेल मार्कर (CD31, वॉन Willebrand फैक्टर (vWF)) और वयस्क (Myh6) और भ्रूण के प्रतिनिधि qPCR ( Myh7) E14.5 (ए) और वयस्क (बी की वाल्वुलर क्षेत्रों से अलग GFP पॉजिटिव कोशिकाओं में myocyte मार्कर) Tie2-GFP चूहों. Endothelial सेल मार्कर और myocyte जुड़े जीन का स्तर बहुत कम के नोट संवर्धन. (सी, डी) चा मोड़ोवाल्व बीचवाला सेल मार्कर की अभिव्यक्ति में nges α-SMA E14.5 (सी) और वयस्क (डी) Tie2-GFP चूहों से अलग GFP नकारात्मक कोशिकाओं में और Postn. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4 Tie2-GFP पॉजिटिव कोशिकाओं इन विट्रो में endothelial सेल मार्कर की अभिव्यक्ति बनाए रखें. बाद FACS, GFP सकारात्मक (ए, सी) और नकारात्मक (बी, डी) विपरीत इमेजिंग चरण के लिए मिला हुआ जब तक सभ्य और विषय वयस्क चूहों से सेल आबादी गया (ए, बी) और फ्लोरोसेंट immunostaining (सी, डी). GFP पॉजिटिव कोशिकाओं के बाद CD31 (लाल) (सी) व्यक्तसंस्कृति के 10 दिनों के. इसके विपरीत, GFP अभिव्यक्ति α-SMA, सक्रिय VICS (डी) के एक मार्कर के लिए सकारात्मक दाग जो नकारात्मक सेल आबादी, में पता नहीं था.
Discussion
यहाँ हम पहली बार वर्णन, Tie2-GFP चूहों से भ्रूण और वयस्क murine VECs के अलगाव के लिए एक उपन्यास विधि. इस माउस लाइन बड़े पैमाने पर endothelial सेल आबादी के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया गया है, वहीं इस VECs के चयनात्मक अलगाव दिखा पहली रिपोर्ट है. कारण ग्राम शिक्षा समिति आबादी की कमजोरी के कारण, हम भ्रूण और वयस्क चूहों के हृदय वाल्व से सकारात्मक GFP (और GFP नकारात्मक) कोशिकाओं के एकल कक्ष अलगाव के लिए अनुमति देता है कि एक कड़े प्रोटोकॉल विकसित किया है. Tie2-GFP चूहों 14 से पूरे भ्रूण या अंगों का उपयोग मूल प्रकाशन की तुलना में, हम कोशिकाओं के एक चुनिंदा आबादी को अलग करने के लिए इस नाजुक endothelial सेल की आबादी का कम बहुतायत के आधार पर collagenase और विच्छेदन कदम अनुकूलित है.
ग्राम शिक्षा समिति के isolations पहले से ही सीमित आनुवंशिक और biomolecular उपकरणों के साथ बड़े पशु मॉडल में सूचित किया गया है. ये उपकरण ठीक है, इसलिए अबी चूहों में स्थापित किया है और कर रहे हैंmurine VECs को अलग करने में lity हृदय वाल्व अनुसंधान के लिए प्रयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक डिजाइन की एक विस्तृत सेट के लिए अनुमति देता है. इसलिए, इस दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण फायदा VECs जंगली प्रकार चूहों, और वाल्व रोग और चोट के मॉडल से अस्थायी अलग किया जा सकता है. एक दूसरा फायदा VECs पृथक और अधिक सही vivo में स्थिति को प्रतिबिंबित कि अभिव्यक्ति पैटर्न के संरक्षण, विच्छेदन के बाद लगभग तुरंत विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अलावा, इस अलगाव प्रोटोकॉल संख्या विस्तार और इन विट्रो वातावरण से प्रेरित इसलिए संभावित प्ररूपी परिवर्तन के लिए रोका जाता है सेल संस्कृति को खत्म करने के लिए पर्याप्त है.
सस्ता माल और इस प्रोटोकॉल की प्रयोगात्मक लाभ के बावजूद, हम सीमाओं अभी भी मौजूद है कि पहचान. सबसे पहले, murine वाल्व के भीतर ग्राम शिक्षा समिति की आबादी का आकार बहुत छोटा है और इसलिए, कई समय भ्रूण litters जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए पर्याप्त आरएनए उत्पन्न करने के क्रम में जरूरत है. थी जबकिएस कई प्रजनकों का उपयोग कर दूर किया जा सकता है, यह कुछ के बाद अलगाव विश्लेषण उपकरण के प्रार्थना पत्र पर असर हो सकता है. इस सीमा विशेष रूप से आणविक प्रोफाइल और कार्यात्मक assays सहित ग्राम शिक्षा समिति phenotypes की अधिक गहन विश्लेषण प्रदर्शन करने के क्रम में GFP पॉजिटिव VECs का मिला हुआ संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक चुनौती रहा है. इसलिए हम नहीं सभी कठिनाइयों हमारे दृष्टिकोण से दूर किया गया है कि को स्वीकार करते हैं, लेकिन यह हम पर काबू पाने के लिए प्रयास कर रहे हैं कि ब्याज की एक क्षेत्र है.
वाल्वुलर क्षेत्रों से VECs अलग करने का यह दृष्टिकोण निलय मायोकार्डियम के भीतर endocardium, या संवहनी संरचनाओं के गठबंधन GFP -positive, गैर वाल्वुलर endothelial कोशिकाओं से संदूषण की संभावना का परिचय. तिथि करने के लिए, अन्य हृदय endothelial सेल आबादी से VECs की आणविक भेद की पहचान नहीं की गई है. हालांकि Nfatc1 जीन की एक बढ़ाने क्षेत्र की पहचान की है और विशेष रूप से है कि नहीं VECs लेबल करने के लिए दिखाया गया हैदिल 18 के भीतर EMT, और कोई अन्य endothelial सेल जनसंख्या से गुजरना. एक Cre मॉडल (Nfatc1 enCre) उपलब्ध है, भविष्य के अध्ययन संदूषण जोखिम को कम करने के लिए इस लाइन की विशिष्टता का उपयोग कर सकता है. गैर वाल्वुलर Tie2-GFP- सकारात्मक कोशिकाओं के अलावा, वाल्व पत्रक सेप्टल और भित्ति दौरे दीवारों के कुंडलाकार क्षेत्र को देते हैं जहां बिंदु पर myocytes से संदूषण की संभावना हमेशा वहाँ है. यहाँ नहीं दिखाया डेटा में, हम शुरू में विरोधी GFP और विरोधी CD31 के साथ लेपित एंटीबॉडी संयुग्मित मनकों का उपयोग विच्छेदित वाल्वुलर क्षेत्रों से VECs अलग करने के लिए अध्ययन शुरू किया. इस दृष्टिकोण endothelial कोशिकाओं के लिए अलग सफल रहा था, वहीं हम आसन्न, गैर endothelial सेल प्रकार से महत्वपूर्ण सेल clumping अनुभवी और इसलिए Vics और मायोकार्डियल कोशिकाओं हमारे प्रयोगात्मक नमूने दूषित. इस मापदंडों केवल एकल कक्ष निलंबन को अलग करने के लिए निर्धारित किया गया है के रूप में FACS विश्लेषण का उपयोग से परहेज किया गया हैएस और पीसीआर विश्लेषण myocyte विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति इस सीमा (चित्रा 3) के लिए नियंत्रित किया गया है पता लगाने के लिए. हमारे संदूषण न्यूनतम के रूप में समझा जा सकता है, यह GFP और endothelial सेल विशिष्ट सतह मार्कर की डबल चयन के साथ भविष्य में बचा जा सकता है जो एक संभावित प्रयोगात्मक जटिलता बनी हुई है.
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम भ्रूण और वयस्क चूहों और इस दृष्टिकोण शाही सेना अलगाव और GFP सकारात्मक और GFP नकारात्मक सेल आबादी के सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की दिए गए उदाहरणों से सफलतापूर्वक अलग VECs है. हालांकि, इस दृष्टिकोण इन आवेदनों तक सीमित नहीं है और, आणविक सेलुलर और कार्यात्मक दृष्टिकोण के ढेर सारे के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, Tie2-GFP पृष्ठभूमि स्वास्थ्य और रोग में ग्राम शिक्षा समिति की आबादी के तुलनात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देगा कि आनुवंशिक माउस मॉडल के साथ नस्ल जा सकता है. इस उपन्यास पद्धति का विकास, पहली बार के लिए, ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए अनुमति देगावाल्व विकास और रखरखाव में VECs के योगदान की जांच और endothelial निर्भर वाल्व रोग का पहले से नाचीज तंत्र प्रकट कर सकता है.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम FACS विश्लेषण के साथ तकनीकी सहायता के लिए ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी व्यापक कैंसर केंद्र विश्लेषणात्मक Cytometry कोर सुविधा, विशेष रूप से कैटरीना मूर, धन्यवाद. इसके अलावा हम अपने वैज्ञानिक अंतर्दृष्टि के लिए डॉ विलियम पु और उनके समूह को पहचानते हैं. यह काम एनआईएच HL091878 (जीएल) और राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में हार्ट केंद्र द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5 M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning cellgro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11 cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T.
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
