Introduction
Den modne ventilen er sammensatt av tre stratifiserte lag av spesialiserte ekstracellulære matriks (ECM) ispedd ventil interstitielle celler (vics) og innkapslet av et enkelt lag av hjerteklaff endotelceller (VECs) 1. Rollen til ECM er å gi alle nødvendige biomekaniske egenskaper til å tåle stadige endringer i hemodynamisk kraft i løpet av hjertesyklusen. Omsetning av ventil ECM i voksen ventilen er strengt regulert av vics som er stort sett stillestående, og fibroblast-lignende i fravær av sykdommen. I tillegg til den VIC populasjon, hjerteklaff endotelceller (VECs) danner en uavbrutt endotel over overflaten av ventilspissene 2. Mens betydningen av ECM og Vics for ventil struktur og funksjon er beskrevet av oss og andre, er rollen VECs mindre kjent. Dette er imidlertid forholdsvis liten cellepopulasjon kritisk for ventildannelse i fosteret, og er beskrevet som dysfunksjonell i ventilsykdom.
Hjerteklaff formasjonen i embryoet begynner når en undergruppe av endotelceller innenfor atrioventrikulær kanalen og utstrømning veis regioner gjennomgå endothelial til mesenchymale transformasjon (EMT) og danner hevelser kjent som endokardiale puter 1,3. De nylig forvandlet mesenchymalceller innenfor disse strukturene senere differensiere i Vics og danner de modne ventiler. Når EMT er fullført, endotelceller liggende puter, betegnet VECs, danner en uavbrutt endotelcelle lag som beskytter det modne ventilen mot skade. I tillegg VECs avføle hemodynamiske miljø og har vist seg å molekylært kommunisere med underliggende vics å regulere ECM homeostase 1,3. I syke ventiler, er VEC monolayer forstyrret i forbindelse med unormale endringer i ECM organisasjon og endrede biomekanikk 4,5. I tillegg studier i musemodeller tyder på at VEC dysfunksjon er den underliggende årsaken til ventil disease 1,6-9. Som VECs spille en viktig rolle i ventil utvikling, vedlikehold og sykdom, er det viktig at vi fullt definere sine timelige fenotyper for å fremme feltet og forstå mekanismene for sykdom.
Tidligere arbeid ved flere laboratorier har lyktes i å isolere VECs fra svin og sau modeller 10-12. På grunn av den store størrelsen til disse ventiler, isoleringer gjennom swabbing og / eller enzymatisk behandling, etterfulgt av en rekke forskjellige metoder, inkludert isolasjon på magnetiske kuler celleseparasjon og enkelt celle klonal ekspansjon har vært effektiv for å generere rene populasjoner 11-13. Imidlertid kan disse modellene være begrensende på grunn av den ufullstendige annotering av gris og sau genomer som begrenser tilgjengeligheten av molekylære verktøy i tillegg til de høye kostnader. Derfor eksperimentering av svin og sau VECs etter isolasjon kan være restriktiv. Musemodeller er å foretrekke på grunn av de mange mulighetene for genetisk manipulasjon og molekylære verktøy i embryo og voksen, men til dags dato, ingen VEC isoleringer i små dyremodeller har blitt rapportert. Dette er sannsynligvis på grunn av vanskelighetene med å jobbe med små vevsprøver som inkluderer et mindretall cellepopulasjon som i dag mangler unik identitet VEC-spesifikke markører, og dermed hindre antistoffbasert isolasjonsmetoder.
I denne artikkelen rapporterer vi en ny metode for direkte isolasjon av murine VECs på embryonale og voksne stadier. Denne protokollen tar seg av Tie2-GFP mus som uttrykker GFP i alle endothelial celletyper og har vært mye brukt for å studere endothelial cellepopulasjoner 14. Imidlertid er det nye ved denne studien at disse musene, for første gang er blitt anvendt for å isolere endotelceller fra ventilene. Ved forsiktig dissekering av ventil vev og en serie på ni enzymatiske fordøyelse etterfulgt av FACS sortering kan VECs isoleres og brukes til forskjellige eksperimentelle teknikkercluding RNA ekstraksjon og kultur, direkte etter sortering.
Protocol
1. Utarbeidelse av utstyr og løsninger
- Sterilisere disseksjon verktøy - fin vev saks for å trekke voksne hjerter og to fine tang for disseksjon av klaffe regionen - ved autoklavering i en overbygd instrument skuffen. Spray verktøy med 70% etanol (EtOH) før disseksjon.
- Klargjør alle løsningene umiddelbart før eksperimentet og sterilisere løsninger ved å føre dem gjennom et sterilt 0,2 um filter. Hold løsninger på is inntil bruk.
- Steril Dissosiasjon Buffer (15 ml totalt / prøve). Kombiner 1.2 ml collagenase IV, 300 mL 2,5% trypsin og 150 pl chick serum. Bring volumet opp til 15 ml med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS).
- Steril Sortering Buffer (12 ml totalt). Kombiner 25 mikroliter 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og 12 pl DNase I (RNase-fri). Ta med volum opp til 12 ml med HBSS.
- VEC Culture Media. Mix endotelceller growth media i henhold til produsentens instruksjoner (se materiale regneark) ved å tilføye alikvoteres komponenter fra settet til 500 ml EBM2 media.
- GFP ukultur Media (non-endotelceller media). Bland 445 ml av Medium 199 1x med 5 ml penicillin / streptomycin (pen / strep) (1% endelig konsentrasjon) og 50 ml FBS (10% endelig konsentrasjon).
2. Disseksjon av Valvular Region fra voksne mus og E14.5 embryoer
- Alle dyr prosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med The Nationwide Children Hospital Research Institute IACUC retningslinjer.
- Tie2-GFP mus ble kjøpt fra Jackson Laboratories (artikkelnummer 003658) 14, og ble opprettholdt som homozygote genotyper på en FVB / N bakgrunn, og derfor sikre at alle off-Spring Express GFP i Tie2-positive endotelceller.
- For FACS sortering, forberede en alder matchet negativ SAMPle som ikke inneholder GFP som C57 / BL6 å sette GFP gate parametere for FACS sortering. MERK: Denne protokollen og representative resultatene er basert på bruk av tre, fire måneder gamle voksne mus eller ett kull på embryonale dag (E) 14.5.
- Voksen Mus: Umiddelbart etter offer ved CO 2 anoksi, bruke disseksjon saks for å åpne forsiktig brysthulen og blottlegge hjertet og lungene. Når utsatt, grep hjertet med pinsett på de store arterier og dra vekk fra kroppen. Fjern lungevev hvis intakt, og plassere hjerter i kaldt HBSS å skylle. Fjern ventrikkelen og dra vekk atriene forlater atrioventricular kanalen 'ring' og aorta regioner intakt. Gjør ett snitt på siden av atrioventrikulær kanal for å åpne opp "ring" og utsett valvulære strukturer. Ta hjertemuskelen og proksimale aorta regioner ved å forsiktig ertende bort med pinsett. Identifiser ventil brosjyrer som hvit, tett vev over rosa hjertemuskelen. Forsiktig DetaCH chordae tendinae fra atrioventrikulærklaffer og fjerne så mye av den gjenværende myokardium som mulig. Vær forsiktig å ikke trekke eller skrape ventil brosjyrer i løpet av denne prosessen siden VECs kan forskyves. Plasser trimmet valvulære regioner i et 1,5 ml Eppendorf-rør inneholdende 1 ml HBSS og holde på is. MERK: Forsiktig disseksjon er avgjørende for å eliminere ikke-klaffe endotelceller som kan forurense prøven.
- Embryoer: Sacrifice hunnmus 14,0 dager etter parr pluggen er observert (morgenen copulation plugg = 0,5 dager).
- Umiddelbart etter offer, dissekere livmoren (som inneholder embryo) og vask i kaldt HBSS. Dissekere ut individuelle embryo fra livmor og ta den embryonale plommesekken rundt hvert embryo. Fjern hjerter fra hver av embryoene og følg trinn 2.1. (MERK: klemme forsiktig embryo med pinsett like under de øvre vedheng bør bidra til å blottlegge hjertet og gjøre fjerning enklere.)
- Bruk sterile pipetter, fjerne HBSS fra Eppendorf-rør som inneholder valvulære regioner.
- Skift ut med en ml dissosiasjon buffer og 4 mL DNase I.
- Roter rørene ved 37 ° C i 7 min.
- Pipetter opp og ned tre ganger og deretter la prøven avgjøre for 15 sek. Samle supernatanten (som inneholder dissosierte celler) i en 15 ml konisk rør.
- For å stoppe kollagenase reaksjon, tilsett 125 mL av hesteserum til samlingen tube. Hold samling rør på is.
- Gjenta dissosiasjon trinn (03.02-03.05) ni ganger for å samle ni fraksjoner av supernatant.
- Passere fraksjonert innsamling gjennom en 70 mikrometer nylon filteret i en ny samling rør for å sikre en enkelt celle suspensjon ved å fjerne eventuelle rester og klumper.
- Spin suspensjonen ved 400 g i 5 minutter for å pelletere cellene.
- Resuspender cellepelleten i 1 ml buffer, og sorteringholde på is inntil FACS.
4. FACS Sortering GFP positive VECs
- Sett porter for forover og side scatter å utelukke rusk og fange enkeltceller; ekskludere dubletter ved å bruke dublett diskriminering gating. Spill den negative kontrollprøven og definere portinnstillingene for å sammenligne og nøyaktig definere GFP-positive cellepopulasjon i Tie2-GFP prøven.
- Analyser GFP positive celler via FACS og avgrense gate innstillinger.
- Sortere Tie2-GFP prøve og samle både GFP-positive og GFP-negative celler. Dersom cellene vil bli brukt for RNA ekstraksjon, sortere direkte inn i Sorting buffer. For å dyrke celler etter FACS, samle GFP-positive celler i et sterilt rør inneholdende 1 ml VEC media med 1 ml FBS, og samle GFP-negative celler i 1 ml av ikke-endoteliale media med 1 ml FBS. Bruk denne 50% media / 50% serum kombinasjon for å forbedre celle levedyktighet. Hold på is inntil legg FACS analyse.
5. Post FACS analyseverktøs
- RNA Utvinning:
- Umiddelbart etter FACS, sentrifuge GFP positive og negative celler ved 1500 x g i 8 min.
- Pipette forsiktig supernatanten (sortering buffer) og kast.
- Cellepelleten suspenderes (pellet er ikke synlig for utvalgsstørrelsene anbefalt her) i 200 mL Trizol.
- Fryse ved -80 ° C eller begynne standard fenol-kloroform ekstraksjon for å isolere total mRNA som tidligere beskrevet av vårt laboratorium 15..
- Bruk 50-200 ng av RNA for cDNA syntese bruker Mastermix henhold til produsentens instruksjoner.
- Subject cDNA til kvantitativ PCR forsterkning bruker IDT Primetime qPCR sonder mot mus endotelceller markører (CD31, von Willebrand faktor (vWF)), ventil interstitiell celle markører (α-glatt muskulatur aktin (α-SMA), Periostin (Postn)), myocyte markører (Mhc6, Mhc7) og GAPDH.
- Dyrking Murint VEC:
- Etter FACS sortering og cellesamling (trinn 4.3), sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min.
- Nøye pipette av supernatanten (sortering buffer + media) og kast.
- Resuspender GFP-positive cellepelleten i 1 ml av VEC medier og GFP-negative pellet i 1 ml ikke-endoteliale medier.
- Plate hver prøve i én brønn av en plastkammer lysbilde og vokse inntil sammenflytende. Kultur i omtrent 1 uke for GFP negative celler til å bli konfluent, og mer enn 2 uker for GFP-positive celler til å bli konfluent (fra en prøve av 3, voksen mus). Endre media annenhver dag.
- Immunofluorescent Farging:
- Fjern mediet fra cellene og fikse i 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 min ved RT. Vask faste cellene tre ganger i 5 minutter hver i fosfatbuffret saltløsning (PBS).
- Fjern kammer brønner fra lysbildet og blokken i 5% bovint serumalbumin / 1 x PBS i 1 time ved RT.
- Inkuberlysbilder O / N ved 4 ° C med primære antistoffer (CD31, 1: 1000 α-eller glattmuskel-aktin (α-SMA), 1: 100). Vask 3 ganger i 5 minutter i PBS.
- Fortynn det sekundære antistoff (Alexa-Fluor 568 geit anti-rotte) 1: 400 i PBS, legg til slides, og inkuberes i 1 time ved RT. Skyll lysbilder 3x i 5 min i PBS.
- Høyden i Vectashield holdige DAPI og inkuberes i 1 time ved 4 ° C før visning.
Representative Results
Tie2-GFP celler co-lokalisere med endotelcelle markører i embryonale og voksne hjerteklaffer.
For å bekrefte det spesielle ved Tie2-GFP uttrykk i VECs fra embryonale og voksne mus, ble immunfluorescens utført for å bestemme samlokalisering med endotelceller markør, CD31 i vevssnitt fremstilt E14.5 og 3 måneder gammel voksen Tie2-GFP mus ved hjelp av metoder tidligere utgitt av vår lab 16. Som vist i figur 1, VECs co-uttrykte GFP (figur 1 A, B, E, F) og CD31 (figur 1 C, D, E, F) på både voksne (figur 1 B, D, F) og embryonale ( Figur 1 A, C, E) faser, således validere modellen for senere VEC isolasjon.
FACS analyse identifisert distinkte GFP-positive og GFP-negative cellepopulasjoner i embryonale og voksne hjerteklaffer isolert fra Tie2-GFP mus.
Wild type C57 / BL6 mus ble brukt til å sette GFP parametere og ca 2% av single-gated celler fra Tie2-GFP mus viser en betydelig berikelse i GFP-positive celler ved FACS analyse i både embryonale og voksne prøver (figur 2). Basert på co-lokaliseringsstudier som er vist i figur 1, er disse cellene betraktes VECs og ga et gjennomsnitt på 61 800 celler totalt (prøver varierer fra 39,000-77,000 celler / prøve) hos voksne prøver (n = 3), og 8928 celler (8,015- 11.000 celler / kull) fra ett kull av E14.5 embryoer.
PCR analyse bekrefter anriking av endoteliale cellemarkører i GFP-positive celler og ventil interstitiell celle markører i GFP-negative celler isolert fra Tie2-GFP mus.
Genuttrykk analyse av GFP positive og negative cellepopulasjoner ved qPCR følgende FACS vise forskjellige molekylære profiler. Sammenlignet med GFP negative cellepopulasjoner isolert fra Tie2-GFP embryoer og Adults, er GFP-positive celler anriket for ekspresjon av endotelial cellemarkører CD31 og vWF, (figur 3). Videre er ekspresjon av myocyte markører (Myh6, Myh7) i disse cellepopulasjoner meget lav, noe som viser minimal forurensning av ikke-endotelceller. I kontrast er GFP negative celler isolert fra voksne Tie2-GFP mus og E14.5 embryoer beriket for ventil interstitiell celle (VIC) markører, α-SMA og Periostin (POSTN) i forhold til GFP positive celler. Anrikning av disse markørene er høyere i GFP negative celler isolert fra E14.5 prøvene sammenlignet med voksne på grunn av sovende fenotype av voksne Vics og derfor lav uttrykk for aktiverte markører.
GFP-positive celler isolert fra Tie2-GFP voksne mus kan bli dyrket in vitro.
Evnen til å kultur GFP positive og negative GFP-celler isolert fra voksen prøvene ble undersøkt basend på cellemorfologi og immunhistokjemisk farging. Ved hjelp av protokoller som tidligere beskrevet av oss 17 vi vise på figur 4 at GFP positive celler vises runde i morfologi (figur 4A) og co-uttrykte GFP med endotelcelle markør CD31 etter to uker i kultur (figur 4C). I kontrast, ikke-endotelceller er negative for GFP, viser en mesenchymale-lignende morfologi (Figur 4B) og uttrykke VIC markør α-SMA etter ni dager (Figur 4D).
Figur 1. Tie2-GFP-positive celler co-lokalisere med CD31 i embryonale og voksne hjerteklaffer. Immunfluorescens å vise sammenslutning av (Tie2-) GFP uttrykk (A, B) med endotelceller markør, CD31 (C, D) i de septal brosjyrer over mitralklaffen på E14.5 (A, C, E) og voksne (B, D, F) stadier. Ventilen regionen er uthevet i A, C, E. (E, F) fusjonerte bilder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Tie2-GFP-positive VECs kan identifiseres ved FACS. Sammenlignet med tilsvarende alder C57 / BL6 kontroller (A, C), ventiler isolert fra Tie2-GFP embryoer (B) og voksne (D) inneholder en distinkt GFP- positive cellepopulasjon, som angitt i grønt. GFP-negative hendelser, er vist i rødt, ble oppsamlet som en kontroll. Tallene i (B) og (D) viser gjennomsnitts% av GFP-positive celler fra det totale antall hendelser sortert etter FACS (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. GFP-positive celler er beriket for endotelcelle markører mens GFP-negative celler uttrykker gener assosiert med ventil interstitiell celler. Representant qPCR av endoteliale cellemarkører (CD31, von Willebrand faktor (vWF)) og voksne (Myh6) og foster ( Myh7) myocyte markører i GFP-positive celler isolert fra valvulære regioner i E14.5 (A) og voksne (B) Tie2-GFP mus. Note anrikning av endotelcelle markører og meget lave nivåer av myocyte-assosierte gener. (C, D) Brett changes i uttrykk for ventil interstitiell celle markører α-SMA og Postn i isolerte GFP-negative celler fra E14.5 (C) og voksne (D) Tie2-GFP mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tie2-GFP-positive celler opprettholde uttrykk for endotelcelle markører in vitro. Etter FACS, GFP positive (A, C) og negativ (B, D) cellepopulasjoner fra voksne mus ble dyrket frem konfluent og lagt fase kontrast bildebehandling (A, B) og fluorescerende farging (C, D). GFP-positive celler uttrykker CD31 (rød) (C) etter10 dager med kultur. I kontrast, ble GFP uttrykk ikke detektert i den negative cellepopulasjon, som farget positivt for α-SMA, en markør for aktiverte vics (D).
Discussion
Her beskriver vi for første gang, en ny fremgangsmåte for isolering av embryoniske og voksen murine VECs fra Tie2-GFP mus. Mens denne musen linje har vært mye brukt til isolering av endoteliale cellepopulasjoner, er dette den første rapporten som viser selektiv isolering av VECs. På grunn av sårbarheten i VEC befolkningen, har vi utviklet en streng protokoll som gjør det mulig for enkelt celle isolering av GFP positive (og GFP negative) celler fra hjerteklaffer av embryonale og voksne mus. Sammenlignet med den originale publikasjon ved hjelp av hele embryoer eller organer fra Tie2-GFP mus 14, har vi optimalisert kollagenase og disseksjon måten basert på den lave overflod av denne skjøre endotelial cellepopulasjon for å isolere en utvalgt populasjon av celler.
VEC isoleringer har tidligere kun blitt rapportert i store dyremodeller med begrensede genetiske og biomolekylære verktøy. Disse verktøyene er vel etablert i mus og derfor abiheten for å isolere murine VECs tillater et utvidet sett av eksperimentelle design som skal brukes for en hjerteklaff forskning. Derfor, er en betydelig fordel med denne tilnærming som VECs kan isoleres temporært fra villtype mus, og modeller av ventil sykdom og skade. En annen fordel er at VECs kan bli isolert og analysert nesten umiddelbart etter disseksjon, bevare uttrykk mønstre som reflekterer in vivo-situasjonen mer nøyaktig. Videre er denne isolasjonsprotokoll er tilstrekkelig til å fjerne cellekultur for nummer ekspansjon og derfor potensielle fenotypiske endringer indusert ved in vitro miljøet blir forhindret.
Til tross for nyheter og eksperimentelle fordelene ved denne protokollen, innser vi at begrensningene fortsatt eksisterer. Først, er størrelsen på VEC populasjonen i løpet av murine ventiler meget liten og derfor vil flere tidsbestemte embryonale kullene er nødvendig for å generere tilstrekkelig RNA genekspresjon analyse for. Mens this kan overvinnes ved hjelp av flere oppdrettere, kan det ha en innvirkning på anvendelsen av noen post-isolasjon analyseverktøy. Denne begrensningen har vært en utfordring spesielt for å etablere konfluente kulturer av GFP-positive VECs for å utføre flere grundige analyser av VEC fenotyper inkludert molekylære profiler og funksjonelle analyser. Derfor erkjenner vi at ikke alle problemer har blitt overvunnet ved vår tilnærming, men dette er et område av interesse at vi strever etter å overvinne.
Denne tilnærmingen isolere VECs fra valvulære regioner introduserer muligheten for forurensning fra Tie-GFP -positive, ikke-klaffe endotelceller endocardium, eller vaskulære strukturer i ventrikkel myokard. Hittil har molekylær æren av VECs fra andre kardiale endoteliale cellepopulasjoner ikke blitt identifisert. Men en enhancer region av Nfatc1 genet har blitt identifisert og vist å spesifikt merke VECs som ikke gjørgjennomgå EMT, og ingen andre endotelial cellepopulasjon i hjertet 18. Som en Cre-modellen (Nfatc1 Encre) er tilgjengelig, kan fremtidige studier utnytte det spesielle ved denne linjen for å redusere forurensning risiko. I tillegg til ikke-valvulær Tie2-GFP- positive celler, er det alltid mulighet for forurensning fra myocytter ved det punkt hvor klaffbladene festes til det ringformede område av den septale og mural myokardielle vegger. I data som ikke vises her, vi først begynte studier for å isolere VECs fra dissekert valvulære regioner ved hjelp av antistoff-konjugert perler belagt med anti-GFP og anti-CD31. Mens denne tilnærmingen var vellykket for å isolere endotelceller, opplevde vi betydelig celle klumper fra tilstøtende og ikke-endothelial celletyper og derfor Vics og hjartecellene forurenset vår eksperimentelle prøven. Dette har vært unngått ved bruk av FACS analyse som parametre har blitt satt til å isolere bare enkelt celle suspensjons, og PCR-analyse for å detektere ekspresjon av myocyte-spesifikke gener har kontrollert for denne begrensningen (figur 3). Mens vår forurensning kan bli ansett som minimal, er det fortsatt et potensial eksperimentelle kompleksitet som kan unngås i fremtiden med den dobbelte utvalg av GFP og endotelcelle-spesifikt overflatemarkører.
Ved hjelp av denne protokollen, har vi lykkes isolerte VECs fra embryonale og voksne mus og førsteklasses eksempler på hvordan denne tilnærmingen kan brukes for RNA isolering og cellekultur av GFP positive og GFP negative cellepopulasjoner. Imidlertid er denne metoden ikke er begrenset til disse anvendelser og kan benyttes for en mengde molekylære, funksjonelle og cellulære tilnærminger. I tillegg kan Tie2-GFP bakgrunn bli avlet med genetiske musemodeller som vil tillate for komparative studier av VEC populasjoner i helse og sykdom. Utviklingen av denne romanen metodikk vil, for første gang, gi rom for fokuserte studierundersøke bidraget fra VECs i ventil utvikling og vedlikehold, og kunne avsløre tidligere unappreciated mekanismer endothelial avhengig ventil sykdom.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker The Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytical cytometri Kjerne anlegget, spesielt Katrina Moore, for teknisk assistanse med FACS analyse. I tillegg ser vi Dr. William Pu og hans gruppe for sine vitenskapelige innsikter. Dette arbeidet ble støttet av NIH HL091878 (JL) og The Heart Center på Nationwide Children Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life Technologies | A-11077 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen LT | 15090-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553370 | |
| Chick Serum | Invitrogen LT | 16110-082 | |
| Collagenase IV | Invitrogen LT | 17104-019 | Prepared according to manufactuer's instructions |
| DNase I, RNase free (10,000 Units) | Roche | 4716728001 | |
| EBM-2 | Lonza | CC3156 | For VEC media |
| EDTA, 0.5 M Solution | Hoefer | 03-500-506 | |
| EGM2 SingleQuot, Bulletkit | Lonza | CC-4176 | For VEC media |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Hyclone | SH3007103IH | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Horse Serum | Invitrogen LT | 16050-130 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | |
| Medium 199 1X | Corning cellgro | 10-060-CV | |
| Paraformaldehyde 16% Solution EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Pen/Strep | MP-Biomed | ICN1670049 | |
| Permanox sterile chamber slide with cover | Thermo-Scientific | 177429 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| PrimeTime Mini qPCR Assay | Integrated DNA Technologies | Acta2 (αSMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| SuperScript VILO Mastermix | Invitrogen LT | 11755050 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tie2-GFP mice | Jackson Laboratories | 3658 | |
| Tissue forceps #5 11 cm | Dumont | 14096 | |
| Trizol | Ambion | 15596018 | |
| α-SMA anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A2547 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 |
References
- Tao, G., Kotick, J. D., Lincoln, J. Heart valve development, maintenance, and disease: the role of endothelial cells. Current topics in developmental biology. 100, 203-232 (2012).
- Lincoln, J., Yutzey, K. E. Molecular and developmental mechanisms of congenital heart valve disease. Birth defects research. Part A, Clinical and molecular teratology. 91, 526-534 (2011).
- Tao, G., Levay, A. K., Gridley, T., Lincoln, J. Mmp15 is a direct target of Snai1 during endothelial to mesenchymal transformation and endocardial cushion development. Developmental biology. 359, 209-221 (2011).
- Weinberg, E. J., Mack, P. J., Schoen, F. J., Garcia-Cardena, G., Kaazempur Mofrad, M. R. Hemodynamic environments from opposing sides of human aortic valve leaflets evoke distinct endothelial phenotypes in vitro. Cardiovasc Eng. 10, 5-11 (2010).
- Hinton, R. B. Jr Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation research. 98, 1431-1438 (2006).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and cellular response feedback in calcific aortic valve disease. Circulation research. 113, 186-197 (2013).
- Bosse, K., et al. Endothelial nitric oxide signaling regulates Notch1 in aortic valve disease. Journal of molecular and cellular cardiology. 60, 27-35 (2013).
- Laforest, B., Andelfinger, G., Nemer, M. Loss of Gata5 in mice leads to bicuspid aortic valve. The Journal of clinical investigation. 121, 2876-2887 (2011).
- Hofmann, J. J., et al. Endothelial deletion of murine Jag1 leads to valve calcification and congenital heart defects associated with Alagille syndrome. Development. 139, 4449-4460 (2012).
- Wylie-Sears, J., Aikawa, E., Levine, R. A., Yang, J. H., Bischoff, J. Mitral valve endothelial cells with osteogenic differentiation potential. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 31, 598-607 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T.
- Butcher, J. T., Penrod, A. M., Garcia, A. J., Nerem, R. M. Unique morphology and focal adhesion development of valvular endothelial cells in static and fluid flow environments. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 24, 1429-1434 (2004).
- Cheung, W. Y., Young, E. W., Simmons, C. A. Techniques for isolating and purifying porcine aortic valve endothelial cells. The Journal of heart valve disease. 17, 674-681 (2008).
- Motoike, T., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28, 75-81 (2000).
- Peacock, J. D., Lu, Y., Koch, M., Kadler, K. E., Lincoln, J. Temporal and spatial expression of collagens during murine atrioventricular heart valve development and maintenance. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 3051-3058 (2008).
- Levay, A. K., et al. Scleraxis is required for cell lineage differentiation and extracellular matrix remodeling during murine heart valve formation in vivo. Circulation research. 103, 948-956 (2008).
- Lincoln, J., Alfieri, C. M., Yutzey, K. E. BMP and FGF regulatory pathways control cell lineage diversification of heart valve precursor cells. Developmental biology. 292, 292-302 (2006).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation research. 109, 183-192 (2011).
